Summary
呼吸不全は、子宮頸部脊髄損傷後の死亡の主要な原因である。部分的な頚椎損傷によって誘発される呼吸不全の、再現性の定量化、および信頼性の前臨床動物モデルを持つことは、その後の呼吸器および非呼吸神経可塑性を理解するのに役立つと推定される補修戦略をテストすることができます。
Abstract
子宮頸部脊髄損傷は永久的な麻痺を誘導し、しばしば呼吸困難をもたらす。現在まで、効率的な治療薬は、高子宮頸部脊髄損傷（SCI）は、次の呼吸不全を改善/向上させるために開発されていない。ここでは、多様なポスト病変呼吸神経可塑性を研究するために、子宮頸部2（C2）メタメリックレベルの高い、SCIのマウス前臨床モデルを提案する。技術は、脳幹に位置して呼吸中枢からの横隔運動ニューロンの求心路遮断にダイヤフラムのhemiparalysisを誘発するC2レベルの外科部分の損傷、から構成されています。損傷の反対側はそのまま残り、動物の回復を可能にする。 （胸部と腰部のレベルで）運動機能に影響を与える他のSCIと異なり、呼吸機能は、動物のモチベーションを必要とせず、欠陥/回復の定量化が容易に（横隔膜と横隔膜神経記録を行うことができますS、全身換気）。この前臨床C2のSCIモデル（生理学、分子）の異なるレベルでの様々な呼吸器および非呼吸神経可塑性の事象を研究し、中に呼吸が向上する可能性があり、多様な推定の治療戦略をテストするために、強力で便利、そして信頼性の前臨床モデルであるSCI患者。
Introduction
脊髄損傷は、永久的な麻痺などの劇的な発生率とのヒト集団において観察された一般的な傷害である。しかし、損傷の重症度は、最初の外傷の程度と範囲に依存します。呼吸不全は、上部頸椎脊髄損傷（SCI）1以下の死亡率の主な原因である。現在、唯一の治療的処置は、換気補助の下に患者を配置することです。少数の患者は、後の病変の遅延で発生する自然回復による換気支援2をオフに離乳することができるので、新しい革新的な非侵襲的な治療薬を開発する必要性が緊急3である。 、推定治療戦略の適用を研究し、そのため呼吸不全に対する子宮頸SCIの効果を調査してもいい標準化された前臨床モデルを持つことは不可欠です。
この技術的な記事では、特定の前臨床マウスモデルOを記述C2レベルでの部分的な子宮頸SCIによって誘導されたF呼吸障害。このモデルは、現在、（：4月13日のレビューのために）、世界中のいくつかの研究室で使用されます。しかし、外科的処置のわずかな差は、この特定の子宮頸部損傷のマウスモデルを生成する別の研究者の間で観察することができる。呼吸器の出力にC2 SCIの効果は、第ポーター14によって1895年に記載された。子宮頸片側切断サイレント横隔神経活動とその後のダイヤフラムの麻痺につながる、損傷の同側（脳幹にrVRGにあり、 図1（a））、その中央のドライブから横隔運動ニューロンの求心路遮断を誘導する。反対側はそのまま残り、動物が生き残ることができます。下脊髄分節（C4レベル15で例えば挫傷の傷害）に位置する異なるSCIとは異なり、両方の側で横隔運動ニューロン核の完全性が維持されます。 CERVの後iCalのC2の損傷、いくつかの自発的な活動は、分節レベルC3〜C6（クロス横隔経路、CPP、 図1B）で、脊髄正中線を越えて反対側のサイレントシナプス経路の活性化を（横隔膜と横隔膜）同側で観測することができます。定義上、あるCPPの活性化、同側の部分横隔膜神経の回復を誘導対側横隔神経切断術と組み合わせたC2片側切断は、時間から数週間の損傷後16〜18を発生することがあります。呼吸の回復でこのCPP経路の本当の有益な効果は19制限されており、さらなる調査と治療は、自発的な回復3の大きさを改善するために開発されるべきである。
このプロトコルは、（前と横隔運動ニューロン、介在ニューロン、分子·蜂巣から呼吸生理学、様々なレベルでの呼吸ポスト病変可塑性を研究するための前臨床マウスモデルの強力なタイプが用意されていますR、例えば前肢）の運動だけでなく、C2は、部分的頸髄損傷後の呼吸器および運動回復を改善することを目的とした侵襲的·非侵襲的な治療戦略をテストするためのモデル。
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Protocol
このプロトコルは、優秀（パリシュッド、グラント契約番号246556の大学）と大学·ド·ベルサイユサンカンタン·アン·イヴリーヌのRBUCEアップ椅子の倫理委員会によって承認された。
滅菌手術器具の1。準備
- 実験室の洗剤で手術器具を清掃してください。
- 手術前に楽器をオートクレーブ。
- 外科セッションでは、2の手術の間、180℃で10分間ホットビーズ滅菌器でのヒントを配置することでツールを殺菌。
医薬品の2。準備
- 前麻酔薬カクテルや術後の薬のために2×1ミリリットル注射器を準備します。
- カルプロフェン（5 mg / kg）を、ブプレノルフィン（50μgの/ kg）を、バイトリル（5 mg / kg）をし、デクスメデトミジン（0.5 mg / kg）をラットの体重に応じて、事前に麻酔薬を注射器を準備します。乳酸リンゲル液に1ミリリットルにボリュームを完了します。
- 中準備別のシリンジプレ麻酔薬の逆転：アチパメゾール（500μgの/キロ）。
ラットの3。麻酔
- 動物にステップ2.2で説明した前の麻酔薬の溶液を皮下投与する。その後、戻ってケージに動物を入れて、鎮静効果が表示されるまで待ちます。
- 100％のO 2、5％イソフルランでいっぱいにクローズ室にラットを置き、呼吸リズムが（30秒程度）遅くなるまで待ちます。その後、チャンバーからラットを削除し、挿管のテーブルの上に置きます。
4。経口気管内挿管
- テーブルに彼の前歯に付属のストラップを配置することにより、ヘッドを固定した後、彼の背中に動物に存在する。
- 光ファイバの光で、胸部のスペースを照らす。その後、動物の口の中に喉頭鏡（または1をカスタムメイド、詳細は城之内ら 20）を配置します。声帯を視覚化する。
- SLIDEと（声帯の間）気管内に経口気管ガイドを配置。ガイドに経口気管内チューブ（16gのカテーテルサイズ）をスライドさせます。
- ガイドを削除して、水分の存在のために経口気管内チューブの端部に配置され、喉頭鏡で確認し、気管内ではなく食道にチューブの適切な位置を確認した。
- （683齧歯類人工呼吸器、ハーバード装置）げっ歯類の人工呼吸器にチューブを接続し、（100％のO 2）で2％イソフルランの濃度を調整します。
- サージカルテープで経口気管内チューブを固定します。
5。脊椎手術
- 外科医に90°の角度を指して鼻で、加熱された手術用プレート上腹臥位の位置に動物を配置します。手術全体で37.5℃付近体温を維持。
- 肩甲骨の間にバリカンで毛を剃るとガーゼで髪を削除します。
- それから7で、ベタジンで肌をきれいに0％アルコール。このステップ3回繰り返します。
- つま先のピンチは、適切な麻酔深度を確保するために、手術の開始前に行われる。 すると、肩甲骨の間にはさみで横方向の皮膚切開の吻側尾側を実行します。
- 出血を防ぐために、腱に従うことによってacromiotrapezius筋吻側尾側をカットします。その後、脊髄筋（脊椎骨の周囲）にアクセスするための菱形筋を解離する。
- C3は椎骨にC1から脊髄の筋肉を撤回。 C2は椎骨は、著名な骨端を有するものである。
- 無菌綿棒を使って、椎骨の背側部分の周りの筋肉を清掃してください。
- 骨鉗子で慎重にC2の骨端を除去して起動します。背側脊髄が露出するまで、細心の注意を払って継続する。椎弓切除術は、背側半椎弓切除術であることを確認してください。脊髄を囲む硬膜、この領域の近傍の動脈に細心の注意を払う。
- ＃55ピンセットで、ROSを解剖TRO-尾C2方向硬膜は、次の各吻側および尾側に横方向に続けています。
- 脳脊髄液をスポンジ。
- microscissorsと頸椎後根番号2の下の横方向のセクションを作る。病変の程度は（傷害の背側については、図2（a）参照 ）、脊髄の正中線に到達するのに十分近いことをマイクロメスで確認してください。そうでない場合には、別のカットが損傷を完了するために行うことができる。出血の場合には、滅菌した綿棒を使用しています。それ以外の場合は、動物が怪我から回復せず、呼吸不全を持って、反対側に行かないように注意してください。
- 保護層としての筋肉を縫合し、皮膚を縫合バック。ベタジン飽和滅菌ガーゼで傷口をきれいにします。
- イソフルラン気化器をオフにして、反転薬（アチパメゾール[500μgの/ kgで、IM]）を注入し、体温をチェックしてください。
- 動物は、人工呼吸器に対して息をし始めると、人工呼吸器から気管チューブを切断した後、経口気管内チューブを取り外します。回復のために加熱されたケージに動物を配置します。
6。手術後のケア
手術後、動物を回復するために可能な限り最高の環境を確保するために継続的に監視される。抗生物質（バイトリル、5 mg / kg）を、抗炎症（カルプロフェン、5ミリグラム/ kg）およびブプレノルフィン（50μgの/ kg）の薬物が感染を防止し、発生を低減する最初の2日間、12時間ごとに、手術後に与えられている手術後の痛みの。ラットは、（第一術後一日またはゼリー状水）ソフト食料と水へのアクセスを自由に摂取しています。皮下流体は、最初のいくつかの術後の日に脱水を予防するために用いることができる。体重および食物摂取量を毎日モニターする。その環境は、実験と時間、損傷後（デュアル住宅、ケージ内チューブ）を通じて濃縮されている。
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Representative Results
傷害の程度
成功と、この特定の実験モデルの再現性は、各マニピュレータ/外科医の経験に依存している。 C2は損傷後の呼吸の回復（横隔神経活動と横隔膜活性）のその後の量は、残りの腹と相関している白質21を免れる。怪我が「手作り」で、外科医からのいくつかの練習を必要とするので、それぞれのけがの程度は正確なサイズを決定するために、組織学的技術（ホルムアルデヒドで組織の固定4％、凍結組織スライス、クレシルバイオレット染色）によって確認されなければならないの損傷を受けた組織（ 図2B）。
電気生理学的記録
C2はSCI後、同側の横隔神経活動が廃止された（ 図3A、Vinitのら 17を参照してください。方法論）。反対横隔神経活性は、損傷により影響を受けた動物の生存率（ 図3B）を可能にしていない。 7日後、損傷、わずかな活性は、主に、反対側（ 図3Aおよび3B）から正中線を越えCPPに、いくつかの動物の同側に記録することができる。同様の結果は、7日間同側（ 図3C）は、損傷後にわずかな活性を有する、ダイヤフラム活性（ 図3Cおよび3D）で観察することができる。この活性は、損傷後の時間にわたって強化されている（図示せず）を数ヶ月後にすべての動物で観察することができる。
図1。ラットの呼吸器解剖の模式図。振動板にその軸索を投射rVRG（脳幹）に位置して横隔事前運動ニューロンと横隔核からC6（C3）に位置して横隔運動ニューロン、メイン吸気組織のA）の側面図。B）は概略背呼吸下行経路上のC2の部分的な損傷の影響を考慮。横隔核分節レベルで正中線を横切る反対側から渡っ横隔膜の経路が存在することに注意してください。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。ラットのC2の部分的な損傷の写真。手術部位のA）の背側の画像。矢印はINJのサイトを示していますユリィ。 C2の椎骨（背部）が存在しないことに注意してください。脊髄（左写真）の横断面からのC2損傷（写真右、灰色の程度）の程度B）再建。スケールバー：千程度拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。呼吸器の出力上のC2損傷の生理学的効果。 A）Cの部分的な損傷は同側で横隔神経活動を廃止。原因交差横隔経路（CPP）に7日間、損傷後に同側の横隔神経活動の部分的な回復に注意してください。B）C2損傷はすぐに反対側の横隔神経活動に影響を与えませんそして7日後に負傷。℃）でのC2の部分的な損傷は同側横隔膜の活動を廃止。若干の活動は、主にCPP活性のために、7日後の傷害に表示されます。同側に観測される信号のリズム偏向は、心電図の人工記録に起因している。D）C2損傷後、反対側のダイヤフラム活動が負傷前と同じままで、動物が生き残ることができます。 するには、ここをクリックしてください拡大表示する。
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Discussion
C2は傷害モデルを作る技術的な問題
C2の損傷のマウスモデルでは、呼吸器、ポスト病変神経可塑性を研究するための興味深いツールです。しかし、再現性と信頼性の高いモデルを作成するために必要な手順が多数あり、それぞれが研究の結果に影響を与える可能性がある。たとえば、挿管過程で細心の注意を経口気管内チューブが怪我自体に起因する初期の呼吸不全に加えて、このような閉塞性呼吸器障害などの多様な合併症を引き起こすことができ、気管の炎症を生成することができますので、取られる。また、手術の手順中の脊髄へのアクセスは、動物の回復のために重要である可能性があります。すべてのステップ（筋肉の解剖/後退、背側椎弓切除術、硬膜切除、傷害自体が）は、手術部位の周囲や脊髄への多様な動脈が存在するために細心の注意を払って実行しなければならないコード。大規模な出血は手術後の回復が失血によって妨害することができ、脊髄虚血傷害に加え、発生する可能性があるため、避けなければならない。
注意すべきもう一つの重要な部分は、楽器の清潔さと手術が行われた部屋です。抗生物質は、「擬似無菌」条件は、手術中に使用された約動物と細心の注意に注入されているという事実にもかかわらず、細菌感染が発生し、全体の調査はこのモデルに対して実行される予定影響を及ぼす可能性があります。例えば、リポ多糖注射によって誘発全身性炎症、呼吸神経可塑性22を廃止し、その後の自発的な神経可塑性または推定回復戦略の効果に影響を与え、および/ または非表示にしなかった。この手順全体を通して体温の監視はまた、この実験モデルを作製するの成功に関与し得る。確かに、低体温のように機能することができ急性脊髄損傷のためeuroprotectantといくつかの有益な効果（アフマドらを参照してください。レビューのために23）を誘導することができます。
マウスモデルでの子宮頸2節では、ハンディキャップ（運動）の期間の大幅なモデルです。これは、動物が麻痺し、食物および水に到達するためにいくつかの困難を経験するという事実による損傷の1週間後の体重減少を観察することが一般的である。適切なヘルプは、体重減少が最初の体重（手差し）の約20％であることを保証するために、術後のオペレータによって行われる。したがって、モデルのエンドポイントは、週の最初の体重の30％の量の減少である。約1週間の手術後、動物は徐々に彼ら自身を養うと重量を取り戻す（運動回復研究のためにラヴェット·バーら 24参照 ）する機能をできるように部分的な運動を回復。
試験終了時、C2損傷」はヘクタールであるので、外科医によるndmade」は、モデルの再現性および信頼性のために、それぞれの損傷の程度は、組織学的技術によって再構築されなければならない。特に、呼吸器、神経可塑性が検討されている場合、フラーら 21は、C2損傷後の呼吸の回復量が残っている免れる腹側白質と相関していたことを示した。
呼吸ポスト病変神経可塑性を研究するためのC2損傷のラットモデルを使用する利点
呼吸不全を回復/改善するためのポスト病変呼吸生理学および/または推定の戦略を研究するためのC2のマウスモデルは、以来、多くの利点を提供する：1）ラットは、世界中の商業ブリーダーから容易に入手可能である。 2）サイズが小さいため、短い寿命のため、環境条件を注意深く監視することができ、厳密に誕生から成人期に制御; 3）ラットは、最高のモデルOとなっているより伝統的なモデル、猫を交換F呼吸器、神経生物学、。したがって、広範なデータは実験結果を実行し、解釈するコンテキストを提供し、ラットの神経解剖学、神経化学、神経生理学およびフレックス換気応答に関する文献で利用できます。 4）市販のラット系統のうち、（比較的）低い遺伝的異質性は、統計的検出力を達成するために必要な動物の数の減少を可能にし、異なる実験室間の結果の比較を容易にする; 5）ラットは、統計的検出力に必要な動物の数を減少させる頚髄損傷後の非常に低い死亡率を有し; 6）ラットは、子宮頸部脊髄損傷（例えば、対ネコ、イヌまたは霊長類）は、次の非常に急速な運動回復率を有する。従って、ラットの使用は、動物（ 例えば 、膀胱発現、流体投与）、手術後の集中治療を必要とする時間の長さを減少させ、分動物被験体の苦痛をimizes; 7）運動機能とは異なり、呼吸機能は、動物のモチベーションを必要とし、（横隔膜筋電図、横隔膜神経ENG、一回換気量および頻度）を簡単に定量化されていません。 8）1重要な側面は、「交差横隔現象」（CPP）である。この特定のトピックでは、（。レビュー用Goshgarian ら 5,16参照 ）モデルとしてラットを用いた大規模な公開された文献がある。 9）ラットとヒト、ラット子宮頸SCI12次の呼吸不全を研究するための優れた前臨床モデルにする彼らの呼吸器制御システム、多くの共通の特徴を共有しています。また、1研究室では正常にマウスモデル25上のC2片側切断の開発を開始しました。このアプローチは、トランスジェニック動物の将来の使用についての熱意を提供しています。
より臨床的に関連する動物モデルは、子宮頸レベル26〜28での挫傷の傷害です。しかし、損傷の再現性があるincons主に下行呼吸経路の位置と（大幅に動物の生存率が低下します）豊富な挫傷を行うには不可能にistent、。より多くの仕事は、恒久的な赤字と挫傷の傷害を誘導するための適切な方法を決定するために、挫傷モデルの精緻化に行う必要があります。
C2は傷害マウスモデルのために使用しています
このC2 SCIモデルでは、可塑性の様々な種類の研究のために特に適切である。例えば、分子や細胞脳幹に位置して負傷した特定され、事前運動ニューロン（rVRG核）からの変更29だけでなく、求心路遮断横隔運動ニューロンは、30〜32が検討されているレベルです。その後の炎症プロセス33と細胞構築の変化（ニューロン周囲のネットの変化10）は 、C2 SCI後に研究されている。脊髄の構造変化（代替PAの意味絞りモータのエンドプレート4でthways 34および脊髄介在ニューロン8の関与）や超微細構造の変化にも積極C2はSCI後の呼吸活動の自発的な回復に参加しています。 C2は、SCIモデルの最も研究トピックでは、全体の呼吸器系（一回換気量、非麻酔した動物24での周波数）での最初の損傷の生理学的結果であり、麻酔の準備へのその後の自然回復は（横隔神経活動17、すなわち 、ダイヤフラムもっと最近の活動16,17と、肋間活動35）。このC2は、SCIのマウスモデルは、後肢障害とその後の自然回復を研究するために使用し、非侵襲的戦略（間欠hypoxias 24）後の回復を誘発してきた。
結論
C2は、SCIマウスモデルは、強力なAです呼吸器および非呼吸神経可塑性を研究し、SCI患者の呼吸を改善することが推定される多様な治療戦略をテストするためにND便利な前臨床モデル。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、フランスの公共投資委員会によって割り当てられたグラント契約番号246556（欧州プロジェクトRBUCE-UP）、HandiMedExの下で、欧州連合（EU）セブンス·フレームワーク·プログラム（FP7/2007-2013）からの資金によってサポートされています。マルセルBonayはサンテRespiratoire、およびセンター - 援助Respiratoireà法人住所D'イル=ド=フランス（CARDIF）JPフォン·ド·寄託金ルシェルシュ、Chancellerie DESUniversités·ド·パリ（脚POIX）によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| Male Sprague Dawley Rat | Janvier | 225-250 g | |
| Surgical Instruments | |||
| Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tool | 91150-20 | |
| Student Standard Pattern Forceps | Fine Science Tool | 91100-12 | |
| Mayo-Stille Scissors | Fine Science Tool | 14013-15 | Curved |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tool | 91500-09 | Straight |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tool | 15025-10 | Straight Blunt/Blunt |
| Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tool | 16121-14 | Curved |
| Dissecting Knife - Fine Tip | Fine Science Tool | 10055-12 | Straight |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tool | 12002-14 | Serrated |
| Weitlaner-Locktite Retractor | Fine Science Tool | 17012-11 | 2x3 Blunt |
| Absorbable surgical sutures | Centravet | BYO001 | Suture size 4-0 |
| Equipment | |||
| Hot Bead Steriliser | Fine Science Tool | 18000-45 | |
| Catheter | Centravet | CAT188 | 16 G |
| Laryngoscope | |||
| Guide wire | |||
| Laryngeal mirror | Centravet | MIR011 | |
| Lactated Ringers | Centravet | RIN020 | |
| Syringe | Centravet | ||
| Needle | Centravet | ||
| O2 | Air Liquid | I1001M20R2A001 | |
| 683 RodentT Ventilator 115/230V | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
| Stand-Alone Vaporizer | WPI | EZ-155 | |
| Thin line heated bed | WPI | EZ-211 | |
| Air canister | WPI | EZ-258 | |
| Drugs | |||
| Carprofen | Centravet | ||
| Rimadyl | Centravet | RIM011 | |
| Buprenorphine | Centravet | BUP001 | |
| Baytril | Centravet | BAY001 | |
| Dexmedetomidine | Centravet | DEX010 | |
| Atipamezole | Centravet | ANT201 | |
| Betadine solution | Centravet | VET002 | |
| Isoflurane | Centravet | VET066 | |
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