Summary
Neuronal झिल्ली तस्करी को गतिशील प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की उपलब्धता और काफी प्रभाव डालता है neurotransmission नियंत्रित करता है. तिथि करने के लिए, यह वयस्क न्यूरॉन्स में neuronal endocytic तस्करी को मापने के लिए चुनौती रहा है. यहाँ, हम तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति पूर्व vivo में तेजी से बदलाव को मापने के लिए एक अत्यधिक प्रभावी, मात्रात्मक विधि का वर्णन.
Abstract
नियमित endocytic तस्करी गतिशील रूप से एक मिनट के समय के पैमाने पर रिसेप्टर, आयन चैनल, और ट्रांसपोर्टर कोशिका की सतह प्रस्तुति को नियंत्रित करके, neuromodulatory घटनाओं की एक किस्म की सुविधा केंद्रीय तंत्र है. व्यक्ति प्रोटीन की endocytic तस्करी कि नियंत्रण तंत्र की एक व्यापक विविधता है. तस्करी के आणविक आधार की जांच के अध्ययन मुख्य रूप से मात्रात्मक एक्सोजेनस उत्तेजनाओं और जीन में गड़बड़ी के जवाब में झिल्ली प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन को मापने के लिए सतह biotinylation पर भरोसा किया है. हालांकि, इस दृष्टिकोण को मुख्य रूप से ईमानदारी से वयस्क न्यूरॉन्स में खेलने पर physiologically प्रासंगिक तंत्र शामिल न हों जो सभ्य कोशिकाओं तक ही सीमित कर दिया गया है. इसके अलावा, सुसंस्कृत सेल दृष्टिकोण तस्करी तंत्र में क्षेत्र विशेष के मतभेदों को नजरअंदाज कर सकते हैं. यहाँ, हम तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के लिए कोशिका की सतह biotinylation फैली कि एक दृष्टिकोण का वर्णन. हमइस विधि वयस्क न्यूरॉन्स में झिल्ली प्रोटीन सतह के स्तर में तेजी से बदलाव को मापने के लिए एक उच्च निष्ठा दृष्टिकोण प्रदान करता है कि प्रदर्शित करता है. यह दृष्टिकोण neuronal endocytic तस्करी के क्षेत्र में व्यापक उपयोगिता है की संभावना है.
Introduction
Endocytic तस्करी अभिन्न झिल्ली प्रोटीन की एक किस्म के प्लाज्मा झिल्ली प्रस्तुति ठीक धुनों कि एक सर्वव्यापी सेलुलर तंत्र है. Endocytosis intracellular परिवेश 1 के लिए महत्वपूर्ण पोषक तत्वों उद्धार और रिसेप्टर सक्रियण 2 के जवाब में रिसेप्टर संकेतन desensitizes. वापस प्लाज्मा झिल्ली रीसाइक्लिंग endocytic अतिरिक्त कोशिका की सतह 3 में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि से सेलुलर संकेत वृद्धि कर सकते हैं. इसके अलावा, झिल्ली तस्करी perturbations प्रोटीन endocytic तस्करी कि सरकार आणविक तंत्र की जांच करने की आवश्यकता पर बल देते हुए, कई रोग और रोग की स्थिति 4,5 में फंसा रहे हैं. कई प्रोटीन पिछले कई वर्षों से सबूत बढ़ते क्लासिक क्लैथ्रिन पर निर्भर internalization तंत्र का उपयोग करते समय कई क्लैथ्रिन स्वतंत्र endocytic तंत्र की एक बढ़ती हुई सरणी के endocytic संभावित है कि सरकार को दर्शाता हैप्रोटीन 6,7. इस प्रकार, शारीरिक प्रासंगिक प्रणालियों में तस्करी की सुविधा endocytic तंत्र की जांच करने की आवश्यकता काफी वृद्धि हुई है.
मस्तिष्क में रिसेप्टर्स, आयन चैनलों और neurotransmitter ट्रांसपोर्टरों की endocytic तस्करी synaptic plasticity 8-11 और अंततः neuronal excitability और synaptic प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करें 12-15 की दवाओं, के जवाब स्थापित करने में एक प्राथमिक भूमिका है. Neuronal तस्करी पढ़ाई के बहुमत heterologous अभिव्यक्ति सिस्टम या सुसंस्कृत प्राथमिक न्यूरॉन्स या तो पर भरोसा आज तक, न तो जिनमें से मज़बूती से वयस्क न्यूरॉन्स में खेलने पर तंत्र को प्रतिबिंबित कर सकते. यहाँ, हम मात्रात्मक वयस्क कृन्तकों से व्युत्पन्न तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में सतह प्रोटीन के स्तर को मापने के लिए सतह biotinylation का उपयोग करता है एक दृष्टिकोण है कि रिपोर्ट. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम माउस स्ट्रिआटल डोपामाइन ट्रांसपोर्टर तेजी से पुनः में internalizes कि दिखाना है कि आंकड़ों को पेशphorbol एस्टर की मध्यस्थता प्रोटीन kinase सी (पीकेसी) सक्रियण के लिए त्वरित कार्रवाई.
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Protocol
सभी जानवर से निपटने और ऊतक कटाई अनुमोदित प्रोटोकॉल # A1506 (Melikian, पीआई) के बाद, मैसाचुसेट्स मेडिकल स्कूल संस्थागत पशु की देखभाल उपयोग समिति के विश्वविद्यालय (IACUC) के दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था.
आवश्यक समाधान
कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) - ताजा दैनिक बनाएं
125 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 1.2 मिमी नाह 2 पीओ 4, 1.2 मिमी 2 MgCl, 2.4 मिमी 2 CaCl, 26 मिमी 3 NaHCO, और 11 मिमी ग्लूकोज
नोट: एक 10x शेयर समाधान के रूप में ACSF तैयार करें, 3 NaHCO और ग्लूकोज को छोड़कर. ताजा 3 NaHCO और ग्लूकोज के साथ सप्लीमेंट, 10x स्टॉक से दैनिक 1x काम कर समाधान करें.
सुक्रोज पूरक ACSF (SACSF) - ताजा दैनिक बनाएं
250 मिमी सफलता, 2.5 मिमी KCl, 1.2 मिमी नाह 2 पीओ 4, 1.2 मिमी 2 MgCl, 2.4 मिमी 2 CaCl, 26 मिमी 3 NaHCO, और 11 मिमी ग्लूकोज गुलाब
नोट: एक 10x शेयर समाधान के रूप में SACSF तैयार करें, 3 NaHCO और ग्लूकोज को छोड़कर. ताजा 3 NaHCO और ग्लूकोज के साथ सप्लीमेंट, 10x स्टॉक से दैनिक 1x काम कर समाधान करें.
Sulfo एन hydroxysuccinyl एसएस बायोटिन (sulfo एन एच एस-एस एस बायोटिन, पियर्स केमिकल कंपनी)
शेयर समाधान DMSO में 200 मिलीग्राम / एमएल हो सकता है और कई फ्रीज / पिघलना चक्र के लिए प्रतिरोधी रहे हैं चाहिए. Aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है succinyl एस्टर तेजी से जलीय घोल में hydrolyzed है, इसलिए काम कर समाधान की पूर्व स्लाइस को लागू करने के लिए तुरंत तैयार किया जाना चाहिए.
स्लाइस बुझाने समाधान
ACSF 100 मिमी ग्लाइसिन के साथ पूरक
RIPA Lysis Buffeआर
10 मिमी Tris, 7.4 पीएच, 150 मिमी NaCl, 1.0 मिमी EDTA, 1% ट्राइटन-X-100, 0.1% एसडीएस, 1% ना deoxycholate
Protease inhibitors के साथ RIPA (RIPA / पीआई) - ताजा दैनिक बनाएं
RIPA 1 माइक्रोन leupeptin, 1 माइक्रोन pepstatin, 1 माइक्रोन aprotinin, और 1 मिमी phenylmethyl Sulfonyl फ्लोराइड के साथ पूरक.
1. मस्तिष्क स्लाइसें की तैयारी
- ताजा 1x SACSF और 1x ACSF बनाओ
- एक छोटे बीकर में बर्फ पर SACSF शांत रहो. इस हौसले से काटा माउस मस्तिष्क पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- 95% / 5% 2 हे / सीओ 2, बर्फ पर 20 मिनट के साथ बुदबुदाती द्वारा ऑक्सीजन के साथ ACSF और SACSF तर.
- P30-38 चूहों इष्टतम ऊतक व्यवहार्यता के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. ग्रीवा अव्यवस्था और कत्ल के द्वारा पशुओं बलिदान, और तेजी से prechilled, ऑक्सीजन SACSF में दिमाग को हटा दें.
- एक हिल सूक्ष्म तक्षणी का प्रयोग, ब्याज के क्षेत्र में 300 माइक्रोन मस्तिष्क वर्गों करें.
- अगर वांछित, स्लाइस आगे विशेष रूप से मस्तिष्क क्षेत्रों या अलग सही और क्रमशः, नियंत्रण और प्रयोगात्मक स्लाइस के रूप में उपयोग करने के लिए छोड़ दिया गोलार्द्धों के लिए समृद्ध करने से पहले वसूली को विच्छेदित किया जा सकता है.
- एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का प्रयोग, 24 अच्छी तरह प्लेटें में सेट कक्षों तली जाल स्लाइस हस्तांतरण.
- स्लाइस नित्य, कोमल बुदबुदाती साथ, oxygenated ACSF में, 40 मिनट के लिए 31 डिग्री सेल्सियस ठीक करने के लिए अनुमति दें.
2. दवा इलाज (यदि उपयुक्त हो) और स्लाइस Biotinylation
- वसूली के बाद, prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस), ऑक्सीजन ACSF बुदबुदाती में लगातार 95% / 5% 2 हे / सीओ 2 के साथ स्लाइस 3X धो.
- परीक्षण यौगिकों जोड़ें और निरंतर oxygenation साथ सेते हैं.
- सुविधा के लिए, 10x केंद्रित दवा के एक 1/10 वें मात्रा जोड़ने के लिए, और धीरे inverting द्वारा मिश्रण.
- धीरे वांछित तापमान पर एक पानी के स्नान में प्लेटें हिलाएँ.
- के बाद दवा उपचार, तेजीबर्फ के ठंडे ACSF में 3x धोने से सर्द स्लाइस.
3. Biotinylate सतह प्रोटीन
- तुरंत पहले लेबलिंग करने के लिए बर्फ का ठंडा ACSF में तैयार करें 1.0 मिलीग्राम / एमएल sulfo एन एच एस-एस एस बायोटिन.
- स्लाइस को sulfo एन एच एस-एस एस बायोटिन 0.75 मिलीलीटर जोड़ें और बर्फ, 45 मिनट पर स्लाइस सेते हैं.
- बर्फ पर बर्फ का ठंडा ACSF में 10 मिनट के लिए सेते हैं तो, बर्फ के ठंडे ACSF के साथ जल्दी से स्लाइस तीन बार धोएं.
- बर्फ के ठंडे टुकड़ा बुझाना बफर के साथ स्लाइस तीन बार धोएं और फ्री sulfo एन एच एस-एस एस बायोटिन बुझाने के लिए 0.75 मिलीलीटर टुकड़ा बुझाना बफर के साथ बर्फ पर दो बार, 25 मिनट, सेते हैं.
4. ऊतक lysates की तैयारी
- बर्फ के ठंडे ACSF में स्लाइस तीन बार धोएं और एक आग पॉलिश पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब के लिए प्रत्येक टुकड़ा हस्तांतरण.
- धीरे 200 XG, 1 मिनट और ध्यान से महाप्राण शेष ACSF centrifuging द्वारा टुकड़ा गोली.
- 400 μl बर्फ ठंड RIPA / पीआई जोड़ें और ऊपर pipetting द्वारा ऊतकों को तोड़ने और नीचे एक बार एक P200 रंज के माध्यम सेette.
- स्थानांतरण एक ताजा ट्यूब टुकड़ा / RIPA अलग और सेल को पूरा करने के लिए, घूर्णन, 30 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस सेते हैं.
- Centrifuging द्वारा सेलुलर मलबे गोली, 18,000 XG, 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस
- एक मानक के रूप में गोजातीय सीरम albumin (BSA) के साथ बीसीए प्रोटीन परख, का उपयोग lysate प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करते हैं.
5. Biotinylated प्रोटीन को अलग
- मनका / कुल प्रोटीन अनुपात का अनुकूलन.
नोट: व्यक्ति प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में व्यापक रूप से भिन्न हो सकती हैं. ऊतक lysate की दी गई राशि में biotinylated प्रोटीन के सभी कब्जा कर लिया है, जब तक यह सही सतह अभिव्यक्ति में किसी भी संभावित परिवर्तन का पता लगाने के लिए संभव नहीं है. इसलिए, यह अनुभव से पहले एक नया टुकड़ा biotinylation अध्ययन पर तैयार करने के लिए एक विशेष प्रोटीन / मस्तिष्क क्षेत्र के लिए इष्टतम मनका / कुल प्रोटीन अनुपात निर्धारित करने के लिए आवश्यक है.- बढ़ती हुई राशि के साथ 25 μl streptavidin agarose मोती सेते, धोने और क्षालन कदम बाइंडिंग के लिए नीचे वर्णित के रूप में तो ऊतक lysate (लगभग रेंज 25-200 ग्राम), और के लिए आगे बढ़ें.
- परिणामस्वरूप immunoreactive बैंड यों और है कि वृद्धि या प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति की कमी हुई तो की सही मात्रा का ठहराव होगा परमिट बंधन के रेखीय श्रृंखला में एक मनका / lysate अनुपात का चयन करें.
- Streptavidin-agarose मोती तैयार करें
- सभी नमूनों के लिए आवश्यक कुल मनका मात्रा का निर्धारण. 25 μl / नमूना = 100 μl मोती + एक अतिरिक्त = 125 μl मोती पर एक उस राशि के लिए पर्याप्त मनका मात्रा प्लस एक अतिरिक्त (यानी 4 नमूने तैयार करते हैं.
- भंवर Streptavidin मनका शेयर और पिपेट बाहर मात्रा वांछित. एक P200 पिपेट का उपयोग करते हैं, रुकावट या मनका क्षति को रोकने के लिए टिप के अंत काट दिया.
- कमरे आपा पर, 18,000 XG, 1 मिनट centrifuging द्वारा संरक्षक, प्रत्येक RIPA इसके बाद vortexing और washes के बीच एकत्रित मोती निकालने के लिए 0.5-1.0 मिलीग्राम RIPA / पीआई में मोती 3 बार धोएंature.
- एक वैक्यूम फ्लास्क से जुड़ी एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग washes के बीच बफर बंद aspirate. Aspirating जब कांच पाश्चर विंदुक के अंत से जुड़ी प्लास्टिक P200 टिप बेहतर नियंत्रण प्रदान करता है. यह पिपेट में aspirating मोती जोखिम के रूप में यह पहली दो washes के लिए पूरी तरह से सभी बफर दूर करने के लिए आवश्यक नहीं है. अंतिम धोने के बाद, मोती aspirating बिना जितना संभव अतिरिक्त बफर हटा दें.
- और resuspend के लिए ऊपर और नीचे pipetting, वापस अपने मूल मात्रा को मोती लाने के लिए RIPA / पीआई जोड़ें. मोती ट्यूब दीवार से चिपके रहते हैं, के रूप में इस बिंदु पर vortexing से बचें.
- टिप के साथ एक P200 उपयोग कर microcentrifuge ट्यूबों में विभाज्य मोती काट दिया. मोती समान रूप से निलंबित कर दिया और ट्यूब में फ़ैली हुई रहना आश्वस्त करने के लिए नीचे नमूने के बीच कई बार पिपेट और.
- मोती streptavidin को बाँध biotinylated प्रोटीन
- Agarose मोती युक्त ट्यूबों के लिए सेल lysates बांटो. प्रयोगों के लिए whe कई नमूनों की तुलना में किया जा रहा है फिर से, सही तुलना के लिए प्रत्येक नमूने के लिए प्रोटीन का एक ही राशि का उपयोग सुनिश्चित करें.
- एक 200 μl न्यूनतम मात्रा के लिए नमूने के लिए लाने के लिए अतिरिक्त RIPA / पीआई जोड़ें. इस नमूने ऊष्मायन के दौरान पर्याप्त रूप से मिश्रण और भी नमूने भर में प्रोटीन सांद्रता जोड़ता जाएगा कि आश्वासन दिया.
- एक ट्यूब रोटेटर में ट्यूबों की जगह और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात मिश्रण
- अलग ट्यूबों में, प्रत्येक नमूना के लिए इस्तेमाल कुल lysate मात्रा के एक बराबर बांटना. नमूना संस्करणों उच्च रहे हैं, तो वैकल्पिक रूप से, कुल lysate मात्रा का एक अंश एसडीएस पृष्ठ जैल पर अधिक से अधिक भार मात्रा में समायोजित करने के लिए, बजाय सुरक्षित किया जा सकता है. ये कुल प्रोटीन राशि के लिए सतह अभिव्यक्ति मानक के अनुसार करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- एक बराबर 2x की मात्रा या 6x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर के 1/5 मात्रा और या तो नमूनों का विश्लेषण कर रहे हैं जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर मनका नमूने, या दुकान के साथ समानांतर में 4 डिग्री सेल्सियस, पर सेते हैं या तो जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर, 18,000 XG, 2 मिनट centrifuging द्वारा मोती गोली.
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate और धोने मोती 0.75 मिलीलीटर RIPA के साथ तीन बार. मनका नुकसान को कम करने के लिए, washes के बीच मोती ऊपर बफर के एक छोटे से सिर मात्रा छोड़ दें. अंतिम धोने के बाद, मनका गोली में खलल न डालें बिना, जितना संभव हो उतना RIPA हटा दें.
- डाइसल्फ़ाइड कड़ी को कम करने से streptavidin मोती से biotinylated प्रोटीन Elute. नमूना बफर, भंवर अच्छी तरह से कम करने के 25 μl 2x एसडीएस पृष्ठ जोड़ें और नमूने 30 मिनट, कमरे के तापमान को घुमाएगी.
नोट: कई झिल्ली प्रोटीन गंभीर रूप से उनके electrophoretic गतिशीलता आई., एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर में उबला हुआ जब कुल करने के लिए एक उच्च प्रवृत्ति है. इस जांच की जा रही प्रोटीन के लिए मामला है, हीटिंग के नमूने से बचने और, बजाय, कमरे के तापमान पर धीरे धीरे elute. उबलते (समानांतर में मूल्यांकन एक और प्रोटीन उबलते की आवश्यकता है अगर उदाहरण के लिए) बिल्कुल जरूरी है, कॉम्पैक्टई बफर एकत्रीकरण को कम से कम 2 एम यूरिया (अंतिम एकाग्रता) के साथ पूरक हो सकता है. कुछ मामलों में एकत्रीकरण को कम करने में प्रभावी है, जबकि यूरिया अक्सर बैंड दिखावे समझौता. - Immunoblot से नमूनों का विश्लेषण करें.
- कुल lysate नमूने पिघलना और मनका के नमूने, 30 मिनट, कमरे के तापमान के साथ समानांतर में बारी बारी से.
- एसडीएस पृष्ठ जैल पर अलग प्रोटीन.
- Immunoblotting द्वारा ब्याज की प्रोटीन (ओं) को पहचानें.
- बैंड उचित मात्रा का ठहराव के लिए पता लगाने के रैखिक सीमा में पता चला रहे हैं कि कुछ किया जाना है.
- Biotinylation अभिकर्मक क्षतिग्रस्त / छेड़छाड़ की कोशिकाओं के माध्यम से intracellular प्रोटीन के लिए पहुँच प्राप्त नहीं हुआ है कि आश्वासन देता हूं. यह सबसे अच्छा जांच की जा रही सेल प्रकार के विशिष्ट एक intracellular प्रोटीन के लिए समानांतर में immunoblotting द्वारा पूरा किया है.
- बैंड घनत्व यों और कुल प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का एक प्रतिशत के रूप में रिश्तेदार प्रोटीन सतह घनत्व की गणना.
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Representative Results
neuronal डोपामाइन ट्रांसपोर्टर सेल लाइनों 16-20 में PKC सक्रियण के जवाब में भली भाँति है. सेल लाइनों और अभिव्यक्ति प्रणालियों की एक किस्म में पीकेसी प्रेरित डैट सतह नुकसान का प्रदर्शन कई रिपोर्टों के बावजूद, यह सुसंस्कृत डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स 21-23 में इस खोज की पुष्टि करने के लिए चुनौती रहा है. हम सीधे डैट वयस्क डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में PKC सक्रियण के जवाब में internalizes परीक्षण है कि क्या माउस स्ट्रिआटल स्लाइस इस्तेमाल किया. टुकड़ा तैयारी के बाद, स्लाइस समान विमानों से midline और स्लाइस के साथ hemisected गया 37 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 1 माइक्रोन phorbol myristate-13 एसीटेट (पीएमए) ± इलाज किया गया स्लाइस तेजी से ठंडा कर रहे थे और सतह प्रोटीन biotinylated और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में अलग थे. Immunoblots डैट के लिए जांच की, और भी tyrosine hydroxylase (HI) के लिए गए थे, समानांतर में, biotinylation अभिकर्मक डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में किसी भी intracellular पहुँच प्राप्त की है कि क्या उपाय करने के लिए. के रूप में देखाचित्रा 1 (शीर्ष), हम कोशिका की सतह पर कुल डैट के 81.4 ± 5.8% के साथ, बेसल (वाहन का इलाज) की शर्तों के तहत माउस striatum में मजबूत डैट सतह अभिव्यक्ति का पता चला. 1 माइक्रोन पीएमए, 30 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस के साथ PKC सक्रियण काफी प्लाज्मा झिल्ली से डैट के 30% नुकसान ~ से मेल खाती है जो 60.8 ± 5.2% कुल डैट, को डैट सतह अभिव्यक्ति की कमी हुई. इसके विपरीत, कुल वीं के केवल 1.6 ± 0.4% इसके intracellular स्थानीयकरण और biotinylation अभिकर्मक डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स सेल इंटीरियर से बाहर रखा गया था कि इस बात की पुष्टि के साथ संगत (चित्रा 1, नीचे), biotinylated किया गया था.
चित्रा 1. एक्यूट PKC सक्रियण वयस्क स्ट्रिआटल न्यूरॉन्स में डोपामाइन ट्रांसपोर्टर सतह का स्तर कम हो जाती है. माउस Striatal स्लाइस बायोटिनylation. एक्यूट माउस स्ट्रिआटल स्लाइस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में तैयार किया गया और ± 1 माइक्रोन पीएमए, 30 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस इलाज किया गया सतह प्रोटीन covalently बायोटिन को युग्मित किया गया और बैच streptavidin क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग थे. नमूने चूहा विरोधी डैट और माउस विरोधी वें एंटीबॉडी के साथ एसडीएस पृष्ठ और immunoblotting कराना पड़ा. Immunoreactive बैंड nonsaturating बैंड से एक VersaDoc सीसीडी कैमरा इमेजिंग स्टेशन और घनत्व के साथ कब्जा कर लिया गया मात्रा में एक सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा गया. ऊपर: संकेत उपचार के बाद biotinylated और कुल डैट और वें प्रदर्शित प्रतिनिधि immunoblot. नीचे: औसत आंकड़े. Biotinylated प्रोटीन संकेत% कुल नियंत्रण से काफी अलग SEM * ± प्रोटीन, छात्र टी परीक्षण, पी <0.03, एन = 6 रूप में व्यक्त किया.
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Discussion
मस्तिष्क में गंभीर रूप से प्रभाव डालता है synaptic संकेतन endocytic तस्करी, यह मात्रात्मक वयस्क न्यूरॉन्स में प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन को मापने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित कर दिया है कि लम्बे समय से जानकारी होने के बावजूद. इस काम में, हम तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में सतह प्रोटीन पूर्व vivo लेबल करने के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण की रिपोर्ट. वे synaptic कनेक्शन और उनकी तैयारी के बाद घंटे के लिए सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के रूप में मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी, electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए उपयोगिता का एक पुराना इतिहास है. इसके अलावा, टुकड़ा करने की क्रिया रणनीतियों ब्याज के मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों के बीच विशिष्ट synaptic कनेक्शन की रक्षा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
मस्तिष्क व्युत्पन्न तैयारी में neuronal प्रोटीन की तस्करी की जांच पहले काम की ज्यादातर मुख्य रूप synaptosomes और प्राथमिक सभ्य न्यूरॉन्स पर निर्भर करती है. तीव्र टुकड़ा biotinylation दृष्टिकोण विधि वीं के दोनों पर कई फायदे भी हैंप्रति घंटा: synaptosomes शारीरिक रूप से अक्षतंतु से हटा रहे हैं और ईमानदारी से बरकरार neuronal प्रोटीन की तस्करी पुनरावृत्ति करना आवश्यक आणविक कारकों में नहीं हो सकता. इसके अतिरिक्त, synaptosomal तैयारी अक्सर प्रयोगात्मक परिणाम तिरछा हो सकता है कि झिल्ली टुकड़े के साथ दूषित कर रहे हैं. प्राथमिक neuronal संस्कृतियों आम तौर पर उचित सेल विशिष्ट तस्करी तंत्र व्यक्त उनके परिपक्व neuronal phenotypes में भेदभाव नहीं हो सकता है कि developmentally अपरिपक्व न्यूरॉन्स से निकाली गई है. इसके विपरीत, तीव्र स्लाइस सेल व्यवहार्यता के उच्च स्तर दिखा और वयस्क जानवरों से निकाली गई है. इसके अलावा, सतह की तस्करी ऐसे जीन वितरण / पछाड़ना, optogenetic neuronal उत्तेजना / निषेध, या विवो दवा उपचार या व्यवहार रूपांतरों में निम्नलिखित के रूप में इन विवो आणविक जोड़तोड़, निम्न तुलना की जा सकती.
कई फायदे पूर्व vivo के लिए हालांकि वहांदृष्टिकोण जूँ, कई सीमाएं भी हैं. एक्यूट (noncultured) मस्तिष्क स्लाइस सीमित व्यवहार्यता है और इसलिए पुरानी दवा उपचार के लिए उपयुक्त नहीं हैं. इसके अलावा, हम वे स्लाइस तेजी से ठंडा और rewarmed कर रहे हैं, जहां तापमान पारी प्रयोगों के दौरान व्यवहार्य नहीं रहते हैं कि मनाया. संभावित vivo में उपचार से पहले प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए किया जा सकता है कि समय की राशि को सीमित करने, P21-P35 चूहों से तैयार इसके अलावा, जब स्लाइस सबसे व्यवहार्य हैं. दरअसल, एक उच्च सुक्रोज काटने समाधान का उपयोग कर, हम डैट तस्करी कम reproducibly P35-P42 चूहों (गेब्रियल और Melikian, अप्रकाशित डेटा) से तैयार स्लाइस में मनाया जाता हैं. हालांकि, हम इस दृष्टिकोण पद्धति मापदंडों बड़े जानवरों (IE का उपयोग की आवश्यकता होती है, जहां एक बेहतरीन विकल्प है झाओ एट अल. 24 द्वारा वर्णित के रूप में संशोधित टुकड़ा तैयारी का उपयोग बड़े पशुओं में उल्लेखनीय सुधार हुआ टुकड़ा व्यवहार्यता का पालन. निम्नलिखित ईआईटीउसे वायरल की मध्यस्थता प्रोटीन / शाही सेना अभिव्यक्ति की स्थापना, व्यवहार, या विवो दवा उपचार में जीर्ण).
प्रयोगात्मक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं कि कई अतिरिक्त तकनीकी कारक हैं. यह अनुभव से पूर्व मात्रात्मक प्रयोगों का प्रयास करने के लिए कुल lysate प्रोटीन की दी गई राशि में biotinylated प्रोटीन के सभी कब्जा करने की जरूरत इष्टतम मनका / कुल प्रोटीन अनुपात निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. यह समस्या अक्सर अनदेखी की है, लेकिन प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाने के लिए सक्षम होने में निर्णायक कारक हो सकता है. Biotinylated प्रोटीन के सभी मात्रात्मक बरामद नहीं किया जाता है, सतह के स्तर में परिवर्तन undetectable या गलत मापा या तो हो जाएगा. परिणामों को प्रभावित कर सकता है कि एक अन्य चर ऊतक स्लाइस अलग कर देना करने के लिए इस्तेमाल किया lysis बफर की मात्रा है. इस्तेमाल किया निरपेक्ष ऊतक जन हित जांच की जा रही के क्षेत्र पर निर्भर करेगा, और likel जाएगाY पूरा ऊतक solubilization प्राप्त करने के लिए अधिक या कम lysis बफर की आवश्यकता होती है. जैसे, अंतिम lysate प्रोटीन सांद्रता भी मस्तिष्क क्षेत्रों में भिन्न हो सकते हैं. इसलिए, सेल शर्तों अनुभवतः दिया मस्तिष्क क्षेत्र के लिए निर्धारित और स्वतंत्र प्रयोगों के बीच स्थिर रखा जाना चाहिए.
संक्षेप में, हम पूर्व vivo तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें का उपयोग कर वयस्क न्यूरॉन्स में neuronal प्रोटीन की तस्करी को मापने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस दृष्टिकोण की उपयोगिता neuronal समारोह आबाद कि endocytic तस्करी तंत्र की एक और गहराई को समझने के लिए नेतृत्व की संभावना है.
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Disclosures
लेखक कोई वित्तीय हितों को इस काम के साथ संघर्ष किया है.
Acknowledgments
इस काम हेम को एनआईएच अनुदान DA15169 और DA035224 द्वारा वित्त पोषित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and reused |
References
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