Summary
نقدم اختبار الاختيار للكشف عن تأثير عطر على سلوك ذبابة الفاكهة باستخدام مقايسة Y-المتاهة.
Abstract
الكشف عن إشارات من البيئة أمر ضروري للحيوانات لضمان بقائها. لهذا الهدف، فإنها تستخدم الاشارات البيئية مثل الرؤية، mechanoreception، والسمع، وchemoperception من خلال الطعم، عن طريق الاتصال المباشر أو عن طريق الشم، والذي يمثل استجابة لجزيء متقلبة تعمل في مدى أطول. الجزيئات الكيميائية المتطايرة هي إشارات مهمة جدا بالنسبة لمعظم الحيوانات في الكشف عن الخطر، مصدرا للغذاء، أو للاتصال بين الأفراد. ذبابة الفاكهة السوداء البطن هي واحدة من النماذج البيولوجية الأكثر شيوعا للعلماء لاستكشاف أساس الخلوية والجزيئية من الشم. من أجل تسليط الضوء على قدرات الشم من هذه الحشرة الصغيرة، ونحن تصف بروتوكول خيار تعديل على أساس الاختبار Y-المتاهة المستخدمة تقليديا مع الفئران. البيانات التي تم الحصول عليها مع Y-متاهات تعطي معلومات قيمة لفهم أفضل لكيفية تعامل الحيوانات مع بيئتها المتغيرة على الدوام. ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لدراسةأثر عطر على ذبابة استجابة استكشافية باستخدام هذه Y-متاهة الفحص.
Introduction
استقبال كيميائي من خلال الذوق أو الشم هي الطريقة الحسية الرئيسية لبقاء الحيوان. أنه يعطي اشارات الحيوية اللازمة للكشف عن خطر أو مصادر الغذاء، فضلا عن التفاعلات الاجتماعية. كما أنه يساعد الحيوانات في العثور على شريك الجنس الضرورية لتكاثرها. لأكثر من 20 عاما، والبحوث المكثفة، بما في ذلك جائزة نوبل الحائز على العمل من قبل ريتشارد أكسيل وليندا باك في عام 2004 "لاكتشافاتهم من مستقبلات الرائحة وتنظيم نظام حاسة الشم"، وقد نفذت للكشف عن الأسس الجزيئية والخلوية لل 1،2 الشم.
واحدة من النماذج الحيوانية المفضلة للعلماء لتشريح تصور حاسة الشم هي D. البطن. تشترك هذه الحشرة استراتيجية الترميز رائحة الخلوية والجزيئية مماثلة مع الثدييات. يستخدم المجتمع العلمي النماذج السلوكية المختلفة لدراسة دور عطر في هذا ذبابة الفاكهة. وتشمل هذه الاختبارات فحوصات متعدد الوسائط مثل courtshiع الاختبارات المختلفة حيث طرائق الحسية، بما في ذلك الشم، هي مهمة لانتزاع الخطوبة الذكور 3. كما وضعت فحوصات أخرى لمعالجة دور عطر بشكل أكثر تحديدا؛ وتشمل هذه T-متاهات، Y-متاهات، فخ المقايسات، الساحات أربعة الميدان والرياح والأنفاق 4،5،6،7،8.
في هذه المقالة نقدم بسيطة تعديل مقايسة Y-المتاهة التي توفر الاستجابات حاسة الشم القوية باستخدام D. البطن. يستخدم لدينا مجموعة المتابعة نهاية النصائح في مخالفة للطريقة الموصوفة سابقا 9. وبالتالي، لدينا Y-متاهة ميزتان. الأولى، فإنه يتجنب أي عودة في النظام مرة واحدة جعلت الطاير خيارها. الثانية، أنه يحد من تبادل عطر في جميع مناطق Y-المتاهة. هذه الميزة الأخيرة لها أهميتها لأن ذبابة الفاكهة هي حساسة جدا لتدفق الهواء التي كثيرا ما تستخدم لتجنب التشبع الرائحة. لضبط التجريبية مجموعة المتابعة مع تدفق الهواء من شأنه أن يكون الوقت والتكلفة المستهلكة. لذلك، لدينا فحص Y-المتاهة يمثل EFficient وطريقة سريعة لاختبار أداء حاسة الشم من ذبابة الفاكهة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. قبل بدء
- استخدام الأسهم المرجعية isogenized تحمل الظواهر السلوكية مستقرة وقوية. ليس هناك قاعدة عامة لاختيار هذا السهم، حيث أن جميع الضوابط المحتملة قد تحمل الأليلات الخلفية غير المتجانسة.
- استخدام هذا التحكم لسلالة تزاوج تبادلي كل الأسهم الأخرى اللازمة لخطوات لاحقة. وعادة ما تمثل هذه الخطوة backcrossing لا يقل عن 5 تمريرات متتالية من الإناث البكر واحدة (للسماح ممكن عبور أكثر من بين الكروموزومات المتماثلة) إلى 2-3 الذكور إشارة إسوي 5. هذه الخطوة مهمة لتجانس الخلفية الوراثية بين الأسهم ذبابة مختلفة.
- تحتفظ بمخزونات ذبابة الفاكهة على الدقيق العادي الذرة (9٪)، والخميرة (10٪)، والمتوسطة أجار (1.5٪) تستكمل مع المضادات الحيوية (0.4٪ الميثيل الفقرة هيدروكسي بنزوات) في 12 ساعة ضوء / دورة الظلام في 25 ° C.
- تحقيق التجارب حسي كيميائي في غرفة التحكم في درجة حرارته (25 درجة مئوية) تحت الضوء الأحمر حتى الآن(للقضاء على مساهمة الإشارات البصرية، والتركيز على إشارات حسي كيميائي). بانتظام تجديد الهواء من الغرفة لتهوية المنطقة الواقعة بين كل تجربة.
2. الاستجابة الشمية باستخدام الفحص Y-المتاهة
- تجويع الذباب ل16-18 ساعة عند 25 درجة مئوية في أنابيب زجاجية تحتوي على منشفة ورقية مبللة قبل الاختبار.
- الانضمام إلى موصل Y-شكل لاثنين من قوارير الزجاج وإلى قارورة بلاستيكية صغيرة (القارورة التحميل). استخدام 1 مل ماصة نصائح التي تمر عبر سدادات الرغوة لربط موصل إلى قارورة الثلاثة، والحصول على مغلقة بإحكام Y-المتاهة. قطع نهايات ضيقة من اثنين من نصائح ماصة (~ 2 مم، لتجنب أي عودة الطاير مرة واحدة جعلت من قرارها) لتشكيل اثنين من قارورة "فخ"، ونهاية واحدة كبيرة من طرف ماصة لتشكيل "تحميل" أنبوب (الشكل 1A).
- فقط قبل توصيل قوارير "الفخ" (الشكل 1B)، ومكان واحد ~ 6 مم رقة الترشيح فيكل قنينة. إضافة 40 ميكرولتر من الحل الرائحة على الورق مرشح واحد، و 40 ميكرولتر من المذيب المقابل على ورقة الترشيح الثانية.
- أعرض عشرة 4-9 الذباب بعمر يوم واحد في "تحميل" القارورة. لا تستخدم CO 2 التخدير أثناء هذا النقل، لما لها من تأثير قوي على السلوك 10. بدلا استخدام التبريد وجيزة على الجليد. التلاعب السليم من الذباب مخدرة المهم للحد من الضغط على المواضيع قدر الإمكان.
- إجراء سلسلة من الاختبارات Y-متاهة عند 25 درجة مئوية تحت ضوء بعيدة الحمراء (باستخدام لمبات LED للحد من مصدر التدفئة ممكن) لتجنب المثيرات البصرية إلى أقصى حد ممكن. كن حذرا بالتناوب توجهات Y-متاهات (الرائحة التي تحتوي على أنبوب على اليسار، أو على حق، وأنبوب التحميل في الجبهة أو في الظهر. الشكل 1C).
- تسمح عدة ساعات للذباب للدخول في فخ القارورة التي تحتوي على الرائحة أو المذيبات. عد الذباب بعد 24 ساعة إلى زيادة participatiعلى ما يصل إلى أكثر من 80٪ وتوفير أقصى قدر من القيمة الشمية مؤشر (Simonnet، اتصال شخصي).
- حساب مؤشر حاسة الشم الناتجة باستخدام الصيغة التالية: (الرقم في أنبوب رائحة - الرقم في أنبوب المذيبات) / العدد الكلي للذباب تحميلها.
- غسل Y-متاهة انشاء النحو التالي: نقع تفكيك انشاء RBS في 35 MD بين عشية وضحاها. شطف جيدا خارجا مع مياه الحنفية. أخيرا شطف مع الماء منزوع الأيونات والسماح تجف.
3. التحليل الإحصائي للبيانات
- إجراء اختبار ر، وANOVA في اتجاه واحد أو اتجاهين ANOVA اعتمادا على البيانات والمتغيرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1D ردين ممثل باستخدام هذه Y-متاهة الفحص. كانتون-S الذكور تجنب بقوة حامض الخليك 10٪ الواحد في الماء المقطر، في حين أنها لا تجنب بشكل ملحوظ حمض فينيل الخل 10٪. وتستند هذه المقايسات في 10 ذكرا لكل تكرار وضعها معا في قارورة التحميل. هذا البروتوكول يمكن أن تؤدي أحيانا إلى الخطأ المعياري كبير من الوسط. إذا لزم الأمر، فمن الممكن للحد من هذا العيب باستخدام 20 ذكرا لكل مكررات بدلا من 10 فقط. رياضيا، واختيار فرد واحد له وزن أقل على قيمة المؤشر لأكبر حجم العينة.
الشكل 1. استجابة حاسة الشم ذكر المقررة مع Y-متاهة انشاء. A) جهاز سبليت. B) تجميعهاالجهاز. C) مجموعة المتابعة في حالة صالحة للعمل تحت الضوء الحمراء بكثير. D) الكمي لاستجابات الذكور حاسة الشم نحو حامض الخليك (AA) أو حمض فينيل الخل (PAA) على حد سواء المخفف في الماء المقطر (10٪ ت / ت) (N = 11، وهو ما يمثل ما مجموعه 110 الذباب). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t مقارنة البيانات إلى 0. 0 يعني عدم وجود تفضيل. القيمة السالبة تشير إلى النفور من الرائحة، وقيمة موجبة عامل جذب. ****: ع <0.0001؛ نانوثانية: غير معنوي (p = 0.1680) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند لدينا بروتوكول Y-متاهة على البروتوكول هو موضح سابقا 9. ومع ذلك، ونحن نقدم اثنين من الاختلافات الرئيسية. الأولى، ونحن نستخدم نصائح ماصة ضيقة لمنع الذباب من العودة مرة واحدة قرروا دخول في قارورة تحتوي على مذيب أو المذيبات بالإضافة إلى الرائحة. هذه النصائح الضيقة هي أيضا مفيدة للحد من انتشار الرائحة في Y-المتاهة. الثانية، ونحن نستخدم أصغر قارورة التحميل لإجبار الذباب للدخول في Y-المتاهة. فمن المهم أن تكون هناك مشاركة عالية من هذه الذباب (80٪ الى 100٪ بعد 24 ساعة؛ Simonnet، اتصال شخصي).
يمثل هذا الاختبار Y-المتاهة اختبار كفاءة لتقييم الاستجابات حسي كيميائي في ذبابة الفاكهة. سياق الاختبار، بما في ذلك الضغط على الذباب (من تدفق الهواء، والتلاعب من الذباب خلال الخطوة التحميل، الخ) فمن المحتمل أن تؤثر ردودهم حاسة الشم. هذه هي القضايا البيئية الحرجة ويمكن أن يفسر، جزئيا على الأقل، لماذا مختلفةالدراسات قد تكون لها نتائج سلوكية مختلفة. على سبيل المثال يظهر حمض الخليك لتكون مثيرة للاشمئزاز في بعض الظروف 4،11، في حين أنها جذابة في الآخرين 12. ولذا فمن الأهمية بمكان أن السيطرة على كل هذه المعايير قدر الإمكان.
واحد الحد الممكن من هذه Y-متاهة الاختبار هو سياقها الاصطناعي للذباب لأنها تقام في تصميم مؤمن. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يدخل الذباب في الممرات الضيقة، والتي قد تكون مرهقة بالنسبة لهم. المجرب أن يتذكر هذا عند تفسير البيانات.
لتجاوز هذه القيود المحتملة، يمكن أن يؤديها غيرها من اختبارات الشم مكملة لتأكيد أثر عطر على السلوك. وتشمل هذه الاختبارات T-متاهات 4، 4 فحوصات ميدانية الساحة 7، أو 8 أنفاق الرياح. ومع ذلك، فإن هذه الاختبارات أيضا الاستفادة من بيئات اصطناعية لالذباب، والتي يمكن أن تكون أكثر أو أقل إرهاقا. على سبيل المثال، خلال اختبارات T-متاهة الذباب هي مرحباوشدد ghly لأنها اهتزت خلال الخطوة التحميل 4. ومع ذلك، والاستفادة من T-المتاهة مقارنة هذه Y-متاهة الاختبار هو أن الذباب ان تختار في غضون دقائق إلى أين تذهب (إلى الرائحة أو المذيب). وبالتالي فإن استجابة Y-المتاهة يمثل خيار "عاكس"، في حين أن النتائج التي تم الحصول عليها مع T-متاهة تمثل خيارا لا ارادي في حالة مرهقة للغاية.
أخيرا إمكانية تحسين هذه Y-متاهة الفحص سيكون لاستخدام أنابيب زجاجية على طول انشاء بدلا من البلاستيك لبعض المكونات (أنبوب التحميل، موصل، نصائح ماصة). ويمكن لهذه قطع من البلاستيك، من الناحية النظرية، ولها رائحة لأنها مصنوعة من البنزين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر 4 المراجعين المجهولين لعملهم لتحسين المخطوطة. نشكر المركز الوطني للبحوث العلميه للحصول على الدعم المالي لMBG وYG، وجامعة دي بورغون وزارة البحوث الفرنسية لMMS. ويتم تمويل البحوث في مختبر YG من قبل المجلس الأوروبي للبحوث (ERC ابتداء غرانت، GliSFCo-311403)، والوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR-JCJC، GGCB-2010) ومجلس الدولة الجهوي دي بورغون (فابر)، وCNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y.
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
