Summary
Wij stellen een keuze test om de invloed van geurstoffen op Drosophila gedrag via een Y-doolhof test onthullen.
Abstract
Detecteren signalen uit de omgeving essentieel voor dieren om hun overleving te verzekeren. Om dit doel, omgevingsfactoren gebruiken ze zoals visie, mechanoreceptoren, gehoor, en chemoperception door smaak, via direct contact of via reukzin, waarmee de respons op een vluchtig molecuul acteren op een groter bereik vertegenwoordigt. Vluchtige chemische moleculen zijn zeer belangrijke signalen voor de meeste dieren de detectie van gevaar, een voedselbron of communicatie tussen individuen. Drosophila melanogaster is een van de meest voorkomende biologische modellen voor wetenschappers om de cellulaire en moleculaire basis van reukvermogen verkennen. Om olfactorische mogelijkheden van deze kleine insect markeren beschrijven we een gemodificeerde keuze protocol gebaseerd op de Y-doolhoftest klassiek gebruikt muizen. Gegevens, verkregen met Y-doolhoven geven waardevolle informatie om beter te begrijpen hoe dieren omgaan met hun voortdurend veranderende omgeving. We introduceren een stap-voor-stap protocol te bestuderen deimpact van geurstoffen op flybridge verkennende respons met behulp van deze Y-maze test.
Introduction
Chemoreception door smaak of reukzin is een belangrijke zintuiglijke modaliteit voor dierlijke overleven. Het geeft belangrijke aanwijzingen voor de detectie van een gevaar of voedselbronnen, en sociale interacties. Het helpt ook dieren een sex partner nodig zijn voor hun voortplanting te vinden. Al meer dan 20 jaar intensief onderzoek, waaronder Nobelprijs winnende werk van Richard Axel en Linda Buck in 2004 "voor hun ontdekkingen van geurende receptoren en de organisatie van het olfactorische systeem", is uitgevoerd om de moleculaire en cellulaire basis van onthullen reukzin 1,2.
Een van de favoriete diermodellen voor wetenschappers om olfactorische perceptie ontleden is D. melanogaster. Dit insect heeft ook een soortgelijke cellulaire en moleculaire-geur coderingsstrategie met zoogdieren. De wetenschappelijke gemeenschap gebruikt diverse gedragsmatige paradigma om de rol van geurstoffen in deze fruitvlieg te bestuderen. Deze tests omvatten multimodale testen zoals courtship tests waarbij verschillende zintuiglijke modaliteiten, waaronder reukzin, zijn belangrijk voor mannelijke hofmakerij 3 ontlokken. Andere tests zijn ontwikkeld om de rol van geurstoffen specifieker te pakken; deze omvatten T-doolhoven, Y-doolhoven, val assays, vier-veld arena's en wind-tunnels 4,5,6,7,8.
In dit artikel presenteren we een eenvoudige gemodificeerd Y-maze test, die robuust olfactorische reacties geeft met behulp van D. melanogaster. Onze set-up maakt gebruik van end-tips in tegenstelling tot een eerder beschreven methode 9. Aldus onze Y-doolhof heeft twee voordelen. Ten eerste, het voorkomt een terugkeer in het systeem zodra de vlieg haar keuze heeft gemaakt. Ten tweede, het beperkt de uitwisseling van geurstoffen op alle gebieden van het Y-doolhof. Dit laatste voordeel is belangrijk omdat Drosophila zeer gevoelig luchtstroom die vaak wordt gebruikt om geurstof verzadiging te vermijden. Om de experimentele set-up met een luchtstroom aan te passen tijd en kosten consumeren zou zijn. Daarom onze Y-doolhof test vertegenwoordigt een efdoende en snelle manier om olfactorische prestaties van Drosophila testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vóór het starten
- Gebruik een isogenized verwijzing voorraad lager stabiel en robuust gedrag fenotypes. Er is geen algemene regel voor het kiezen van dit bestand, omdat alle mogelijke controles heterogene achtergrond allelen mag uitvoeren.
- Gebruik deze controle stam met elke andere voorraad nodig teruggekruisd voor latere stappen. Dit terugkruisingsprogramma stap wordt meestal vertegenwoordigd door ten minste 5 opeenvolgende kruisingen van een maagdelijke vrouw (om mogelijke crossing-over tussen homologe chromosomen) 2-3 isogene verwijzing mannen 5. Deze stap is belangrijk om de genetische achtergrond van de verschillende vlieg bestanden homogeniseren.
- Handhaaf Drosophila voorraden op een standaard maïsmeel (9%), gist (10%), en agar medium (1,5%), aangevuld met antibiotica (0,4% methyl para-hydroxy-benzoaat) in een 12-uur licht / donker cyclus bij 25 ° C.
- Bereiken chemosensory experimenten in een temperatuur gecontroleerde ruimte (25 ° C) onder ver rood licht(De bijdrage van visuele signalen te elimineren, en te focussen op chemosensory signalen). Regelmatig de lucht van de kamer naar het gebied tussen elk experiment ventileren vernieuwen.
2. Olfactory Response via een Y-doolhof Assay
- Verhongeren de vliegen gedurende 16-18 uur bij 25 ° C in glazen buisjes die natte papieren handdoek voor het testen.
- Word lid van een Y-vormige connector om twee glazen flesjes en een kleinere plastic flesje (laden flacon). Gebruik 1 ml pipet tips die door het schuim stoppers aan de uitgang en de drie flesjes, en een goed afgesloten Y-doolhof verkrijgen. Snijd de smalle uiteinden van twee pipetuiteinden (~ 2 mm diameter, tot een terugkeer van de vlieg te voorkomen zodra zij haar besluit heeft gemaakt) om twee "trap" flesjes vormen, en een brede uiteinde van een pipet tip om de "loading" te vormen buis (figuur 1A).
- Vlak voor het aansluiten van de "val" flesjes (Figuur 1B), plaats een ~ 6 mm diameter filter papierelke flacon. Voeg 40 ul van geurende oplossing op een filtreerpapier en 40 ul van de overeenkomstige oplosmiddelen uit tweede filtreerpapier.
- Introduceer tien 4-9 dagen oude vliegen in de "loading" flacon. Heeft CO 2 verdoving niet gebruiken tijdens deze overdracht, want het heeft een sterk effect op het gedrag 10. Gebruik liever korte afkoeling op ijs. Juiste manipulatie van verdoofde vliegen is belangrijk om stress te beperken op zoveel mogelijk de onderwerpen.
- Voer een aantal Y-doolhof test bij 25 ° C onder ver-rood licht (met LED-lampen mogelijk warmtebron beperken) visuele stimuli vermijden zoveel mogelijk. Wees voorzichtig om de oriëntaties van de Y-doolhoven afwisselen (geurstof die buis aan de linkerkant of aan de rechterkant, en het laden buis aan de voorkant of aan de achterkant; figuur 1C).
- Laat enkele uren voor de vliegen in de val flacon met de geurstof of het oplosmiddel te gaan. Count vliegen na 24 uur aan de participati verhogenop tot meer dan 80% en bevat de volledige olfactorische indexwaarde (Simonnet, persoonlijke communicatie).
- Bereken het resulterende geur index met de volgende formule: (nummer in de geur tube - nummer in het oplosmiddel buis) / totaal aantal geladen vliegen.
- Wash Y-doolhof set-up als volgt: geniet de gedemonteerde set-up in RBS 35 MD 's nachts. Grondig uitspoelen met kraanwater. Tenslotte spoelen met gedemineraliseerd water en laat drogen.
3. Statistische analyse van de gegevens
- Voer een t-test, een one-way ANOVA of een two-way ANOVA, afhankelijk van de gegevens en variabelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1D toont twee representatieve reacties met deze Y-doolhof test. Canton-S mannetjes sterk vermijden 10% azijnzuur opgelost in gedestilleerd water, dat zij geen significant vermijden 10% fenylazijnzuur. Deze assays zijn gebaseerd op 10 mannen per herhaling samen het laden flesjes geplaatst. Dit protocol kan soms leiden tot grote standaardafwijking van het gemiddelde. Indien nodig is het mogelijk om dit nadeel te verminderen met 20 mannen per herhalingen in plaats van slechts 10. Wiskundig de keuze van een individu een lager gewicht op de indexwaarde voor een grotere steekproef.
Figuur 1. Man olfactorische reactie die is vastgesteld met een Y-doolhof set-up. A) Split apparaat. B) Gemonteerdapparaat. C) Set-up in werkende staat onder ver-rood licht. D) Kwantificering van mannelijke olfactorische reacties naar azijnzuur (AA) of fenylazijnzuur (PAA) zowel verdund in gedestilleerd water (10% v / v) (N = 11, wat neerkomt op een totaal van 110 vliegen). Statistische analyse werd uitgevoerd met een t-test waarbij de gegevens aan 0. 0 betekent geen voorkeur. Een negatieve waarde geeft een afkeer van de geurstof, en een positieve waarde een attractie. ****: P <0,0001; ns:. niet-significant (p = 0,1680) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Y-doolhof protocol is gebaseerd op een eerder beschreven protocol 9. Echter, introduceren we twee belangrijke verschillen. Eerste gebruiken we smalle pipet tips om te voorkomen dat de vliegen terugkeren zodra ze besluiten in de flacon met het oplosmiddel of het oplosmiddel plus de geurstof aan te gaan. Deze smalle tips zijn ook nuttig om de geurstof diffusie in het Y-doolhof beperken. Daarbij maken wij gebruik van een kleinere lading flacon om de vliegen te dwingen in de Y-doolhof te gaan. Het is belangrijk om een hoge participatie van deze vliegen hebben (80% tot 100% na 24 uur, Simonnet, persoonlijke communicatie).
Deze Y-doolhof test vertegenwoordigt een efficiënte test chemosensory responsen evalueren Drosophila. De context van de test, met belasting van de vliegen (bij luchtstroom, manipulatie van de vliegen in de beladingsstap, enz.) is mogelijk beïnvloeden van hun olfactorische reacties. Deze milieuproblemen zijn kritisch en zou kunnen verklaren, ten minste gedeeltelijk, waarom andersstudies konden verschillende gedragsresultaten. Bijvoorbeeld azijnzuur wordt getoond weerzinwekkend om in sommige omstandigheden 4,11, terwijl het aantrekkelijk in anderen 12. Daarom is het essentieel om al deze parameters te besturen zoveel mogelijk.
Een mogelijke beperking van deze Y-doolhof test is de kunstmatige context voor vliegen omdat zij worden gehouden in een gesloten vormgeving. Bovendien vliegen hebben nauwe doorgangen te voeren, die belastend voor hen zou kunnen zijn. De experimentator moet dit onthouden bij het interpreteren van de gegevens.
Om deze mogelijke beperkingen te omzeilen, kunnen andere aanvullende olfactorische tests uitgevoerd om de impact van geurstoffen op het gedrag te bevestigen. Deze tests omvatten T-doolhoven 4, 4 veld-arena assays 7, of windtunnels 8. Echter, deze tests ook gebruik kunstmatige omgeving voor vliegen, die meer of minder stressvol zijn. Bijvoorbeeld tijdens T-doolhof test vliegen zijn highly gestrest omdat ze tijdens het laden stap 4 worden geschud. Echter, het voordeel van een T-doolhof tegenover het Y-doolhof test is die vliegt moet kiezen binnen minuten waar te gaan (het geurstof of het oplosmiddel). Daarom is de Y-doolhof respons is een "reflecterende" keuze, terwijl de resultaten verkregen met een T-doolhof vormen een reflex keuze in een zeer stressvolle toestand.
Eindelijk een mogelijke verbetering van deze Y-maze test zou zijn om glazen buizen te gebruiken langs de set-up in plaats van plastic voor sommige componenten (laden buis, connector, pipet tips). Deze plastic onderdelen kunnen in theorie een geur hebben omdat ze zijn gemaakt van benzine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken 4 anonieme reviewers voor hun werk aan het manuscript te verbeteren. Wij danken het Centre National de la Recherche Scientifique voor zijn financiële steun aan MBG en YG, en de Universite de Bourgogne en het Franse Ministerie van Onderzoek naar MMS. Onderzoek in YG laboratorium wordt gefinancierd door de European Research Council (ERC Starting Grant, GliSFCo-311403), de Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), de Conseil Regional de Bourgogne (Faber), en het CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y.
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
