Summary
Nous présentons un test à choix de révéler l'influence de substances odorantes sur le comportement de drosophile en utilisant un dosage labyrinthe en Y.
Abstract
Détecter des signaux de l'environnement est essentielle pour les animaux pour assurer leur survie. Pour cela, ils utilisent des signaux environnementaux tels que la vision, mécanoréception, audience, et chemoperception par goût, par contact direct ou par l'olfaction, qui représente la réponse à une molécule volatile agissant à plus longue portée. Molécules chimiques volatiles sont des signaux très importants pour la plupart des animaux dans la détection du danger, une source de nourriture, ou de communiquer entre les individus. Drosophila melanogaster est l'un des modèles biologiques les plus courants pour les scientifiques à explorer la base cellulaire et moléculaire de l'olfaction. Afin de mettre en évidence les capacités olfactives de ce petit insecte, nous décrivons un protocole de choix modifié basé sur le test Y-labyrinthe classique utilisé avec la souris. Les données obtenues avec Y labyrinthes donnent des informations précieuses pour mieux comprendre comment les animaux face à leur environnement en perpétuel changement. Nous introduisons un protocole étape par étape pour étudier laimpact des substances odorantes à la volée réponse exploratoire utilisant ce test Y-labyrinthe.
Introduction
Chemoreception par goût ou l'odorat est une modalité sensorielle clé pour la survie de l'animal. Il donne des signaux essentiels nécessaires pour la détection d'un danger ou des sources de nourriture, ainsi que pour les interactions sociales. Il aide aussi les animaux à trouver un partenaire de sexe nécessaire à leur reproduction. Depuis plus de 20 ans, des recherches intensives, y compris le prix Nobel gagnant travail par Richard Axel et Linda Buck en 2004 "pour leurs découvertes de récepteurs olfactifs et l'organisation du système olfactif", a été réalisée pour révéler les bases moléculaires et cellulaires de la olfaction 1,2.
Un des modèles animaux préférés pour les scientifiques pour disséquer la perception olfactive est D. melanogaster. Cet insecte part une stratégie d'odeur codage cellulaire et moléculaire similaire avec les mammifères. La communauté scientifique utilise divers paradigmes comportementaux à étudier le rôle des substances odorantes dans cette mouche des fruits. Ces tests comprennent des essais multimodaux tels que courtshitests de p où diverses modalités sensorielles, y compris l'olfaction, sont importantes pour susciter la cour mâle 3. D'autres essais ont également été mis au point pour lutter contre le rôle des substances odorantes plus précisément; il s'agit notamment de T-labyrinthes, Y labyrinthes, des essais de piégeage, les arénas à quatre sur le terrain et le vent tunnels 4.5.6.7.8.
Dans cet article, nous présentons un test Y-labyrinthe simple modifié, qui apporte des réponses robustes olfactives en utilisant D. melanogaster. Notre set-up utilise finaux conseils contrairement à une méthode 9 décrit précédemment. Ainsi, notre labyrinthe en Y présente deux avantages. Tout d'abord, il évite tout retour dans le système une fois la mouche a fait son choix. D'autre part, elle limite l'échange de substances odorantes dans tous les domaines de la Y-labyrinthe. Ce dernier avantage est important puisque de Drosophila sont très sensibles à l'écoulement d'air qui est souvent utilisé pour éviter la saturation odorant. Pour régler le dispositif expérimental avec un flux d'air serait temps et consomme de coût. Par conséquent, notre analyse labyrinthe en Y représente un efFicient et rapide pour tester les performances olfactif de la drosophile.
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Protocol
1. Avant de commencer
- Utilisez un stock de référence isogenized portant phénotypes comportementaux stables et robustes. Il n'ya pas de règle générale pour le choix de ce stock, puisque tous les contrôles possibles peuvent porter hétérogènes allèles de fond.
- Utilisez cette souche de contrôle de backcross tout autre matériel nécessaire pour les étapes ultérieures. Cette étape de rétro-croisement est généralement représenté par au moins cinq croisements successifs d'une seule femelle vierge (pour permettre possible crossing-over entre les chromosomes homologues) à 2-3 mâles de référence isogéniques 5. Cette étape est importante pour homogénéiser le fond génétique entre les différentes populations de mouches.
- Maintenir les stocks de Drosophila sur une farine type de maïs (9%), levure (10%), et milieu de gélose (1,5%) complétée par un antibiotique (0,4% de méthyl para-hydroxy-benzoate) dans un cycle lumière de 12 h / obscurité à 25 ° C.
- Atteindre expériences chimiosensoriels dans une pièce à température contrôlée (25 ° C) sous une lumière rouge lointain(Pour éliminer la contribution de repères visuels, et de se concentrer sur les signaux chimiosensoriels). Renouveler régulièrement l'air de la pièce à ventiler la zone entre chaque expérience.
2. Réponse olfactive l'aide d'un test Y-labyrinthe
- Affamer les mouches pour 16-18 h à 25 ° C dans des tubes de verre contenant serviette en papier humide avant le test.
- Joignez-vous à un connecteur en forme de Y de deux flacons de verre et dans un flacon en plastique plus petit (chargement de flacon). Utiliser 1 ml de pointes de pipettes qui passent à travers les bouchons de mousse pour relier le connecteur à trois flacons, et pour obtenir un labyrinthe en Y hermétiquement fermés. Couper les extrémités étroites des deux embouts de pipette (~ de 2 mm de diamètre, pour éviter tout retour de la mouche une fois qu'il a pris sa décision) pour former deux flacons "pièges", et une grande extrémité d'un embout de pipette pour former le «chargement» tube (Figure 1A).
- Juste avant de brancher les flacons "pièges" (figure 1B), placez une ~ 6 papier filtre de mm de diamètrechaque flacon. Ajouter 40 ul de solution odorant sur un papier filtre, et 40 pi de solvant correspondant sur le deuxième papier filtre.
- Présentez-dix 4 à 9 vol d'un jour dans le «chargement» flacon. Ne pas utiliser de CO 2 anesthésie pendant ce transfert, car il a un effet important sur le comportement 10. Utiliser plutôt bref refroidissement sur de la glace. Manipulation correcte des mouches anesthésiés est important de limiter le stress sur les sujets autant que possible.
- Effectuer une série de tests Y-labyrinthe à 25 ° C sous la lumière rouge lointain (en utilisant des ampoules LED pour limiter source de chaleur possible) pour éviter les stimuli visuels autant que possible. Attention à alterner les orientations des Y labyrinthes (odorant contenant tubes sur la gauche, ou à droite, et le tube de chargement à l'avant ou à l'arrière, la figure 1C).
- Accorder quelques heures pour les mouches de pénétrer dans le flacon de piège contenant la substance odorante ou le solvant. Comptez vol après 24 h pour augmenter la participatisur un maximum de plus de 80% et fournir la valeur d'index maximale olfactif (Simonnet, communication personnelle).
- Calcul de l'indice olfactif résultant en utilisant la formule suivante: (nombre dans le tube d'odeur - nombre dans le tube de solvant) / nombre total de mouches chargés.
- Laver labyrinthe en Y mis en place comme suit: tremper le set-up démantelé dans RBS 35 MD nuit. Rincer abondamment avec de l'eau du robinet. Enfin rincer avec de l'eau déminéralisée et laissez sécher.
3. Analyse statistique des données de
- Effectuez un test t, une analyse de la variance d'une manière ou d'une analyse de variance à deux voies en fonction des données et des variables.
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Representative Results
Figure 1D montre deux réponses représentatives qui utilisent ce test Y-labyrinthe. Canton-S mâles éviter fortement acide acétique à 10% dilué dans de l'eau distillée, tandis qu'elles n'évitent pas de manière significative l'acide phénylacétique de 10%. Ces essais sont basés sur 10 mâles par répétition placés ensemble dans les flacons de chargement. Ce protocole peut parfois conduire à grande erreur standard de la moyenne. Si nécessaire, il est possible de réduire cet inconvénient en utilisant des 20 mâles par répétitions seulement au lieu de 10. Mathématiquement, le choix d'un individu a un poids inférieur à la valeur d'index pour une taille d'échantillon plus grande.
Figure 1. Réponse olfactive Homme évalué avec un labyrinthe en Y set-up. A) dispositif de Split. B) assembléappareil. C) Mise en place en état de marche sous la lumière rouge lointain. D) Quantification des réponses olfactives masculines envers l'acide acétique (AA) ou l'acide phénylacétique (PAA) à la fois dilué dans de l'eau distillée (10% v / v) (N = 11, ce qui représente un total de 110 mouches). L'analyse statistique a été effectuée en utilisant un test t comparant les données à 0. 0 signifie pas de préférence. Une valeur négative indique une aversion pour l'odorant, et une valeur positive d'une attraction. ****: P <0,0001; ns:. non significative (p = 0,1680) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Notre protocole labyrinthe en Y est basé sur un protocole décrit précédemment 9. Cependant, nous introduisons deux différences majeures. Tout d'abord, nous utilisons des embouts de pipette étroites pour empêcher les mouches de rentrer une fois qu'ils décident d'entrer dans le flacon contenant le solvant ou le solvant ainsi que la substance odorante. Ces conseils étroites sont également utiles pour limiter la diffusion odorant dans le labyrinthe en Y. Deuxièmement, nous utilisons un flacon de chargement inférieure à forcer les mouches d'entrer dans le labyrinthe en Y. Il est important d'avoir une forte participation de ces mouches (80% à 100% après 24 h; Simonnet, communication personnelle).
Ce test labyrinthe en Y représente un test efficace pour évaluer les réponses chimiosensoriels chez la drosophile. Le contexte de l'essai, y compris le stress sur les mouches (à partir de flux d'air, la manipulation de vol au cours de l'étape de chargement, etc) est potentiellement influent sur leurs réponses olfactives. Ces problèmes environnementaux sont essentiels et pourraient expliquer, au moins partiellement, pourquoi différenteétudes pourraient avoir des résultats comportementaux. Par exemple l'acide acétique s'avère repoussante dans certaines conditions 4,11, alors qu'il est attrayant dans d'autres 12. Par conséquent, il est essentiel de contrôler tous ces paramètres, autant que possible.
Une limitation possible de ce test labyrinthe en Y est son contexte artificiel pour les mouches car ils sont maintenus dans une conception verrouillée. En outre, les mouches doivent entrer dans les passages étroits, ce qui pourrait être stressant pour eux. L'expérimentateur doit se rappeler ce moment d'interpréter les données.
Pour contourner ces limitations possibles, d'autres tests olfactifs complémentaires pourraient être réalisés pour confirmer l'impact des substances odorantes sur le comportement. Ces tests comprennent T-labyrinthes 4, 4 essais terrain arène 7 ou 8 souffleries. Cependant, ces tests utilisent également des environnements artificiels pour les mouches, qui pourrait être plus ou moins stressant. Par exemple, lors des essais T-labyrinthe mouches salutghly souligné car ils sont agités pendant l'étape de chargement 4. Toutefois, un avantage d'un labyrinthe en T par rapport à ce dosage labyrinthe en Y est que les mouches ont à choisir dans les minutes où aller (de la substance odorante ou au solvant). Par conséquent, la réponse labyrinthe en Y représente un choix "réflexion", tandis que les résultats obtenus avec un labyrinthe en T représentent un choix réflexe dans un état très stressant.
Enfin une amélioration possible de cet essai labyrinthe en Y serait d'utiliser des tubes de verre tout au long de la mise en place au lieu de plastique pour certains composants (tube de chargement, connecteurs, embouts de pipette). Ces pièces en plastique peuvent, en théorie, avoir une odeur, car ils sont fabriqués à partir de pétrole.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions quatre examinateurs anonymes pour leur travail pour améliorer le manuscrit. Nous remercions le Centre National de la Recherche Scientifique pour son soutien financier à MBG et YG, et l'Université de Bourgogne et le Ministère français de la Recherche de MMS. Recherche dans le laboratoire de YG est financé par le Conseil européen de la recherche (ERC Starting Grant, GliSFCo-311403), l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), le Conseil Régional de Bourgogne (Faber) et le CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
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