Summary
Wir präsentieren eine Choice-Test, um den Einfluss von Geruchsstoffen auf Drosophila Verhalten mit einem Y-Labyrinth-Test offenbaren.
Abstract
Detektieren von Signalen aus der Umgebung ist für Tiere ihr Überleben zu sichern. Zu diesem Zweck verwenden sie Umweltreize wie Sehen, Mechanorezeption, Hören und chemoperception durch Geschmack, über direkten Kontakt oder durch Geruchssinn, der die Antwort auf einen flüchtigen Molekül größere Reichweite handeln darstellt. Flüchtige chemische Moleküle sind sehr wichtige Signale für die meisten Tiere in der Erkennung von Gefahr-, Nahrungsquelle oder zwischen Individuen kommunizieren. Drosophila melanogaster ist einer der am häufigsten verwendeten biologischen Modellen für Wissenschaftler, die zellulären und molekularen Basis des Geruchssinns erkunden. Um olfaktorischen Fähigkeiten dieser kleinen Insekten zu markieren, beschreiben wir eine veränderte Wahl-Protokoll basiert auf der Y-Labyrinth-Test klassisch mit Mäusen verwendet. Mit Y-Labyrinthe erhaltenen Daten geben wertvolle Informationen, um besser zu verstehen, wie Tiere mit ihren sich ständig verändernden Umwelt umzugehen. Wir führen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll zu studieren, dieWirkung von Geruchsstoffen auf Fly Sondierungs Antwort mit diesem Y-Labyrinth-Test.
Introduction
Chemoreception durch Geschmack oder Geruchssinn ist ein Schlüssel sensorischen Modalität für das Überleben der Tiere. Es gibt dadurch wichtige Hinweise für die Erkennung einer Gefahr oder Nahrungsquellen notwendig, als auch für soziale Interaktionen. Es hilft auch Tieren eine Sex-Partner für ihre Fortpflanzung notwendig finden. Seit mehr als 20 Jahren intensiver Forschung, einschließlich der Nobelpreis ausgezeichneten Arbeiten von Richard Axel und Linda Buck im Jahr 2004 "für ihre Entdeckungen der Geruchsrezeptoren und der Organisation des olfaktorischen Systems", wurde durchgeführt, um die molekularen und zellulären Grundlagen der offenbaren Riechen 1,2.
Eines der beliebtesten Tiermodelle für Wissenschaftler Geruchswahrnehmung zu zerlegen ist D. melanogaster. Dieses Insekt teilt eine ähnliche zelluläre und molekulare Geruchscodierungsstrategie mit Säugetieren. Die wissenschaftliche Gemeinschaft nutzt diverse Verhaltensparadigmen, die Rolle der Geruchsstoffe in diesem Fruchtfliege studieren. Diese Tests umfassen multimodalen Assays wie courtship Tests, bei denen verschiedene Sinnesmodalitäten, einschließlich Geruchssinn, sind wichtig, um männliche Balz 3 entlocken. Andere Tests sind auch entwickelt worden, um die Rolle von Geruchsstoffen genauer anzugehen; Dazu gehören T-Labyrinthe, Y-Labyrinthe, trap-Assays, Vier-Felder-Arenen und Wind-Tunnel 4,5,6,7,8.
In diesem Artikel stellen wir eine einfache modifizierte Y-Labyrinth-Test, die robust Riech Antworten bietet mit D. melanogaster. Unser Set-up verwendet End-Tipps im Gegensatz zu einer zuvor beschriebenen Verfahren 9. So hat unsere Y-Labyrinth zwei Vorteile. Erstens, eine Rückkehr in das System vermeidet es einmal die Fliege hat ihre Wahl getroffen. Zweitens schränkt sie den Austausch von Geruchsstoffen in allen Bereichen der Y-Labyrinth. Dieser letzte Vorteil ist wichtig, da Drosophila sind sehr empfindlich auf Luftstrom, der oft verwendet wird, um Geruchs Sättigung zu vermeiden. Zur Einstellung des experimentellen Aufbaus mit einem Luftstrom würde Zeit-und kostenintensiv sein. Daher sind unsere Y-Labyrinth-Test stellt eine efreichend und schnelle Möglichkeit, Riechleistung von Drosophila zu testen.
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Protocol
1. Vor dem Start
- Verwenden Sie ein isogenized Referenz Lager Lager stabil und robust Verhaltens Phänotypen. Es gibt keine allgemeine Regel für die Wahl dieses Lager, da alle potenziellen Kontrollen können heterogenen Hintergrund Allele tragen.
- Verwenden Sie dieses Kontrollstamm, jede andere Lager, die für spätere Schritte Rückkreuzung. Diese Rückkreuzung Schritt wird in der Regel um mindestens 5 aufeinander folgenden Kreuzungen eines einzigen weiblichen Jungfrau vertreten zu 2-3 isogene Vergleichs Männer 5 (mögliche Crossing-over zwischen homologen Chromosomen zu ermöglichen). Dieser Schritt ist wichtig, um den genetischen Hintergrund der verschiedenen Flugbestände homogenisieren.
- Pflegen Drosophila Aktien auf einem Standard-Maismehl (9%), Hefe (10%) und Agar-Medium (1,5%) mit einer Antibiotika-(0,4% Methyl-para-Hydroxy-Benzoat) in einem 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus ergänzt bei 25 ° C.
- Erreichen Sie chemosensory Experimente in einem temperierten Raum (25 ° C) unter viel rotes Licht(Um den Beitrag der visuellen Hinweisen zu beseitigen und die auf chemosensorischen Signale konzentrieren). Regelmäßig erneuern die Luft des Raumes, um den Bereich zwischen jedem Versuch zu lüften.
2. Olfaktorischen Reaktion mit einem Y-Labyrinth-Test
- Verhungern die Fliegen für 16-18 h bei 25 ° C in Glasröhrchen, die nassen Papiertuch vor der Prüfung.
- Nehmen Sie an einer Y-Form-Stecker an zwei Glasflaschen und zu einem kleineren Kunststofffläschchen (Lade Fläschchen). Verwenden Sie 1 ml Pipettenspitzen, die durch die Schaumstopper geben, um den Anschluss an die drei Fläschchen zu verknüpfen und einen dicht verschlossenen Y-Labyrinth zu erhalten. Schneiden Sie die schmalen Enden von zwei Pipettenspitzen (~ 2 mm Durchmesser, um eine Rückkehr der Fliege zu vermeiden, sobald er seine Entscheidung gemacht), um zwei "Falle" Fläschchen zu bilden, und ein großes Ende einer Pipettenspitze, um den "Laden" zu bilden Rohr (1A).
- Kurz vor dem Anschluss der "Falle" Fläschchen (1B), legen Sie ein ~ 6 mm Durchmesser Filterpapier injedes Fläschchen. 40 &mgr; l Geruchsstoff-Lösung auf ein Filterpapier, und 40 ul des entsprechenden Lösungsmittels auf dem zweiten Filterpapier.
- Führen zehn 4-9 Tage alten Fliegen in der "loading" Fläschchen. Verwenden Sie keine CO 2-Narkose während dieser Überweisung, da es einen starken Einfluss auf das Verhalten der 10 hat. Vielmehr verwenden kurzem Abkühlen auf Eis. Die richtige Handhabung der narkotisierten Fliegen ist wichtig, um Stress zu den Themen so weit wie möglich zu begrenzen.
- Führen Sie eine Reihe von Y-Labyrinth-Tests bei 25 ° C unter dunkelrotem Licht (mit LED-Lampen, um mögliche Wärmequelle zu beschränken) auf visuelle Reize zu vermeiden, so viel wie möglich. Achten Sie darauf, die Orientierungen der Y-Labyrinthe wechseln (Geruchsstoff enthalten Rohr auf der linken oder auf der rechten Seite, und Laderohr vorne oder hinten; Abbildung 1C).
- Warten Sie einige Stunden für die Fliegen in der Falle Fläschchen mit dem Geruchsstoff oder Lösungsmittel ein. Graf Fliegen nach 24 Stunden, um die participati erhöhenauf bis zu mehr als 80% und bieten maximale Geruchsindexwert (Simmonet, persönliche Mitteilung).
- Berechnen Sie die resultierende Geruchs Index nach folgender Formel: (Anzahl in den Geruch Rohr - Zahl in der Lösungsmittelrohr) / Gesamtzahl der geladenen Fliegen.
- Wash Y-Labyrinth Set-up wie folgt: einweichen abgebaut Set-up in RBS 35 MD Übernachtung. Gründlich mit Leitungswasser abspülen. Schließlich mit VE-Wasser spülen und trocknen lassen.
3. Statistische Analyse der Daten
- Führen t-Test, eine Einweg-ANOVA oder ein Zwei-Wege-ANOVA Abhängigkeit von Daten und Variablen.
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Representative Results
1D zeigt zwei repräsentative Antworten mit diesem Y-Labyrinth-Test. Canton-S Männer stark zu vermeiden 10% Essigsäure in destilliertem Wasser verdünnt, während sie sich nicht signifikant von 10% Phenylessigsäure vermeiden. Diese Tests werden auf 10 Männer pro Wiederholung zusammen in den Ladefläschchen gegeben basiert. Dieses Protokoll kann manchmal zu großen Standardfehler des Mittelwerts führen. Bei Bedarf ist es möglich, diesen Nachteil, indem 20 Männer pro Wiederholungen statt nur 10. Mathematisch kann die Wahl von einem Individuum hat ein geringeres Gewicht auf der Index-Wert für einen größeren Stichprobenumfang zu reduzieren.
Abbildung 1. Männlich Riech Antwort mit einem Y-Labyrinth-Setup ermittelt. A) Split-Gerät. B) montiertGerät. C) Set-up in der Arbeitsbedingung unter weit-rotes Licht. D) Quantifizierung der männlichen Riech Antworten zu Essigsäure (AA) oder Phenylessigsäure (PAA), die beide in destilliertem Wasser verdünnt (10% v / v) (N = 11, mit einer Gesamtfläche von 110 Linie). Die statistische Analyse wurde unter Verwendung eines t-Tests Vergleichen der Daten auf 0 gesetzt. 0 keine Präferenz. Ein negativer Wert zeigt eine Abneigung gegen die Geruchsstoff und ein positiver Wert eine Attraktion. **** P <0,0001; ns:. nicht-signifikant (p = 0,1680) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Unsere Y-Labyrinth-Protokoll basiert auf einem zuvor beschriebenen Protokoll 9 basiert. Allerdings stellen wir zwei wesentliche Unterschiede. Erstens verwenden wir engen Pipettenspitzen, um die Fliegen von der Rückkehr zu verhindern, wenn sie sich entscheiden, in der Ampulle mit dem Lösungsmittel oder Lösungsmittel plus den Geruchsstoff geben. Diese schmalen Spitzen sind auch nützlich, um die Geruchsstoffdiffusion in der Y-Labyrinth begrenzen. Zweitens verwenden wir ein kleiner Laden Fläschchen, um die Fliegen zu zwingen, in der Y-Labyrinth betreten. Es ist wichtig, eine hohe Beteiligung dieser entfernt haben (80% bis 100% nach 24 h; Simmonet, persönliche Mitteilung).
Das Y-Labyrinth-Test stellt ein effizientes Test zu chemosensorischen Antworten in Drosophila zu evaluieren. Der Kontext des Tests, einschließlich Stress auf den Fliegen (von Luftströmung, die Manipulation der Fliegen während des Ladeschrittes, etc.) ist möglicherweise ihre olfaktorischen Reaktionen beeinflussen. Diese Umweltprobleme sind kritisch und könnte erklären, zumindest teilweise, warum unterschiedlicheStudien konnten verschiedene Verhaltensergebnisse haben. Zum Beispiel Essigsäure wird gezeigt, abstoßend in einigen Bedingungen 4,11, während es attraktiv ist, in anderen 12. Daher ist es wichtig, alle diese Parameter so weit wie möglich zu kontrollieren.
Eine mögliche Einschränkung dieses Y-Labyrinth-Test ist der Kontext für künstliche Fliegen, da sie in einer verriegelten Gestaltung gehalten. Zusätzlich haben Fliegen in engen Passagen geben, die belastend für sie sein könnte. Der Experimentator hat dies bei der Interpretation der Daten zu erinnern.
Um diese möglichen Einschränkungen zu umgehen, könnten andere ergänzende Geruchstests durchgeführt werden, um die Auswirkungen von Geruchsstoffen auf das Verhalten bestätigen. Diese Tests umfassen T-Labyrinthe 4, 4 Feld-arena-Assays 7, 8 oder Windkanälen. Allerdings sind diese Tests künstlichen Umgebungen nutzen auch für Fliegen, die mehr oder weniger stressig sein könnte. Beispielsweise während der T-Labyrinth-Tests entfernt sind halloghly betont, da sie während des Lade Schritt 4 geschüttelt werden. , Ein Vorteil eines T-Labyrinth im Vergleich zu diesem Y-Labyrinth-Test ist jedoch, dass Fliegen müssen innerhalb von Minuten zu wählen, wo zu gehen (an den Geruchsstoff oder Lösungsmittel). Deshalb ist die Y-Labyrinth Reaktion stellt eine "reflektierende" Wahl, während die Ergebnisse mit einem T-Labyrinth erhalten stellen eine Reflex Wahl in einer sehr stressigen Zustand.
Endlich eine mögliche Verbesserung des Y-Labyrinth-Test wäre die Glasrohre entlang mit dem Aufwärts-statt Plastik für einige Komponenten (Laderohr, Stecker, Pipettenspitzen) eingestellt. Diese Kunststoffteile können in der Theorie einen Geruch, da sie aus Benzin hergestellt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken 4 anonymen Gutachtern für ihre Arbeit, das Manuskript zu verbessern. Wir danken dem Centre National de la Recherche Scientifique für die finanzielle Unterstützung, um MBG und YG, und der Université de Bourgogne und der Französisch Ministerium für Forschung, um MMS. Research in YG Labor wird von der Europäischen Forschungsrates (ERC Starting Grant, GliSFCo-311403), der Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), des Conseil Régional de Bourgogne (Faber) und dem CNRS finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y.
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
