Summary
Biz Y-labirent testi kullanılarak Drosophila davranışı üzerindeki koku etkisini ortaya çıkarmak için bir seçim testi sunuyoruz.
Abstract
Hayvanlar onların hayatta kalmasını sağlamak için çevreden sinyalleri tespit esastır. Bu amaçla, onlar doğrudan temas yoluyla veya daha uzun mesafeden etkili bir uçucu moleküle yanıtı temsil olfaction, yoluyla, bu vizyon, mechanoreception, işitme ve tat ile chemoperception gibi çevresel ipuçlarını kullanın. Uçucu kimyasal moleküller tehlike, bir besin kaynağı, ya da bireyler arasında iletişim kurmak için saptanmasında çok hayvanlar için çok önemli sinyallerdir. Drosophila melanogaster olfaction hücresel ve moleküler temeli keşfetmek bilim adamları için en yaygın biyolojik modelleri biridir. Bu küçük böcek koku yeteneklerini vurgulamak amacıyla, klasik fareler ile birlikte kullanılan Y-labirenti testine göre bir tadil edilmiş bir seçim protokol açıklar. Y-labirentine ile elde edilen veriler daha iyi hayvanlar sürekli değişen çevre ile nasıl başa anlamak için değerli bilgiler verir. Biz çalışmak için bir adım-adım protokolü tanıtmakBu Y-labirent testi kullanılarak sinek keşif cevabına koku etkisi.
Introduction
Tat veya koku duyusunun aracılığıyla kemo-alış hayvan hayatta kalmak için önemli bir duyusal yöntemidir. Bu hayati bir tehlike veya gıda kaynaklarının tespiti için gerekli ipuçlarını, yanı sıra sosyal etkileşimleri için verir. Aynı zamanda onların üreme için gerekli bir seks partneri bulmak için hayvanlar olur. 20 yılı aşkın için, Nobel ödülü "odorant reseptörleri ve koku alma sisteminin organizasyonunun buluşları için" 2004 yılında Richard Axel ve Linda Buck tarafından çalışma kazanan dahil olmak üzere yoğun araştırma, moleküler ve hücresel üsleri ortaya çıkarmak için yapılmıştır olfaction 1,2.
Koku algısını incelemek için bilim adamları için favori hayvan modellerinden biri olan D. melanogaster. Bu böcek memeliler ile benzer hücresel ve moleküler koku kodlama stratejisi paylaşıyor. Bilimsel topluluk bu meyve sineği koku rolünü incelemek için çeşitli davranış paradigmaları kullanır. Bu testler, çok modlu courtshi gibi tahliller bulunmaktadırolfaction dahil olmak üzere çeşitli duyu modaliteleri, erkek iltifata 3 ortaya çıkarmak için önemli olan p testleri. Diğer deneyler, aynı zamanda daha özel olarak koku rolünü mücadele için geliştirilmiştir; bu T-labirentine, Y-labirentine, tuzak deneyleri, dört alan arenalarda ve rüzgar tünelleri 4,5,6,7,8 içerir.
Bu yazıda D. kullanarak sağlam koku yanıtları sağlayan basit bir modifiye Y-labirent testi, mevcut melanogaster. Bizim set-up daha önce açıklanan yönteme 9 aksine son ipuçlarını kullanır. Böylece, Y-labirenti iki avantajı vardır. Sinek kendi seçimini yapmış kez Birincisi, bu sistemde herhangi bir geri dönüş önler. İkinci olarak, Y-labirent tüm alanlarında koku değişimini sınırlar. Drosophila genellikle odorant doymasını önlemek için kullanılan hava akımına karşı çok hassas olduğu için, bu son avantaj önemlidir. Bir hava akışı ile deneysel set-up ayarlamak için zaman ve maliyet alıcı olacaktır. Bu nedenle, Y-labirenti deneyi temsil efşır ve Drosophila koku performansını test etmek için hızlı yolu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Başlamadan Önce
- Istikrarlı ve sağlam davranışsal fenotipleri taşıyan bir isogenized referans stok kullanın. Tüm potansiyel kontrolleri heterojen plan alellerini taşıyabilir, çünkü bu stok seçimi için genel bir kural yoktur.
- Sonraki adımlar için gerekli olan her stok geri çaprazlama için bu kontrol suşu kullanın. Bu adım, tipik olarak 2-3 geriye dönük melezleştirme izogenik referans erkeklerde 5 (mümkün çaprazlama homolog kromozomlar arasındaki izin vermek için), tek bir bakire dişi, en az 5 ardışık çarpılar ile temsil edilir. Bu adım, farklı sinek stoklarının arasındaki genetik arka planı homojenize edilmesi önemlidir.
- 25 ° C'de 12 saat ışık / karanlık döngüsünde antibiyotik (% 0.4 metil para-hidroksi-benzoat) ile tamamlanır standart mısır unu, (% 9), maya (% 10) ve agar ortamında (% 1.5) üzerinde Drosophila stokları korumak ° C.
- Sıcaklık-kontrollü bir odaya uzak kırmızı ışık altında (25 ° C) içerisinde kimyasal-duyusal deneyler elde(Görsel ipuçlarının katkısını ortadan kaldırmak için, ve kimyasal duyusal sinyallere odaklanmak). Düzenli olarak her deney arasındaki bölgeyi havalandırmak için odanın havasını yenilemek.
Bir Y-labirenti Assay kullanılarak, 2. Koku Response
- Test edilmeden önce ıslak kağıt havlu ihtiva eden cam tüpler içinde 25 ° C'de 16-18 saat boyunca sinekler açlıktan.
- İki cam şişeler için ve daha küçük plastik bir şişe (şişe yükleme) bir Y-şekilli konektör tarihi. Üç şişelerine konektörü bağlantı ve sıkıca kapatılmış bir Y-labirent elde etmek için köpük stoper geçmesine 1 ml pipet ipuçlarını kullanın. İki "tuzak" şişeleri oluşturmak için, ve bir pipet büyük bir ucu "yükleme" oluşturmak için (onun kararını sonra sinek herhangi bir geri dönüş önlemek için ~ 2 mm çap) iki pipet ipuçları dar uçlarını kesin boru (Şekil 1A).
- Sadece "tuzak" şişeleri (Şekil 1B) bağlamadan önce, bir ~ 6 mm çaplı filtre kağıdı yerleştirinHer flakon. Bir filtre kağıdı üzerinde odorant çözeltisi 40 ul, ikinci filtre kağıdı üzerinde karşılık gelen çözücünün 40 ul ekle.
- "Yükleme" şişenin içine on 4-9 günlük eski sinekler tanıtmak. Bu davranış 10 üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğundan, bu transfer sırasında CO 2 anestezi kullanmayın. Aksine buz üzerinde kısa soğutma kullanın. Anestezi sinekler doğru manipülasyonu mümkün olduğunca konularda baskısını sınırlandırmak için önemlidir.
- Görsel uyaranlara mümkün olduğunca kaçınmak için (mümkünse ısı kaynağı sınırlamak için LED ampuller kullanarak) uzak-kırmızı ışık altında, 25 ° C'de Y-labirent bir dizi test gerçekleştirin. (; Şekil 1C solda veya sağda Odorant içeren tüp ve yükleme tüp ön veya arka) Y-labirentine yönelimleri alternatif için dikkatli olun.
- Sinekler için birkaç saat odorant ya da çözücüyü içeren tuzak şişede girmek izin verin. Participati geliştirmek için 24 saat sonra, sinekler Toplamıfazla% 80 kadar ve maksimum koku indeks değeri (Simonnet, kişisel iletişim) sağlamak.
- - / Yüklü sineklerin sayısı (solvent tüp numara koku tüp içinde sayı): aşağıdaki formül kullanılarak elde edilen koku indeksi hesaplayın.
- Yıkama Y-labirent set-up şöyle: gecede RBS 35 MD sökülmüş set-up ıslatın. Iyice musluk suyu ile yıkayın. Sonunda deiyonize su ile durulayın ve kurumasını.
Verilerin 3. İstatistiksel Analiz
- Veriler ve çeşitli değişkenlere bağlı olarak, bir t-testi, tek-yönlü ANOVA ya da bir iki-yönlü ANOVA gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1B, bu Y-labirenti tahlili kullanılarak iki temsili tepkilerini gösterir. Önemli ölçüde% 10 fenilasetik asit kaçının oysa Canton-S erkek güçlü, damıtılmış su içerisinde seyreltilmiş,% 10 asetik asit kaçının. Bu deneyler yükleme şişeler içinde bir araya geldiklerinde her tekrar için 10 erkek dayanmaktadır. Bu protokol, bazen büyük ortalama standart hata yol açabilir. Gerekirse, bunun yerine, sadece 10. Matematiksel olarak, bir bireyin seçimi daha büyük bir numune sayısı için indeks değeri daha düşük bir ağırlığa sahiptir ve tekrardan başına 20 erkek kullanarak bu dezavantajı azaltmak mümkündür.
Şekil 1. Y-labirent set-up ile değerlendirilen Erkek koku yanıtı. A) Bölünmüş cihaz. B) Montajlıasetik asit (AA) ya da fenilasetik asit (PAA) doğru erkek koku tepkilerin uzak-kızıl ışık altında çalışır durumda cihaz. C) Set-up. D) miktarının (damıtılmış suda seyreltildi hem% 10 v / v) (N = 11) 110 sineklerin toplam temsil. İstatistiksel analiz için 0 verileri karşılaştırarak bir t-testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 0 tercih yok demektir. Negatif bir değer koku verici bir kaçınma ve pozitif bir değer, bir cazibe gösterir. ****: P <0.0001; ns:. anlamlı olmayan (p = 0.1680) , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim Y-labirenti protokol, önceden tanımlanmış bir protokole 9 dayanmaktadır. Ancak, iki önemli farklılıklar tanıtmak. İlk olarak, bu çözücü veya çözücü artı odorant ihtiva eden şişeye girmek için karar bir kez geri gelen sinekleri önlemek için dar bir pipet uçları kullanın. Bu dar ipuçları da Y-labirentte odorant difüzyon sınırlamak için yararlıdır. İkinci olarak, Y-labirent girmek için sinekleri zorlamak için daha küçük bir yükleme şişeyi kullanın. Bu sinekler bir katılımın yüksek olması önemlidir (24 saat sonra% 100% 80; Simonnet, kişisel iletişim).
Bu Y-labirenti deney Drosophila kimyasal-duyusal tepkilerini ölçmek için etkili bir testi temsil eder. (Vb hava akışı, yükleme aşaması sırasında sinekler manipülasyon) ve sinekler üzerinde stres gibi testinin bağlam potansiyel koku alma tepkileri etkilemektedir. Bu çevre sorunları kritik olan ve en azından kısmen neden farklı, açıklayabilirçalışmalar farklı davranışsal sonuçlar olabilir. Örneğin asetik asit diğerleri 12'de çekici ise, bazı durumlarda 4,11 bölgesindeki itici olduğu gösterilmektedir. Bu nedenle mümkün olduğu kadar bu parametrelerin her kontrol etmek çok önemlidir.
Bu Y-labirent deneyinde olası bir sınırlama kilitli bir tasarım tutulan beri sinekler için yapay içeriğidir. Ayrıca, sinekler onlar için stresli olabilir ki, dar geçitlerde girmek zorunda. Deneyci verileri yorumlayarak bu hatırlamak zorundadır.
Bu olası sınırlamaları aşmak için, diğer tamamlayıcı koku testleri davranışı üzerindeki koku etkisini doğrulamak için yapılabilir. Bu testler T-labirentine 4, 4 saha-arena deneyleri 7 veya rüzgar tünelleri 8 içerir. Bununla birlikte, bu testler aynı zamanda daha fazla veya daha az stresli olabilir ki, sinekler suni ortamlar kullanmaktadır. Örneğin, T-labirent testler sırasında sinekler hi vardıronlar yükleme adım 4 sırasında sarsılmış beri ghly vurguladı. Bununla birlikte, bu Y-labirenti deneyinde göre bir T-labirent bir avantajı, sinekler (koku verici madde veya çözücüye) gitmek burada dakika içinde seçmek zorunda olmasıdır. Bu nedenle Y-labirent tepki T-labirent ile elde edilen sonuçlar oldukça stresli bir durumda bir refleks seçim temsil ederken, bir "yansıtıcı" seçimi temsil eder.
Nihayet bu Y-labirent deneyinde olası bir gelişme tüm boyunca cam tüpler kullanmak olacaktır yerine bazı bileşenlerin (yükleme tüp, konnektör, pipet uçları) için plastik kurmak. Onlar petrol yapılır beri bu plastik parçalar, teoride, bir koku olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz el yazması geliştirmek için kendi iş için 4 anonim yorumcular teşekkür ederim. Biz MBD ve YG için mali destek için Centre National de la Recherche SCIENTIFIQUE teşekkür ve MMS Université de Bourgogne ve Araştırma Bakanlığı Fransız. YG Araştırma laboratuvarında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC Grant, GliSFCo-311403 Başlangıç), Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), Conseil Régional de Bourgogne (Faber) ve CNRS tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y.
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
