Summary
الخلايا الجذعية (DCS) تفرز IL-1β ردا على اعتراف TLR8 من البيورين الاصطناعية، R848، تليها NLRP3 تفعيل inflammasome مع nigericin، وبالتالي، IL-1β يمكن استخدامها لقياس النشاط NLRP3 inflammasome. وتستخدم الخلايا تلطيخ خلوى، immunoblotting، وELISA لقياس بدقة NLRP3 inflammasome فتيلة والتنشيط عبر IL-1β التعبير.
Abstract
العمليات الالتهابية الناجمة عن إفراز الإنترلوكين (IL) -1 السيتوكينات الأسرة من قبل خلايا المناعة يؤدي إلى التهاب المحلية أو النظامية، وإعادة عرض الأنسجة وإصلاحها، ومراقبة فيروسية 1 و 2. انترلوكين 1β عنصرا أساسيا من الاستجابة المناعية الفطرية ويساهم في القضاء على مسببات الأمراض الغازية في حين منع إقامة العدوى المستمرة 1-5.
Inflammasomes هي منصة الإشارات الرئيسية لتفعيل انترلوكين 1 تحويل انزيم (ICE أو كاسباس 1). وinflammasome NLRP3 يتطلب اثنين على الأقل في البلدان النامية إلى إشارات تسبب إفراز IL-1β 6. الموالية للIL-1β البروتين التعبير محدودة في يستريح الخلايا؛ لذا لا بد من الإشارة فتيلة لالنسخ IL-1β والبروتين التعبير. والإشارة الثانية لمست من خلال النتائج NLRP3 في تشكيل البروتين متعددة NLRP3 inflammasome. قدرة الخلايا الجذعية المسؤولة لد للإشارات المطلوبة لإفراز IL-1β يمكن اختبارها باستخدام البيورين الاصطناعية، R848، الذي تشعر به TLR8 في الوحيدات الإنسان مشتق الخلايا الجذعية (moDCs) إلى خلايا رئيس، تليها تفعيل inflammasome NLRP3 مع السم البكتيري و حامل الأيون البوتاسيوم، nigericin.
ويتم إنتاج البلدان النامية الوحيدات المستمدة بسهولة في الثقافة وتوفير أكثر بكثير من الخلايا النقية البلدان النامية النخاعي الإنسان. طريقة المقدمة هنا يختلف عن المقايسات inflammasome الأخرى في أنه يستخدم في المختبر الإنسان، بدلا من الماوس مشتقة، البلدان النامية وبالتالي السماح لدراسة inflammasome في مرض الإنسان والعدوى.
Introduction
مطلوب تفعيل نظام المناعة الفطرية لتوجيه الاستجابات المناعية التكيفية خلال العدوى والمرض، والتطعيم 7. الخلايا الجذعية هي أقوى مستضد تقديم الخلايا في الجهاز المناعي الفطري؛ فهي متخصصة لامتصاص المستضدات، والهجرة إلى الغدد الليمفاوية، وتفعيل السذاجة CD4 + CD8 + ولحل الخلايا (خلايا تي) 8-10. لتمكين الكشف الممرض السريع نظام المناعة الفطرية يستخدم العديد من سلالة الجرثومية ترميز مستقبلات التعرف على الأنماط (PRR) التي تعترف الممرض الحفظ الزخارف المستمدة أو المضيف المستمدة من علامات الإجهاد الخلية والضرر. حصيلة مثل مستقبلات (TLRs) هي الغشاء ملزمة مستقبلات التعرف على الأنماط التي تعترف بعض الممرض phagocytized خارج الخلية الجزيئية المرتبطة أنماط (PAMPs) والخطر المرتبطة أنماط الجزيئية (DAMPs). على النقيض من ذلك إيماءة مثل مستقبلات (NLRs) هي عصاري خلوي والرد على مجموعة متنوعة من PAMPs وDAMPs. إيماءة مثل مستقبلات إعادةيقدم خط الدفاع الثاني ضد مسببات الأمراض التي تهرب من سطح الخلية وخنازير التقامي. تفاعل الممرض المشتقة، أو "الخطر" المرتبطة بها، مع عوامل TLR وNLR بروابط يؤدي إلى حالة من النضج العاصمة مما أدى إلى زيادة التفاعل مع DC الخلايا المناعية الأخرى، وتعزيز تي خلية وتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية 11.
انترلوكين 1β هو عنصر حاسم في الدفاع المضيف ضد العدوى. عند التحقق من الكائنات الحية الدقيقة، وproinflammatory سايتوكاين للغاية، IL-1β، ويفرز ويعمل بمثابة جاذبة الكيماوي والمنشط للخلايا المناعية الفطرية والتكيفية. في الجسم الحي IL-1β مسؤولة إلى حد كبير عن استجابة المرحلة الحادة بما في ذلك الحمى والتهاب خلوى التوليف 12.
معظم NLRs تحتوي على C محطة يسين الغنية تكرار المجال الذي يعتقد أن تعمل في مجال الاستشعار يجند، وهو المجال النوكليوتيدات ملزم المركزية (NACHT) وهذا هو IMPOrtant لNLRP3 oligomerization، وN محطة مجال المستجيب (PYD في NLRP3) التي تتوسط نقل الإشارة إلى أهداف المصب من خلال البروتين البروتين التفاعلات. ويعرف البروتين NLRP3 مجمع inflammasome معظم درس بشكل مكثف. هذا البروتين هو عضو في الأسرة NLR، ولديه القدرة على تشكيل متعددة معقدة البروتين الجزيئي يتألف من NLRP3، وPYCARD البروتين محول (المعروف أيضا باسم ASC)، وICE. عند تفعيل inflammasome PYCARD بربط NLRP3 N المجالات محطة وتجند ICE عبر تفعيل كاسباس والمجال التوظيف (CARD) المجالات. يتم إنشاء انترلوكين 1 تحويل انزيم في البداية باعتبارها زايموجين تحتوي على بطاقة عزر في دورته N-محطة. نتائج تشكيل Inflammasome في جلب اثنين من جزيئات ICE بما فيه الكفاية وثيقة للحث على تنشيط ذاتي التحفيز. مجمع inflammasome هو ضروري لتفعيل ICE الأمر الذي يتيح لها تحويل حشوية الموالية للIL-1β إلى أن تنضج خلوى.
إفراز الناجح لIL-1β في البلدان النامية يتطلب الاستشعار عن اثنين مختلفة ومستقلة إشارات الخطر. الأولى، TLR الاستشعار من PAMPs، DAMPs، أو إشارات خلوى (TNFα أو IL-1β) يؤدي إلى upregulation من حشوية الموالية للIL-1β التعبير البروتين. مطلوب الثاني، غالبا ما تكون مختلفة، إشارة لتشكيل مجمع inflammasome المنبع من ICE النضج. وهناك عدد قليل inflammasome تحفيز الإشارات تشمل البكتيريا المسام غشاء تشكيل السموم (مثل nigericin)، الليزوزومية تعطيل البلورات (مثل بلورات أحادية الصوديوم راتي، جامعة ولاية ميشيغان)، وATP خارج الخلية. آلية المنبع مما يؤدي إلى تفعيل NLRP3 inflammasome بهذه تفعيل متنوعة غير واضح. دراسات التحقيق يشير المنبع من تشكيل inflammasome يقترح أن الأحداث داخل الخلايا، مثل تحريض نقص بوتاسيوم الدم أو أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) تنشيط بشكل غير مباشر inflammasome 13-28.
بين تفعيل الفيروسية مختلفة من inflammasome NLRP3 هي إنفلونزا، التي تنص بأوراسكوم تليكوم القابضة إشارة الابتدائية والثانوية المطلوبة لإفراز IL-1β 3، 29-33. باستخدام الماوس نماذج NLRP3 خروج المغلوب تبين أن إفراز IL-1β في البلدان النامية هو NLRP3 تعتمد 32. بالإضافة إلى ذلك، جذبت NLRP3 الفئران خروج المغلوب أقل الكريات البيض إلى موقع الإصابة وشهدت أعلى معدل وفيات 2، 5. وتشير ورقتي الأخيرة آلية لتفعيل NLRP3 inflammasome خلال عدوى فيروس الأنفلونزا؛ أولا، من خلال الاعتراف فتيلة من الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة TLR7 أو TLR8 (اعتمادا على TLR التعبير عن الخلية الاستجابة) أو من خلال الاستشعار من البكتيريا المتعايشة قبل غيرها TLRs للحث على حشوية التعبير الموالية للIL-1β، تليها الإشارة الثانية، وتفعيل NLRP3 تشكيل inflammasome بواسطة البروتين الفيروسي القناة الايونية M2 على شبكة جولجي عبر 33، 34. في الخطوة الأخيرة، مما اثار من inflammasome NLRP3 يتم تحقيق ذلك من خلال اضطراب في الخلايا الأيونية <م> الوسط مما يؤدي إلى إنتاج ريوس، الذي هو، ببساطة، تشعر به NLPR3 كإشارة لتشكيل inflammasome. ومع ذلك، فإن آلية دقيقة من inflammasome المنبع تفعيل النشاط ICE خلال العدوى بالأنفلونزا لا يزال غير واضح.
يصف هذا العمل تقنية قيمة لدراسة inflammasome NLRP3 في moDCs الإنسان التي يمكن استخدامها كأساس لإجراء مزيد من التحقيق في مسار الكامنة DC-تستند إفراز IL 1β استجابة لTLR8 ربط مع R848 تليها تفعيل inflammasome بواسطة بئر المنشط المعروف من NLRP3، nigericin. أشكال مختلفة من هذه الطريقة يمكن استخدامها مع أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر: حيدات، الضامة، DC مجموعات فرعية أخرى، والخلايا الظهارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: يتم الحصول على عينات البحوث وتخزينها لأبحاث بموافقة الجهات المانحة. يجب أن تكون مشفرة جميع العينات أو مجهولة المصدر قبل استخدامها. هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية لدينا مجلس المراجعة المؤسساتي.
1. تمايز الإنسان المحيطية وحيدات الدم الى الخلايا الجذعية المشتقة الوحيدات.
ملاحظة: المعاطف الشهباء الإنسان بمثابة مصدر خلايا الدم المحيطي الإنسان (PBMCs) والتي تم الحصول عليها من مركز نيويورك الدم (نيويورك، نيويورك). المتبرعين بالدم هم من المتطوعين الأصحاء. يبدأ الإجراء 5 أيام مع الطلاء من خلايا الدم المحيطية الإنسان (PBMCs) على زراعة الأنسجة قوارير 35،36. اختلافات ملحوظة من البروتوكولات نشرت ما يلي:
- استخدام 225 سم 2 غير مولد للحمى القوارير زراعة الأنسجة البوليسترين مع قبعة مرشح التمسك مجموعه 2X10 8 PBMCs في القارورة بدلا من 10 سم لوحة البوليسترين زراعة الأنسجةق (58 سم 2) (الخطوة 1).
- إعداد وسائل الاعلام مع 5٪ مجمعة مصل الإنسان (PHS؛ 30 مل) في 500 مل RPMI-1640 + L-الجلوتامين، عازلة 5 مل 1 M HEPES، و 1.4 مل 50 ملغ / مل جنتاميسين (5٪ PHS وسائل الإعلام)، يليه الترشيح من خلال تصفية 20 ميكرومتر. إضافة ما مجموعه 50 مل 5٪ PHS وسائل الإعلام في 225 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة.
- غسل الخلايا انضمت ثلاث مرات مع 25 مل الطازجة RPMI-1640. هزة بقوة لمدة 5 ثوانى أثناء كل غسل ونضح الخلايا غير ملتصقة (الخطوة 4).
- إضافة 190 ميكرولتر من 400 وحدة دولية / ميكرولتر IL-4 و 380 ميكرولتر من 100 وحدة دولية / ميكرولتر GM-CSF في قارورة (الخطوة 3) في اليوم 0، 2، و 4. يوم 0 تعرف بأنها ومطلي من PBMCs يوم البداية في الخطوة 1 (الخطوة 8).
- يوم الحصاد 5 moDCs بتركيز الخلايا 1x10 6 / مل (الخطوة 15).
- استخدام moDCs على الفور في حالة الراحة الخاصة بهم. الخطوات 17-22 تتم أبدا. ملاحظة: يجب أن تتم معالجة عينات في أقرب وقت ممكن بعد جمع للحصول على أفضل النتائج.
- moDCs قسامة في تركيزاتنشوئها من الخلايا 2X10 5 / جيد (200 ميكرولتر / جيد من الخلايا 1x10 6 / مل) في 96 لوحة جيدا القاع جولة (لطخة غربية، ELISA، نظام مراقبة الأصول الميدانية) أو الصعود إلى chamberslide بولي-L-يسين المعالجة (المجهر) للتجريب . ملاحظة: هناك على الأقل 4 الشروط: unstimulated تماما (المراقبة السلبية)، فتيلة فقط، وتفعيل فقط، وفتيلة تليها التنشيط. يمكن توسيعها لتشمل الضوابط الظروف مخفف لR848 وnigericin اذا شئت. إذا كان فحص المصب هو ICS، التكرارات ضرورية لعناصر نمط إسوي.
2 فتيلة Inflammasome - إشارة 1
- إعادة مجفف بالتجميد R848 في DMSO وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تمييع الأسهم تعمل على RT مع RPMI-1640.
- إضافة R848 بتركيز نهائي 10 ميكرومتر أن تخصص الآبار لمدة 18 ساعة. خلايا مكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
3 تفعيل NLRP3 Inflammasome - الإشارة2
- إعادة nigericin مجفف بالتجميد في الإيثانول وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تمييع الأسهم تعمل على RT مع RPMI-1640 قبل إضافة إلى الظروف الملائمة.
- إضافة nigericin بتركيز نهائي 20 ميكرومتر والعودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 6 ساعة. تحدث أية خطوات غسل بين فتيلة وأثناء التنشيط. ملاحظة: إفراز IL-1β وبنسبة حضور ionophores الكالسيوم، brefeldin A، مونينسين، نيتروفينول، أو الكربونيل السيانيد chlorophenylhydrazone 37، 38. لذلك، لا ينصح بإضافة هذه المثبطات إفرازية عند تحليل فتيلة inflammasome أو النشاط لأنه سوف يغير إفراز IL-1β.
4. IL-1SS جمع العينات
- أجهزة الطرد المركزي لوحة مع الخلايا وsupernatants في 974 x ج لمدة 3 دقائق.
- دون الإخلال بيليه الخلية، ونضح طاف ونقلها لكماeparate القاع جولة لوحة من أجل قياس إفراز السيتوكينات من supernatants. ملاحظة: Supernatants يمكن تخزينها مؤقتا في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
- غسل الكريات الخلوية ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X في 974 x ج لمدة 3 دقائق لإزالة أي خارج الخلية IL-1β من العينات الخلوية. ملاحظة: عند غسل الكريات خلية من 96 لوحة جيدا، وإزالة يغسل السريع لوحة انعكاس إلى بن جمع وذلك لعدم إزعاج العينة.
5. قياس IL-1SS من الخلوية وطاف عينات
- الخلايا تلطيخ خلوى (ICS): يوصف بروتوكول ICS أدناه 39، 40. ملاحظة: لا تعليق الخلايا إذا كان الفحص المجهري هو المصب. يجب أن تتم جميع يغسل والتطلعات من دون إزعاج طبقة الخلايا / بيليه (اعتمادا على الفحص المصب).
- إضافة 100 ميكرولتر من 5٪ وسائل الإعلام PHS في آبار مناسبة. إضافةحجم مناسب (حوالي 1 μl/2x10 5 خلايا، أو 1 ميكرولتر / جيد) من fluorescently المسمى α-α-CD11c وو CD14 (علامات النمط الظاهري؛ استنساخ B-ly6 وMφP9، على التوالي) أو isotype السيطرة على الخلايا لمدة 10 دقيقة في RT في الظلام.
- يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X في 974 x ج لمدة 3 دقائق.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام.
- وقفة نقطة: يغسل مع 100 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني 1X 974 x ج لمدة 3 دقائق وتخزينها في 4 درجات ثاني / N في برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 100 ميكرولتر من العازلة permeabilization إلى الخلايا لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: يتكون العازلة permeabilization من برنامج تلفزيوني 1X مع 0.3٪ تريتون X-100، و 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) لpermeabilization. لا تخل الخلايا الملتصقة عند الفحص المجهري هو المصب.
- إضافة حجم مناسب (حوالي 62 نانوغرام antibody/2x10 5 خلايا، أو ما يقرب من 2.5 ميكرولتر / جيد) من α-IL-1β-FITC (استنساخ 8516) أو isotype السيطرة ل2 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- غسل الخلايا ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من العازلة permeabilization في 974 x ج لمدة 3 دقائق في الظلام.
- اختياري: وصمة عار مع دابي، إضافة مرس، ووضع ساترة بلطف على أعلى شريحة زجاجية. تسمح مرس لعلاج O / N قبل التقاط الصور المجهري.
- الحصول على البيانات من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية أو المجهري. ملاحظة: مقارنة نمط إسوي لكل حالة لتلطيخ المناسبة عند تحليل بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية أو المجهري.
- نظام مراقبة الأصول الميدانية: الحصول على عينة واحدة في كل مرة. تعيين FSC / بوابة SSC على الخلايا الحية، تليها تبوب على CD11c و+ CD14 - خلايا قبل تحليل السكان moDC الموالية للIL-1β تلطيخ.
- المجهر: تعيين وقت التعرض باستخدام عينة تلطيخ إيجابية - R848 المعالجة. استخدام دابي + المؤيدة للIL-1β + + ودابي الموالية للIL-1β - لتحديد نسبة المؤيدة للIL-1β + moDCs معربا.
- SDS-الصفحة: يتم تنفيذ Immunoblotting للكشف الموالية للIL-1β. ملاحظة: هذه التقنية هو موضح أدناه يجمع بين تقنية القياسية immunoblotting، الانحدار 4-20٪ هلام بولي أكريلاميد، والفلورسنت أو chemiluminescent كشف 41، 42.
- ليز الخلايا مباشرة في 10 ميكرولتر تغيير طبيعة تحلل العازلة (5 ميكرولتر ميكرولتر العازلة β-mercaptoethanol/950 Laemmli عينة تليها تمييع 01:01 مع العازلة تحلل الخلية). نقل المحللة إلى 1.5 مل أنابيب إيبندورف.
- المحللة الحرارة على طبق جاف لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية.
- تدور المحللة في 20،800 x ج على minicentrifuge لمدة 1 دقيقة على التركيز على حجم السائل. نقطة وقفة: يمكن تجميد العينات في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير.
- تحميل الحجم الإجمالي على هلام بولي أكريلاميد. تشغيل 140 V من خلال مربع هلام لحوالي 1 ساعة، أو حتى تدير الجبهة صبغ قبالة الجزء السفلي من هلام.
- نقل البروتين من هلام بولي أكريلاميد الصعود إلى membr PVDF Immobilon-FLانو لمدة 90 دقيقة في 100 خامسا كتلة الغشاء مع 5٪ BSA في تريس مخزنة المالحة / 0.1٪ توين 20 (TBS-T) لمدة 1 ساعة. ملاحظة: PVDF Immobilon-FL هل الأفضل للاستخدام مع كشف الفلورسنت. ينصح الغشاء مع تكوين مختلف عن تقنيات الكشف الأخرى لزيادة إشارة إلى نسبة الخلفية.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية والثانوية في 10 مل من 5٪ BSA / TBS-T. أداء حضانات الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات ثاني / N حين تهتز والضد الثانوية في RT لمدة 1 ساعة في حين تهتز.
- يغسل الغشاء 3 مرات مع TBS-T لمدة 5 دقائق في حين تهتز بين حضانات الأجسام المضادة الأولية والثانوية، ومرة أخرى بين حضانات الثانوية والتصوير. ملاحظة: يمكن أن يتم الكشف عن العصابات باستخدام الفلورسنت أو الكشف chemiluminescent. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للكشف.
- إليسا: عينات التي تم تجميدها لتخزين حاجة لكي تتوازن لRT قبل التحليل. تدور باستمرار العينات في جهاز للطرد المركزي لتعزيز condens طافأوجه. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لقياس IL-1β. ملاحظة: في هذا البروتوكول يقاس IL-1β على وجه التحديد؛ ومع ذلك، وقياس وقت واحد من TNFα، IL-6، والمناعية خلوى IL-10 ومعبي ضمان الظروف الملائمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذه التقنيات قياس TLR8 فتيلة مع R848. الخلايا تلطيخ خلوى للالموالية للIL-1β يسمح للفحص المجهري ونظام مراقبة الأصول الميدانية قراءات من CD14 - CD11c و+ moDCs. كل التقنيات يمكن قياسها كميا نسبة إلى غير معبي، أو يستريح، ومراقبة الخلايا فضلا عن isotype السيطرة (الشكلان 1 و 2). يتم ضرب في المئة من المؤيدة للIL-1β + تلطيخ الخلايا عن طريق الوسيط هندسية من هذه الفئة من السكان لتوفير كثافة الفلورسنت وسيطة (MFI). مؤسسة التمويل الأصغر هي مماثلة لكمية الموالية للIL-1β موجودة في الخلايا تلطيخ إيجابية.
تدابير Immunoblotting الموالية للIL-1β من المحللة الخلية، والتي يتم بعد ذلك كميا نسبة إلى عنصر تحكم الخلوية الداخلية، مثل β-تويولين أو β-الأكتين (الشكل 3). ينبغي للImmunoblotting الموالية للIL-1β في الخلايا nigericin تعامل تكشف عن وجود انخفاض في الموالية للIL-1β. ويكمل هذا من قبلفقط في R848 تليها الزيادة المتزامنة في IL-1β في supernatants، تقاس ELISA، من خلال الظروف nigericin (أرقام 3 و 4). جميع الشروط الأخرى ينبغي أن يؤدي في أي IL-1β خارج الخلية الحالية. التدبير في وقت واحد من السيتوكينات الالتهابية الأخرى، مثل TNFα، IL-10، وIL-6، وضمان أن nigericin هي محددة في التسبب في إفراز IL-1β. مستوى فتيلة حان الوقت (الشكل 3) والجرعة (الشكل 4) يعتمد، استجابة تنعكس في درجة داخل الخلايا الموالية للIL-1β في R848 معبي وخارج الخلية IL-1β (وكذلك TNFα، IL-10، و IL-6) إفراز في جميع الظروف معاملة R848 (الشكل 4).
الشكل 1. السيتوبلازم يتم الكشف الموالية للIL-1β التي كتبها f انخفاض الخلوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. السيتوبلازم يتم الكشف الموالية للIL-1β بواسطة المجهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم الكشف عن الشكل 3. السيتوبلازم الموالية للIL-1β بواسطة SDS-الصفحة.res.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. يتم الكشف يفرز IL-1β بواسطة ELISA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
السيتوكينات الالتهابية هي جزء لا يتجزأ في توجيه الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية لمكافحة العدوى الفيروسية. وقد تبين يفرز IL-1β للزيادة خلال عدوى الأنفلونزا 3، 43، 44. ليست مفهومة تماما الآليات الدقيقة التي يتم من خلالها معالجة هذه السيتوكينات ردا على اعتراف الفيروسي في الخلايا الجذعية البشرية. النخاعي مجموعات العزلة العاصمة مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. يجوز مجموعات العزلة وFAC الفرز عن غير قصد الإجهاد أو تنشيط الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، كثيرا ما يكون هناك كمية كافية من خلايا معزولة عن التجريب. لحسن الحظ، بيولوجيا moDCs الإنسان عن كثب نماذج من أن البلدان النامية النخاعي الإنسان الأساسية في المختبر 45، 46. كل من أنواع الخلايا تتطلب إشارتين، TLR فتيلة وNLRP3 تفعيل، لتحقيق ناضجة إفراز IL-1β. وبالتالي، توفر moDCs ونوع من الخلايا DC نموذج بأسعار معقولة وبسيطة لدراسة والرهانثالثا فهم أهمية ودور inflammasome NLRP3 في صحة الإنسان والمرض.
كشف IL-1β الاستفادة من الأساليب المذكورة هنا يوفر مختلف المناعية بسيطة وفعالة لدراسة الأمراض مع الأمراض المرتبطة التهابات، بما في ذلك العدوى الفيروسية RNA؛ على وجه التحديد، وكيفية قياس IL-1β في مجموعة متنوعة من الطرق ردا على R848 وnigericin التحفيز. TLR منبهات أخرى (مثل بولي (I: C) وLPS) وNLRP3 تفعيل inflammasome (مثل ATP وجامعة ولاية ميشيغان) يمكن استخدامها لقياس هذا النشاط على التحفيز في سياق الأمراض مرض آخر؛ ومع ذلك، قد تحتاج إلى تعديل مرة التحفيز والظروف. ستحتاج أيضا أوقات التعرض كاشف وتركيزات الى تعديلها عند تعديل هذا البروتوكول لاستخدامها في أنواع الخلايا الأخرى والأنواع.
يجب تشغيل جميع الظروف في ثلاث نسخ وزنه الاستجابة بعناية لأغراض مراقبة الجودة؛ ومن الشائع للتقلب المانحة كبيرة في الوجود. الوحيدات المستمدة البلدان النامية هي نوع من الخلايا، وليس خط الخلية، وجود عدم التجانس داخل ثقافة moDC.
ويمكن التأكد من فتيلة مع ICS لالمؤيدة للIL-1β ومقارنة moDCs يستريح إلى حالة R848 معبي. يجب moDCs يستريح لا يؤدي إلى تلطيخ إيجابية. فتيلة يمكن أيضا التصديق عليها من قبل immunoblotting للتعبير عن المؤيدة للIL-1β. نتائج ناجحة فتيلة R848 في إفراز السيتوكينات proinflammatory TNFα، IL-6، والمناعية خلوى IL-10 مع إفراز الحد الأدنى من IL-1β. Inflammasome خلايا تنشيط لا ينبغي أن تظهر زيادة أخرى في TNFα، IL-6، IL-10 وإفراز ولكن سيكون لديك زيادة في تركيزات-IL 1β يفرز مقارنة مع الخلايا unactivated.
الموالية للIL-1β قد يتم الافراج سلبي خلال موت الخلايا نخرية بالتالي المقايسات التوافر البيولوجي قد تكون ذات فائدة. بدلا من ذلك، immunoblotting لا يمكن أن يؤديها على supernatanTS لتحديد الوزن الجزيئي لليفرز IL-1β لضمان النشطة IL-1β هو شكل خلوى يفرز؛ ناضجة IL-1β هو 17 كيلو دالتون في حين أن السلائف هو 31 كيلو دالتون. لقياس IL-1β من supernatants، وتركيز خلية لا بد من تعديلها لتحقيق إشارة إيجابية أعلى من الحد الكشف. ويمكن أيضا أن يقاس كاسباس 1 التنشيط عبر مجموعة متنوعة من الطرق لتحديد التنشيط inflammasome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه اوليفييه Manches، دكتوراه، دافور Frleta، دكتوراه، وميغان أوبراين، العضو المنتدب لدعمهم وردود الفعل. وأيد هذا البحث من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية وأنجزت بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة منح روث L. كيرشتاين خدمة أبحاث الجوائز الوطنية للفردي دكتوراه مسبقا الزمالات (F31) لتشجيع التنوع في مجال البحوث الصحية ذات الصلة (AI089030) وRO1 (AI081848 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12 well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96 well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12% polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| Laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| Human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| Nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| Goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| Donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol - 4 L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
References
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
- Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
- Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
- Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
- Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
- Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. , (2013).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
- Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
- Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
- Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
- Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
- Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
- Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
- Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
- Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. , (2012).
- Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
- Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
- Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
- Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
- Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
- Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
- Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
- Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
- Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
- Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
- Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
- Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
- Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
- Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
- Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
- Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
- Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
- O'Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
- Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
- Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
- Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
- Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
- Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
- Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
- Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
- Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).
