Summary
Dendritische Zellen (DCs) sezernieren IL-1β in Reaktion auf TLR8 Anerkennung von synthetischen Purin, R848, gefolgt von NLRP3 Inflammasom Aktivierung mit Nigericin daher, IL-1β kann verwendet werden, um NLRP3 Inflammasom Aktivität zu messen. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung, Immunoblotting und ELISA werden verwendet, um NLRP3 Inflammasom Grundieren und Aktivierung über IL-1β Ausdruck genau zu messen.
Abstract
Entzündliche Prozesse von der Sekretion von Interleukin (IL) -1 resultierenden Familie Zytokinen durch Immunzellen führen zu lokalen oder systemischen Entzündung, Gewebeumbau und Reparatur, und virologische Kontrolle 1, 2. Interleukin-1β ist ein wesentlicher Bestandteil der angeborenen Immunantwort und trägt zu beseitigen eindringende Krankheitserreger und verhindert die Schaffung persistierende Infektion 1-5.
Inflammasomes der Schlüssel Signalisierungsplattform für die Aktivierung von Interleukin-1-Converting-Enzym (ICE oder Caspase-1). Die NLRP3 Inflammasom erfordert mindestens zwei Signale in DCs zu IL-1β Sekretion 6 verursachen. Pro-IL-1β-Protein-Expression in ruhenden Zellen begrenzt; daher ist für die IL-1β-Transkription und Proteinexpression eine Vorlaufsignal erforderlich. Ein zweites Signal von NLRP3 zur Bildung des Multiprotein NLRP3 inflammasome erfaßt. Die Fähigkeit der dendritischen Zellen zur Verantwortungd, die für die IL-1β-Sekretion erforderlichen Signale können unter Verwendung eines synthetischen Purin, R848, die durch TLR8 in menschlichen Monozyten prime Zellen gewonnenen dendritischen Zellen (MoDCs) abgetastet wird, gefolgt von der Aktivierung des NLRP3 inflammasome mit dem bakteriellen Toxin getestet werden und Kalium-Ionophor Nigericin.
Monozyten-abgeleiteten DCs sind leicht in Kultur produziert und bieten deutlich mehr Zellen als gereinigte menschliche myeloische DCs. Das hier vorgestellte Verfahren unterscheidet sich von anderen inflammasome Assays dadurch, dass sie in vitro menschliche anstelle der Maus abgeleitete DCs so dass für die Untersuchung der inflammasome in menschlichen Erkrankungen und Infektionen.
Introduction
Die Aktivierung des angeborenen Immunsystems ist erforderlich, um adaptive Immunantwort während der Infektion, Krankheit und Impfung 7 lenken. Dendritische Zellen sind die wirksamsten Antigen-präsentierenden Zellen des angeborenen Immunsystems; sie für die Aufnahme von Antigenen, die Migration in die Lymphknoten und die Aktivierung von naiven CD4 + und CD8 +-cytolytischen T-Zellen 8-10 spezialisiert sind. Um eine schnelle Erregernachweis ermöglichen das angeborene Immunsystem nutzt zahlreiche Keimbahn kodiert pattern recognition receptors (PRR), die konservierte Pathogen abgeleiteten Motive oder Wirt stammt Marker der Zellstress und Schäden zu erkennen. Toll-like-Rezeptoren (TLRs) sind Membran-gebundene Mustererkennungsrezeptoren, die bestimmte extrazelluläre Erreger phagozytierten associated molecular patterns (PAMPs) und Gefahren associated molecular patterns (gedämpft) zu erkennen. Im Gegensatz Nicken like Rezeptoren (NLR) sind cytosolische und reagieren auf ein breites Spektrum von PAMPs und dämpft. Nod-like-Rezeptoren wiederpräsentieren eine zweite Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger, die Zelloberfläche und endozytischen PRRs entziehen. Das Zusammenspiel der Erreger stammt, oder "Gefahr" verbunden sind, Faktoren, die mit TLR-Liganden und NLR führt zu einem Zustand der DC-Reifung zu erhöhten DC Interaktion mit anderen Immunzellen und die Förderung der T-Zell-und Zell-Aktivierung natürlicher Killer 11.
Interleukin-1β ist ein entscheidender Bestandteil der Immunabwehr gegen Infektionen. Bei Erkennen eines Mikroorganismus, der hoch proinflammatorische Cytokin IL-1β, wird sezerniert und wirkt als ein chemo Lockstoff und Aktivator der angeborenen und erworbenen Immunzellen. In vivo IL-1β ist weitgehend für die Akutphasenreaktion, einschließlich Fieber und inflammatorischen Cytokins verantwortlich 12 Synthese.
Die meisten NLRs enthalten eine C-terminale Leucin-reichen Repeat-Domäne, das vermutlich in der Ligandenerkennung, einem zentralen Nukleotid-Bindungsdomäne (NACHT), die impo ist funktionierenrtant für NLRP3 Oligomerisierung und einer N-terminalen Effektor-Domäne (PYD in NLRP3), die Signaltransduktion vermittelt den nachgeschalteten Ziele durch Protein-Protein-Interaktionen. Die NLRP3 Protein definiert den am intensivsten untersuchten Inflammasom komplex. Dieses Protein ist ein Mitglied der Familie NLR und hat die Fähigkeit, eine Mehrmolekularproteinkomplex NLRP3, Adaptorproteins PYCARD (auch bekannt als ASC) und ICE zusammen bilden. Nach Aktivierung Inflammasom PYCARD bindet an NLRP3 N-terminalen Domänen und rekrutiert ICE über Caspase-Aktivierung und Rekrutierung Domäne (CARD)-Domänen. Interleukin-1-Converting-Enzym wird anfänglich als ein Zymogen, das eine CARD-Motiv am N-Terminus erzeugt wird. Inflammasom Bildung führt zu bringen zwei ICE-Moleküle nahe genug, um ihre autokatalytische Aktivierung zu induzieren. Das Inflammasom Komplex ist für die Aktivierung ICE so dass es zytoplasmatischen Pro-IL-1β umwandeln Zytokin reifen erforderlich.
Erfolgreiche Sekretion von IL-1β in DCs erfordert Nachweis von zwei verschiedenen und unabhängigen Gefahrensignale. Zunächst TLR Erkundung von PAMPs, dämpft oder Cytokine Signaling (TNF oder IL-1β) bewirkt eine Hochregulation von Zytoplasma-Pro-IL-1β-Protein-Expression. Für Inflammasom Komplexbildung vor der ICE Reifung Eine zweite, oft anders, Signal erforderlich. Ein paar Inflammasom stimulierende Signale sind bakterielle Membran porenbildende Toxine (wie Nigericin), lysosomale stören Kristalle (wie Mononatriumuratkristallen, MSU) und extrazelluläre ATP. Der Upstream-Mechanismus, der zu Inflammasom Aktivierung durch diese unterschiedlichen Aktivatoren NLRP3 ist unklar. Studien, die vor der Signal Inflammasom Bildung schlägt vor, dass die intrazelluläre Ereignisse, wie die Induktion von Hypokaliämie oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die indirekt 13-28 Inflammasom aktivieren.
Unter den verschiedenen virale Aktivatoren des NLRP3 Inflammasom ist Influenza, die b bietetoth die Primär-und Sekundärsignal für IL-1β Sekretion 3, 29-33 erforderlich. Mit der Maus NLRP3 Knockout-Modelle wurde gefunden, dass IL-1β-Sekretion in DCs ist abhängig NLRP3 32. Zusätzlich zog NLRP3 Knockout-Mäuse weniger Leukozyten an den Ort der Infektion und erfahrenen höhere Mortalität 2, 5. Zwei neuere Arbeiten legen nahe, einen Mechanismus für die NLRP3 Inflammasom Aktivierung während der Influenza-Virus-Infektion; erste, Grundieren durch Erkennung der viralen RNA durch TLR7 oder TLR8 (abhängig von TLR-Expression der Zelle reagiert) oder durch Erfassung von kommensalen Bakterien von anderen TLR zytoplasmatische Pro-IL-1β-Expression zu induzieren, gefolgt von einem zweiten Signal, die Aktivierung von NLRP3 Inflammasom Bildung durch virale Ionenkanalproteins M2 auf dem trans-Golgi-Netzwerk 33, 34. Im letzten Schritt, die Auslösung des NLRP3 Inflammasom ist durch eine Störung der intrazellulären Ionen erreicht <em> Milieu führt zu ROS-Produktion, das ist einfach, durch NLPR3 als Signal an die Inflammasom bilden erfaßt. Doch der genaue Mechanismus der Aktivierung Inflammasom vor der ICE-Aktivität während der Influenza-Infektion noch unklar.
Diese Arbeit beschreibt eine Technik, wertvoll für das Studium der NLRP3 Inflammasom im menschlichen MoDCs, die als Grundlage für die weitere Untersuchung der zugrunde liegenden Weg DC basierend IL-1β-Sekretion in Reaktion auf TLR8 Ligation mit R848, gefolgt von der Aktivierung des Inflammasom von einem gut genutzt werden kann bekannt Aktivator der NLRP3, Nigericin. Variationen dieses Verfahrens können mit anderen Zelltypen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Monozyten, Makrophagen, anderen DC Untergruppen und Epithelzellen.
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Protocol
Ethikerklärung: Forschungsproben gewonnen und für die Forschung mit Zustimmung der Geber gespeichert. Alle Proben sollten codiert oder anonymisiert vor Gebrauch. Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Institutional Review Board.
1. Differenzierung von humanen Monozyten im peripheren Blut in Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen.
Hinweis: Human Buffy Coats dienen als Quelle der menschlichen peripheren Blutzellen (PBMCs) und wurden von der New York Blood Center (New York, NY) erhalten. Blutspender sind gesunden Probanden. Die 5 Tage Verfahren beginnt mit der Beschichtung von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) auf Gewebekulturkolben 35,36. Bemerkenswerte Unterschiede zu den veröffentlichten Protokollen sind die folgenden:
- Verwenden Sie 225 cm 2 nicht pyrogene Polystyrol-Gewebekulturflaschen mit Filterkappe, insgesamt 2x10 8 PBMCs pro Kolben statt 10 cm Polystyrol-Gewebekulturplatte haftens (58 cm 2) (Schritt 1).
- Planen Medien mit 5% gepooltem Humanserum (PHS, 30 ml) in 500 ml RPMI-1640 + L-Glutamin, 5 ml 1 M HEPES-Puffer und 1,4 ml 50 mg / ml Gentamicin (5% PHS Medien), gefolgt von Filtration durch 20 uM Filter. In insgesamt 50 ml 5% PHS-Medium pro 225 cm 2 Zellkulturflasche.
- Mit 25 ml frischem RPMI-1640-Zellen waschen halten dreimal. Kräftig schütteln für 5 Sekunden bei jedem Waschen und saugen nicht adhärenten Zellen (Schritt 4).
- Add 190 ul von 400 IU / ul IL-4 und 380 &mgr; l von 100 IU / ul GM-CSF pro Kolben (Schritt 3) am Tag 0, 2 und 4. Tag 0 wird definiert als Tag PBMCs werden in Schritt plattiert 1 (Schritt 8).
- Erntetag 5 MoDCs bei einer Konzentration von 1x10 6 Zellen / ml (Schritt 15).
- Verwenden MoDCs sofort in ihren Ruhezustand. Schritte 17-22 werden nie durchgeführt. Anmerkung: Die Proben sollten für beste Ergebnisse so bald wie möglich nach der Entnahme verarbeitet werden.
- Aliquot MoDCs bei einer Konzentrationtion von 2x10 5 Zellen / Vertiefung (200 ul / Vertiefung der 1x10 6 Zellen / ml) in einer 96-Well-Rundbodenplatte (Western-Blot, ELISA, FACS) oder auf eine Poly-L-Lysin behandelt chamberslide (Mikroskopie) für Experimente . Hinweis: Es gibt mindestens vier Bedingungen: Komplett-stimulierten (Negativkontrolle), Grundieren nur nur, Aktivierung und Grundierung, gefolgt von Aktivierung. Bedingungen können erweitert werden, um Verdünnungsmittel Steuerungen für R848 und Nigericin umfassen, falls gewünscht. Wenn der nachgeschaltete Assay ist ICS, sind Duplikate für Isotypkontrollen erforderlich.
. 2 Grundierung Inflammasoms - Signal 1
- Rekonstitution lyophilisierter R848 in DMSO gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verdünnen Arbeits Lager bei RT mit RPMI-1640.
- In R848 bei 10 uM Endkonzentration Brunnen für 18 Stunden aneignen. Ortszellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
3 Aktivieren der NLRP3 Inflammasom -. Signal2
- Rekonstitution lyophilisierter Nigericin in Ethanol gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verdünnen Arbeits Lager bei RT mit RPMI-1640 vor der Zugabe zu den entsprechenden Bedingungen.
- Nigericin hinzuzufügen bei einer 20 &mgr; M Endkonzentration und zurück in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 für 6 Stunden. Keine Waschschritte treten zwischen Grundierung und während der Aktivierung. Hinweis: Die Sekretion von IL-1β wird durch die Anwesenheit von Calcium-Ionophore erhöht, Brefeldin A, Monensin, Dinitrophenol und Carbonylcyanid-chlorphenylhydrazon 37, 38. Daher Zugabe dieser sekretorischen Inhibitoren sind nicht zu empfehlen, wenn die Analyse Inflammasom Grundierung oder Aktivität, da es die Sekretion von IL-1β zu ändern.
4. IL-1ß-Beispielsammlung
- Zentrifugieren Sie die Platte mit Zellen und Überstände bei 974 g für 3 min.
- Ohne das Zellpellet zu stören, saugen Sie den Überstand und zu übertragen, um alseparate Rundplatte, um Zytokinsekretion aus den Überständen zu messen. Anmerkung: Die Überstände zeitweilig bei -20 ° C gelagert werden oder -80 ° C zur Langzeitlagerung.
- Dreimaliges Waschen der Zellpellets mit 200 ul 1x PBS bei 974 × g für 3 min, um jede der extrazellulären IL-1β von den zellulären Proben zu entfernen. Hinweis: Beim Waschen Zell-Pellets aus einer 96-Well-Platte, entfernen Sie die Waschplatte durch rasche Inversion in einen Sammelbehälter, so dass die Probe nicht stören.
5. Mess IL-1ß Von Zell-und Überstandsproben
- Die intrazelluläre Zytokin-Färbung (ICS): Die ICS-Protokoll ist unter 39, 40 beschrieben. Hinweis: nicht die Zellen aussetzen, wenn der nachgeschaltete Assay ist Mikroskopie. Alle Waschschritte und Bestrebungen sollten ohne Störung der Zellschicht / Pellets (abhängig von der stromabwärts-Assay) erfolgen.
- 100 l 5% PHS Medien in die entsprechenden Wells. Hinzufügengeeignete Menge (ungefähr 1 μl/2x10 5 Zellen oder 1 &mgr; l / Vertiefung) von fluoreszierend markierten α-α-CD11c und CD14 (Marker-Phänotyps, Klon B-Ly6 und MφP9 bezeichnet) oder Isotyp-Kontrolle zu den Zellen für 10 min bei RT im Dunkeln.
- Dreimal Waschen mit 1x PBS bei 974 g für 3 min.
- Fixieren die Zellen durch Zugabe von 100 ul 4% PFA für 20 min bei RT im Dunkeln.
- Pause Point: Waschen mit 100 ul 1x PBS bei 974 g für 3 min und bei 4 ° CO / N in 1x PBS.
- 100 l Permeabilisierung Puffer, um die Zellen für 30 min. Hinweis: Permeabilisierung Puffer 1X PBS mit 0,3% Triton X-100, 1% Rinderserumalbumin (BSA) zur Permeabilisierung besteht und. Bitte nicht stören, wenn adhärenten Zellen nachgeschalteten Test ist Mikroskopie.
- In geeigneten Volumen (ca. 62 ng antibody/2x10 5 Zellen, etwa oder 2,5 ul / Loch) der α-IL-1β-FITC (Klon 8516) oder Isotyp-Kontrolle für2 h in einem Brutschrank bei 37 ° C.
- Waschen der Zellen dreimal mit 200 ul Permeabilisierung Puffer bei 974 × g für 3 min in der Dunkelheit.
- Optional: Fleck mit DAPI, fügen mountant und Deckglas vorsichtig auf einem Glasträger. Lassen mountant zu O / N vor der Aufnahme Mikroskopiebilder heilen.
- Erwerben Sie die Daten, die von FACs oder Mikroskopie. Hinweis: Vergleichen Sie die Isotyp für jede Bedingung an die entsprechende Färbung bei der Analyse von FACs oder Mikroskopie.
- FACS: Erfassung einer Probe zu einer Zeit. Stellen Sie den FSC / SSC-Gate auf den Live-Zellen, gefolgt von Gating auf CD11c + CD14 - Zellen vor der Analyse der MODC Bevölkerung Pro-IL-1β Färbung.
- Mikroskopie: Stellen Sie die Belichtungszeit mit Hilfe der positive Färbung Probe - R848 behandelt. Verwenden DAPI + Pro-IL-1β + und + DAPI Pro-IL-1β - um den Prozentsatz der Pro-IL-1β + ausdrückt MoDCs bestimmen.
- SDS-Seite: Immunoblotting durchgeführt wird, um Pro-IL-1β zu erfassen. Hinweis: Die unten beschriebene Technik kombiniert Standard-Immunoblot-Technik, Steigung 4-20% Polyacrylamid-Gel-und Fluoreszenz-oder Chemilumineszenznachweis 41, 42.
- Lysieren Zellen direkt in 10 ul denaturierende Lyse-Puffer (5 &mgr; l β-mercaptoethanol/950 &mgr; l Laemmli-Probenpuffer gefolgt von einer Verdünnung 1:1 mit Zell-Lyse-Puffer). Übertragen Lysat in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
- Wärme Lysat auf eine Trockenplatte für 10 min bei 100 ° C.
- Spin Lysats bei 20.800 xg über einen Minizentrifuge für 1 Minute, um das Flüssigkeitsvolumen zu konzentrieren. Pause Punkt: Proben können bei -20 ° C für die kurzfristige Lagerung eingefroren werden.
- Laden Sie das Gesamtvolumen auf das Polyacrylamid-Gel. Führen Sie 140 V durch das Gel-Box für ca. 1 Stunde, oder bis die Farbstofffront das Ende des Gels läuft weg.
- Transfer des Proteins aus dem Polyacrylamid-Gel auf eine PVDF-Immobilon-FL membrane für 90 min bei 100 V Blockieren der Membran mit 5% BSA in Tris gepufferter Kochsalzlösung / 0,1% Tween-20 (TBS-T) 1 Stunde lang. Hinweis: PVDF Immobilon-FL ist am besten für die Verwendung mit Fluoreszenz-Detektion. Eine Membran mit einer anderen Zusammensetzung wird empfohlen, für andere Detektionstechniken, um das Signal-Hintergrund-Verhältnis zu erhöhen.
- Verdünnte primäre und sekundäre Antikörper in 10 ml 5% BSA / TBS-T. Führen primären Antikörper Inkubation bei 4 ° CO / N unter Schütteln und sekundären Antikörper bei RT für 1 h unter Schütteln.
- 3-mal Waschen Sie die Membran mit TBS-T für 5 min unter Schütteln zwischen primären und sekundären Antikörperinkubationen wieder zwischen Sekundär Inkubationen und Bildgebung. Anmerkung: Die Bänder können mit fluoreszierenden oder chemilumineszenten Detektion detektiert werden. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Erkennung.
- ELISA: Die Proben, die für die Lagerung eingefroren werden, müssen vor der Analyse auf Raumtemperatur ins Gleichgewicht. Spin down Proben in einer Zentrifuge, um Überstand condens konsolidierenation. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Messung von IL-1β. Hinweis: In diesem Protokoll IL-1β ist speziell gemessen; jedoch die gleichzeitige Messung von TNF &agr;, IL-6, und die immunmodulatorische Zytokin IL-10 sorgt für die geeigneten Bedingungen vorbereitet wurden.
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Representative Results
Diese Techniken messen TLR8 Grundierung mit R848. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung für Pro-IL-1β ermöglicht für die Mikroskopie und FACS-Positionsanzeigen von CD14 - CD11c + MoDCs. Beide Techniken können relativ zu einem nicht grundierten oder Ruhe, Zellkontrolle sowie eine Isotyp-Kontrolle (Fig. 1 und 2) quantifiziert werden. Prozent pro-IL-1β + färbenden Zellen durch die geometrische Mitte dieser Population multipliziert, um die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) bereitzustellen. Die MFI ist vergleichbar mit der Menge der in den Zellen vorhanden positive Färbung Pro-IL-1β.
Immunoblotting Maßnahmen pro-IL-1β aus Zelllysat, der dann relativ zu einem inneren Zellkontrolle, wie β-Tubulin-oder β-Aktin (Fig. 3) quantifiziert wird. Immunoblotting für Pro-IL-1β in Nigericin behandelten Zellen sollte eine Abnahme der Pro-IL-1β zu offenbaren. Dies wird ergänzt durch einegleichzeitige Zunahme der IL-1β in den Überständen durch ELISA gemessen, nur R848 gefolgt von Nigericin Bedingungen (Fig. 3 und 4). Alle anderen Bedingungen sind in keiner vorhanden extrazellulären IL-1β führen. Gleichzeitige Messung von anderen entzündlichen Cytokinen, wie TNF, IL-10 und IL-6, dass Nigericin ist spezifisch in verursacht die Sekretion von IL-1β. Das Niveau der Priming Zeit (Fig. 3) und der Dosis (4) abhängig ist, eine Reaktion in dem Grad der intrazellulären Pro-IL-1β in R848 grundiert und extrazellulären IL-1β (sowie TNF, IL-10 reflektiert, und IL-6)-Sekretion in allen R848 behandelt Bedingungen (Fig. 4).
Fig. 1 ist. Cytoplasmatische Pro-IL-1β wird durch f detektiert Low-Zytometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Cytoplasmic Pro-IL-1β wird durch Mikroskopie nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. Cytoplasmatische Pro-IL-1β wird durch SDS-PAGE nachgewiesen.res.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Secreted IL-1β wird durch ELISA nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Inflammatorische Zytokine sind integrale bei der Steuerung der angeborenen und adaptiven Immunantwort auf Virusinfektion zu kämpfen. Sezernierte IL-1β wurde gezeigt, dass während der Influenza-Infektion 3, 43, 44 zu erhöhen. Die genauen Mechanismen, durch die diese Zytokine werden als Reaktion auf Viruserkennung in menschlichen dendritischen Zellen nicht vollständig verstanden. Myeloische DC-Isolierungs-Kits sind teuer und zeitaufwendig. Isolation Kits und FAC Sortierung kann unbeabsichtigt Stress oder aktivieren die Zellen. Zusätzlich gibt es häufig nicht ausreichende Menge von isolierten Zellen für die Experimente. Glücklicherweise ist die Biologie des menschlichen MoDCs eng, dass Modelle von primären humanen myeloischen DCs in vitro 45, 46. Beide Zelltypen erfordern zwei Signale, TLR Grundieren und NLRP3 Aktivierungs, um zu reifen IL-1β Sekretion zu erreichen. Daher bieten MoDCs und erschwinglich und einfach DC-Modell Zelltyp zu studieren und Wetteter verstehen, die Bedeutung und die Rolle der NLRP3 Inflammasom in der menschlichen Gesundheit und Krankheit.
Der Nachweis von IL-1β unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren liefert verschiedene einfache und effektive Immunoassays für Erkrankungen mit entzündlichen Erkrankungen assoziiert, einschließlich viraler RNA-Infektion zu untersuchen; Insbesondere, wie IL-1β in einer Vielzahl von Wegen in Abhängigkeit von R848 und Nigericin Stimulation zu messen. Andere TLR-Agonisten (wie z. B. Poly (I: C) und LPS) und NLRP3 inflammasome Aktivatoren (wie ATP und MSU) kann verwendet werden, um diese Aktivität in Zusammenhang mit anderen Erkrankungen Pathologien Messung nach Stimulation; jedoch müssen Stimulationszeiten und Bedingungen angepasst werden. Reagenz Belichtungszeiten und Konzentrationen müssten auch bei der Änderung dieses Protokoll für den Einsatz in anderen Zelltypen und Arten angepasst werden.
Alle Bedingungen müssen in dreifacher Ausfertigung ausgeführt werden und die Antwort sorgfältig abgewogen zur Qualitätskontrolle; ist es üblich,große Variabilität Spender zu existieren. Monozyten-abgeleiteten DCs sind ein Zelltyp, nicht eine Zelllinie, und Heterogenität innerhalb einer MODC Kultur existiert.
Entlüften kann mit ICS für Pro-IL-1β und Vergleichen ruhen MoDCs auf die R848-grundiert Zustand bestätigt werden. Ruhen MoDCs sollte nicht in eine positive Färbung führen. Grundierung kann auch durch Immunoblotting für die Expression von pro-IL-1β zu validieren. Erfolgreiche R848 Priming Ergebnisse der Sekretion proinflammatorischer Zytokine TNF &agr;, IL-6, und die immunmodulatorische Zytokin IL-10 mit minimaler Sekretion von IL-1β. Inflammasom aktivierten Zellen sollte nicht einen weiteren Anstieg der TNF, IL-6 und IL-10-Sekretion zeigen aber einen Anstieg der sezernierten IL-1β-Konzentrationen im Vergleich zu nicht-aktivierten Zellen haben.
Pro-IL-1β kann passiv während nekrotischen Zelltod freigesetzt werden daher möglicherweise Bioverfügbarkeit Assays von Interesse sein. Alternativ können Immunoblotting auf supernatan durchgeführt werdenTS, das Molekulargewicht des sekretierten IL-1β zu bestimmen, um sicherzustellen, aktive IL-1β ist die Form des Zytokins sezerniert; reifen IL-1β ist 17 kDa, während die Vorstufe 31 kDa. IL-1β aus Überständen zu messen, wird die Zellkonzentration justiert werden, um ein positives Signal über der Nachweisgrenze erreichen. Caspase-1-Aktivierung kann auch durch eine Vielzahl von Verfahren gemessen werden, um inflammasome Aktivierung zu bestimmen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., und Meagan O'Brien, MD für ihre Unterstützung und Rückmeldung zu quittieren. Diese Forschung wurde durch das Nationale Institut für Allergie-und Infektionskrankheiten unterstützt und mit Mitteln aus NIH gewährt Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards für Individual Fellowships Predoctoral (F31), um Vielfalt in der Gesundheitsforschung (AI089030) und RO1 (AI081848 Förderung abgeschlossen ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12 well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96 well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12% polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| Laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| Human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| Nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| Goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| Donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol - 4 L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
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