Summary
तंत्रिका विज्ञान और गैर मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के कई zebrafish मॉडल वयस्क मछली के बजाय भ्रूण / लार्वा में अध्ययन कर रहे हैं, क्योंकि हम वयस्क zebrafish रोग मॉडल को लागू किया जा सकता है कि एक मात्रात्मक पार्श्व रेखा पुनर्योजी परख विकसित की है. परख 1) neuromast और 2) व्यक्तिगत बाल सेल के स्तर पर संकल्प शामिल किया गया.
Abstract
कारण आदमी में सुनवाई और संतुलन विकारों के नैदानिक महत्व को, ऐसे zebrafish के रूप में मॉडल जीवों पार्श्व रेखा विकास और उत्थान अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. zebrafish क्योंकि अपनी तेजी से विकास के समय और इसकी उच्च पुनर्योजी क्षमता के इस तरह के अध्ययन के लिए विशेष रूप से आकर्षक है. तिथि करने के लिए, पार्श्व रेखा उत्थान के zebrafish पढ़ाई जिसका मुख्य कारण इन चरणों में neuromasts की कम संख्या का भ्रूण और लार्वा चरणों की मछली का उपयोग किया है. इस पार्श्व रेखा उत्थान / और या पूर्व के विकास के चरणों में आसान विकास की मात्रात्मक विश्लेषण बना दिया है. तंत्रिका विज्ञान और गैर मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के कई zebrafish मॉडल वयस्क मछली में और नहीं भ्रूण / लार्वा में अध्ययन कर रहे हैं क्योंकि एक परख उपलब्ध था, इसलिए है कि हम चाहते हैं कि वर्तमान करने के लिए लागू किया जा सकता है वयस्क zebrafish में एक मात्रात्मक पार्श्व रेखा पुनर्योजी परख के विकास पर ध्यान केंद्रित वयस्क zebrafish रोग मॉडल. वान Trum द्वारा पिछले अध्ययनों पर बिल्डिंगपी एट अल. 17 वयस्क मेक्सिकन अंधा गुफा मछली और zebrafish (Danio rerio) में बालों की कोशिकाओं के पृथक के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया है, कि हमारे परख नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच मात्रात्मक तुलना अनुमति देने के लिए डिजाइन किया गया था. इस पार्श्व रेखा का एक निर्धारित क्षेत्र में बालों की कोशिकाओं की gentamicin प्रेरित नेक्रोसिस के बाद एक 24 घंटे का समय अवधि में neuromast फिर से बाहर निकलना के प्रतिशत के आधार पर एक पुनर्योजी neuromast मानक वक्र के विकास के द्वारा पूरा किया गया. परख भी संकल्प के एक उच्च स्तर की आवश्यकता है जब व्यक्ति बाल सेल स्तर पर विश्लेषण के विस्तार की अनुमति के लिए डिजाइन किया गया था.
Introduction
पार्श्व रेखा (करूँगा) प्रणाली श्रवण, संतुलन, rheotaxis और इस तरह के स्कूली शिक्षा और शिकारी परिहार 1-5 के रूप में मध्यस्थता के व्यवहार के लिए जिम्मेदार है कि दोनों मछली और उभयचर में पाया mechanosensory अंग है. यह समर्थन कोशिकाओं से घिरे बालों की कोशिकाओं के समूहों से बना है, जो दोनों के neuromasts 6 बुलाया संरचनाओं में तैनात हैं. ये neuromasts आम तौर पर मछली के सिर में मनाया कुछ क्षैतिज टांके के साथ शरीर और पूंछ के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ (टाँके कहा जाता है) खड़ी रेखा में व्यवस्थित होते हैं. वयस्क में, neuromasts भ्रूण या लार्वा मछली 6 की तुलना में टांके के भीतर संख्या में काफी अधिक हैं. Zebrafish में बायोमेडिकल पढ़ाई एंटीबायोटिक उपचार, शोर प्रेरित आघात, पुराने संक्रमण, आदि के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया है. बालों की कोशिकाओं पर एक प्रयास में 7,8 बेहतर मानव में उनके प्रभाव को समझने के लिए.
सबसे रीढ़ के विपरीत, तेऐसे zebrafish (Danio rerio) के रूप में leosts, खो बाल कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने की क्षमता है. Zebrafish क्योंकि उनके तेजी से विकास के समय और उच्च पुनर्योजी क्षमता का विशेष रूप से उपयोगी हैं. तिथि करने के लिए, लेकिन, पार्श्व रेखा विकास और / या उत्थान पर zebrafish पढ़ाई मुख्य कारण आसान गिनती और विश्लेषण 6,9,10 के लिए अनुमति देता है जो पार्श्व रेखा neuromasts की कम संख्या के भ्रूण और लार्वा चरण मछली का उपयोग किया है.
हालांकि, तंत्रिका विज्ञान और गैर मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 11-16 के रूप में कई zebrafish मॉडल वयस्क मछली और नहीं लार्वा में अध्ययन कर रहे हैं, हम gentamicin का उपयोग कर वयस्क zebrafish में एक पार्श्व रेखा पुनर्योजी परख (पहले zebrafish लार्वा में इस्तेमाल एक aminoglycoside के विकास पर ध्यान केंद्रित किया और एक परख उपलब्ध था कि इतना अधिक हाल ही में) वयस्क मछली 17 के साथ प्रयोग किया जाता है कि वर्तमान वयस्क zebrafish रोग मॉडल को लागू किया जा सकता है. पहले वान ट्रम्प ई द्वारा प्रक्रियाओं प्रकाशित जबकिटी अल. 17 वयस्क मछली में बाल सेल पृथक के लिए शर्तों की स्थापना की, वे नियंत्रण और ऐसे ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों या pharmacologically प्रेरित रोग राज्यों का उपयोग कर के रूप में जब प्रयोगात्मक समूहों के बीच मात्रात्मक तुलना के लिए आवश्यक है जो neuromast उत्थान के लिए एक मानक वक्र स्थापित नहीं किया था zebrafish 18 में. इसलिए हम नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों की तुलना करते समय ऐसे वयस्क zebrafish रोग मॉडल के साथ के रूप में हमारे डेटा का उपयोग करने में सक्षम जांचकर्ताओं को neuromast उत्थान का एक मानक वक्र स्थापित करने के लिए बाल सेल पृथक के लिए वान ट्रम्प एट अल. 17 की प्रक्रियाओं का पालन, लेकिन उनके काम पर बनाया . परख भी संकल्प के एक उच्च स्तर की आवश्यकता है जब व्यक्ति बाल सेल को विश्लेषण के विस्तार की अनुमति के लिए डिजाइन किया गया था.
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं "प्रयोगशाला पशु की देखभाल के सिद्धांतों" में वर्णित निर्देशों का पालन कर रहे हैं प्रदर्शन (स्वास्थ्य प्रकाशन के राष्ट्रीय संस्थान नहीं. 85-23, 1985 संशोधित) और अनुमोदित Rosalind फ्रेंकलिन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति पशु प्रोटोकॉल 08-19.
बाल सेल परिगलन की 1. Gentamicin प्रेरण
- 0.004% की एक अंतिम एकाग्रता (4.32 मिमी) में सामान्य नमक में gentamicin सल्फेट तैयार करें.
- 0.004% (4.32 मिमी) gentamicin समाधान युक्त एक कंटेनर में वयस्क मछली (डी. rerio, उम्र के 4-6 महीने) रखें. किसी भी कंटेनर में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हम व्यापक में 7, उच्च में 6, और लंबे समय में 7 है जो एक Pharmacal एक्वाटिक सिस्टम से एक मछली कंटेनर का उपयोग करें. 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन सेट में मछली के साथ कंटेनर रखें. 24 घंटा अवधि के लिए एक व्यवहार्य राज्य में मछली बनाए रखने के लिए पर्याप्त स्तर पर टैंक में तरल पदार्थ की कुल मात्रा निर्धारित करें. नोट: gentamicin तरल पदार्थ की वातन nece नहीं हैssary पर्याप्त मात्रा में इलाज किया जा रहा है मछली की संख्या के लिए प्रयोग किया जाता है.
बालों की कोशिकाओं के 2. महत्वपूर्ण धुंधला
- 15 मिलीग्राम / एमएल के एक काम शेयर समाधान से फ्लोरोसेंट महत्वपूर्ण डाई [4-4-diethylaminostyryl) एन methylpyridinium आयोडाइड (485 एनएम उत्तेजना λ और मेथनॉल में 603 एनएम उत्सर्जन λ) की (सामान्य नमक में) एक 0.08% एकाग्रता की तैयारी इथेनॉल में.
- Gentamicin उपचार इलाज मछली महत्वपूर्ण डाई युक्त एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के कुएं में मछली रखकर तुरंत दाग रहे हैं नियंत्रण और gentamicin की एक सबसेट प्रभावी था, तो यह निर्धारित करने के लिए. मछली है कि 75 से अधिक मिनट के लिए दाग नहीं कर रहे हैं ताकि सांख्यिकीय महत्व प्राप्त किया जा करने के लिए आवश्यक के रूप में एक पर्याप्त मछली की संख्या (और संस्कृति प्लेटों का प्रयोग करें. Neuromast गिनती के परीक्षक की गति के आधार पर, समय के साथ एक कंपित ढंग से प्लेटों में मछली जगह 2.3 कदम में वर्णित है.
- फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से एक बेंच दराज में 2.2 कदम से प्लेटें प्लेसदाग neuromasts की परीक्षा के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. कमरे के तापमान पर 1 घंटे धुंधला अवधि में महत्वपूर्ण डाई का शमन को रोकने के लिए कमरे लाइट बंद.
- डाई धोने बाहर और संवेदनाहारी पानी के टैंक दोनों तैयार करें. डाई धोने का पानी बाहर सामान्य मछली पानी है और सामान्य मछली पानी में एक 1:1,000 कमजोर पड़ने से हासिल की है तो यह है कि संवेदनाहारी पानी के लिए पर्याप्त 2 phenoxyethanol जोड़ें.
- अतिरिक्त महत्वपूर्ण डाई कुल्ला और महत्वपूर्ण डाई दाग मछली के अवलोकन के लिए 3.1 कदम पर आगे बढ़ने के अतिरिक्त सामान्य मछली पानी में मछली रखें.
- 28 डिग्री सेल्सियस पर 8-16 के बीच घंटा के लिए एक मशीन के लिए सामान्य मछली पानी में धो रहे थे कि gentamicin इलाज मछली हस्तांतरण, neuromasts के उत्थान की जांच करने के लिए
- 8-16 घंटे के बीच विभिन्न समय पर, मछली, इनक्यूबेटर से हटा धोया और कदम 2.1-2.4 में संकेत के रूप में दाग रहे हैं. महत्वपूर्ण डाई दाग मछली के अवलोकन के लिए 3.1 कदम आगे बढ़ना.
3. Anesthetizing मछली और Neuromasts की फ्लोरिसेंट गिनती
- मध्य शरीर टांके की महत्वपूर्ण डाई दाग neuromasts की एक डिजिटल छवि प्राप्त करने के लिए एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप के मंच पर ढक्कन रखें.
- प्रयोग फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर रखा एक डिजिटल कैमरा बाद मात्रात्मक विश्लेषण के लिए छवियों पर कब्जा करने के लिए 2X के एक बढ़ाई निर्धारित किया है. स्टीरियो माइक्रोस्कोप की बढ़ाई सेटिंग उपयोग माइक्रोस्कोप के ब्रांड पर निर्भर हो सकता है, लेकिन सेटिंग मध्य शरीर टांके के भीतर आसानी से देखने और व्यक्तिगत neuromasts की गिनती की अनुमति चाहिए: ध्यान दें.
- (चित्रा 1 देखें) सही छाती पर का कवच पंख के लिए सिर्फ समीपस्थ मछली के सबसे नीचे उदर पक्ष पर चार नामित टांके भीतर दिखाई neuromasts की संख्या की गणना से उत्थान की राशि का निर्धारण करते हैं. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस तरह एनोवा ओ के रूप में एक उचित परीक्षण का उपयोगआर विद्यार्थी t-परीक्षण. प्रयोगों समय बिंदु प्रति 5 मछली की एक न्यूनतम का उपयोग करना चाहिए और सभी प्रयोगों 3x की एक न्यूनतम दोहराया जाना चाहिए.
- Neuromast उत्थान समय वक्र पर आधारित (चित्रा 3 देखें), उत्थान वक्र के रैखिक चरण के भीतर होना 8-16 घंटे बाद gentamicin धो आउट बीच neuromasts गिनती. नोट: रैखिक समय चरण के उपयोग पर नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच उचित मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.
Neuromast विश्लेषण सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं है, तो मात्रात्मक विश्लेषण के उच्च संकल्प प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत बाल कोशिकाओं के 4. फ्लोरोसेंट गिनती
- Neuromasts के स्तर पर मात्रात्मक विश्लेषण महत्वपूर्ण नहीं है, तो व्यक्ति बाल सेल के स्तर पर विश्लेषण भी संकल्प के एक उच्च डिग्री प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. एक विशेष समय बिंदु पोस्ट gentamicin धो आउट (समय बिंदु पहले neuromast अध्ययन के आधार पर), महत्वपूर्ण डाई सेंट पर मछली का चयन करेंप्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में मछली ऐन, और फिर 1-5 मिनट के लिए एक 1:500 कमजोर पड़ने पर 2 phenoxyethanol का उपयोग कर मछली euthanize.
- इस प्रकार के रूप में एक वर्ग त्वचा फ्लैप तैयारी कर दिया जाता है ताकि शमन को रोकने के लिए मातहत प्रकाश में, चार चीरों बनाने. यह गुदा पंख के साथ गठबंधन किया है जब तक मछली के ऊपरी पसलियों के साथ एक चीरा बनाओ, तो पेट भर में एक चीरा बनाने, और अंत में, तो वर्ग त्वचा फ्लैप बनाया जाता है इन चीरों के प्रत्येक पक्ष पर दो खड़ी चीरों बनाने. नोट: यह त्वचा की तैयारी neuromast प्रयोगों में इस्तेमाल के मध्य शरीर टांके शामिल करेंगे.
- एक गिलास स्लाइड पर त्वचा नमूना प्लेस और फिर लंगर में मदद मिलेगी और बाद में डिजिटल इमेजिंग के लिए ऊतक समतल करने के लिए excised त्वचा नमूना पर एक परिपत्र गिलास को कवर पर्ची जगह.
- कदम 4.3 से त्वचा के नमूनों का प्रयोग, मध्य शरीर टांके का प्रत्येक neuromast भीतर बालों की कोशिकाओं के डिजिटल छवियों को प्राप्त. कम से कम 60X के एक बढ़ाई छवियों ले लो और फिर बाल CE गिनतीनियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के तुलनात्मक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत neuromasts भीतर LLS (4 चित्र देखें).
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Representative Results
वयस्क zebrafish में पार्श्व रेखा के neuromast उत्थान बढ़ाता के लिए प्रक्रियाओं का अनुकूलन.
लार्वा zebrafish की neuromasts आसानी से quantifiable हैं; हालांकि, वयस्क zebrafish के पार्श्व रेखा 6,17,19,20 मात्रात्मक विश्लेषण और अधिक कठिन बना सिलाई प्रति neuromasts की एक बहुत बड़ी संख्या है. चित्रा 1 ए में देखा, सिर के मध्य अनुभाग या पूंछ या तो की तुलना neuromasts की काफी अधिक संख्या है; चित्रा -1 के रूप में दिखाया पूंछ क्षेत्र neuromasts की कम से कम संख्या होने के साथ. सिर में टांके के पैटर्न जटिल और neuromasts की संख्या में काफी अधिक है, क्योंकि यह मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक क्षेत्र के रूप में खुद को उधार नहीं दिया. इसके अलावा, भले ही हम परीक्षण किया gentamicin एकाग्रता की, सिर भर neuromasts की पूरी पृथक शायद ही कभी प्राप्य था; मनाया neuromasts के छोड़ने के धब्बे पहले इसके विपरीत वान ट्रम्प एट अल. 17 से रिपोर्ट में gentamicin उपचार के बाद, पूंछ भी कुछ neuromasts है, और इस तरह के रूप में, हम मात्रात्मक वयस्क में neuromast उत्थान का विश्लेषण करने के लिए मध्य शरीर क्षेत्र (चित्रा 1 बी) का चयन किया. इस क्षेत्र में, हम चार टांके सिर्फ सभी वयस्कों [61.45 (एन = 95)] (आंकड़े 1 बी और 1E) के बीच neuromast संख्या में संगत कर रहे थे कि पार्श्व छाती पर का कवच पंख के पीछे की पहचान की. महत्वपूर्ण बात, हम (पहले वान ट्रम्प एट अल. 17 रिपोर्ट में) लगातार और पूरी तरह से (आंकड़े 1 बी और 1E तुलना neuromast उत्थान के लिए बाद में एक सही निर्धारण के लिए अनुमति 24 घंटा 0.004% gentamicin उपचार से इस क्षेत्र की neuromasts काटकर अलग करने में सक्षम थे और चित्रा 2, 0 घंटा) के साथ लगवाना.
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चित्रा 1. वयस्क zebrafish के टांके भीतर neuromast के फ्लोरोसेंट पैटर्न अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ दिखाया गया है. पैनल एक सिर क्षेत्र है, पैनल बी एक बॉक्स के साथ रेखांकित मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल चार टांके के साथ मध्य शरीर क्षेत्र है. पैनल सी पोस्टीरियर शरीर क्षेत्र है. पैनल डी दुम फिन क्षेत्र है. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल मध्याह्न शरीर क्षेत्र की 4 टांके का एक उच्च बढ़ाई 1x और 2x के पैनल ई. बढ़ती शक्ति में दिखाया गया है.
यह तांबे सल्फेट उपचार भ्रूण और लार्वा 21 में बालों की कोशिकाओं का तेजी से गल जाना प्रेरित करने के लिए एक प्रभावी रासायनिक विधि है कि सूचना मिली है. यहाँ हम यह neuromast पृथक प्रेरित करने के लिए समय कम हो सकता है कि आशा के साथ तांबा सल्फेट उपचार का परीक्षण किया. से लेकर कॉपर सल्फेट सांद्रता5-50 मिमी पहले यह तांबे सल्फेट वयस्क मछली में कम सांद्रता में प्रभावी नहीं उच्च सांद्रता में घातक था और पाया गया कि लिआंग एट अल. 21 द्वारा सूचना मिली थी के रूप में करने के लिए 48 घंटे का उपयोग किया गया विभिन्न जोखिम बार के लिए (नहीं दिखाया डेटा) . इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
वयस्क zebrafish में पार्श्व रेखा उत्थान के फ्लोरोसेंट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया मानकों.
चार मध्य शरीर टांके के भीतर सभी neuromasts 24 घंटा gentamicin उपचार (चित्रा 2, नियंत्रण के साथ 0 घंटा तुलना) और सकारात्मक उत्थान एक सिलाई के भीतर तीन neuromasts की एक न्यूनतम की उपस्थिति द्वारा निर्धारित किया गया था निम्नलिखित ablated गया के बाद पुनर्जनन नजर रखी थी. (चित्रा 2, 0 घंटा). 8 HPG तक, मछली के लगभग एक तिहाई वसूली के कुछ संकेत (एन = 3 था4); neuromasts की तीव्रता Regenerating टांके में (चित्रा 2, 8 घंटा, बक्से द्वारा उल्लिखित बेहोश टांके) बेहोश हो गया था, हालांकि. उत्थान 16 HPG पर एक पठार (चित्रा 2, 8 घंटा साथ चित्रा 2, 16 घंटा तुलना) पर पहुंच गया जब तक neuromasts की संख्या और उनकी तीव्रता एक रैखिक फैशन में वृद्धि जारी रखा. यह gentamicin साथ इलाज सभी मछली पूरी तरह से नियंत्रण की तुलना में पार्श्व रेखा टांके भीतर neuromasts के बराबर संख्या और तीव्रता (चित्रा 2, 24 घंटा) दोनों के साथ बरामद किया था कि कम से कम 24 HPG तक नहीं था. Gentamicin वापसी के बाद neuromast उत्थान के लिए एक समय रेखा वसूली वक्र के रैखिक और पठार चरणों से पता चलता है जो 3 चित्र में दिखाया गया है. हम मामलों की कम से कम 5% में, regenerating टांके व्यक्तिगत संस्थाओं के रूप में प्रकट नहीं किया था, लेकिन इसके बजाय प्रतिदीप्ति की एक धब्बा के रूप में दिखाई दिया कि ध्यान दें.
चित्रा 3. ग्राफ 0.004% gentamicin साथ वयस्क zebrafish के 24 घंटे के इलाज से वापसी के बाद neuromasts उत्थान के समय के पाठ्यक्रम दिखा. दिखाया गया है, वसूली 8 HPG समय बिंदु पर शुरू होता है और 16 HPG समय बिंदु पर एक पठार पर पहुंच गया. यह इस रैखिक चरण के भीतर 8-16 घंटे और समय अंक के बीच neuromast उत्थान के लाइनर चरण मात्रात्मक नियंत्रण और प्रयोग समूहों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए परिभाषित किया.
Neuromast विषाक्तता फ्लोरोसेंट धुंधला रंगों को लंबे समय तक निवेश से प्रेरित है.
हमारे अनुमान में इन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक आदर्श तरीका 0 घंटे में फिर से पहले इलाज, दाग फ्लोरोसेंट डाई के साथ मछली दाग के लिए किया जाएगा तो फिर दाग एकटी उत्थान समय अंक. हालांकि, हम इस तरह 4-di-2-एएसपी के रूप में बाल सेल फ्लोरोसेंट धुंधला रंजक, भी 22 एक जहरीले बालों की कोशिकाओं 23 पर असर हो सकता है अन्य mitochondrial दाग के मामले में हो सकता है के रूप में तथ्य यह है कि जो इन अध्ययनों के लिए एक उलझन का सामना करना पड़ा. यह तथ्य एक ही मछली नियोजित नहीं किया जा सकता है के दोहराया धुंधला के बाद से मछली की अलग समूहों का उपयोग करने के लिए हमें आवश्यक. सभी मामलों में नियंत्रण सहित प्रयोगात्मक मछली प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को खत्म करने के लिए समानांतर में इलाज किया गया.
व्यक्तिगत बालों की कोशिकाओं के स्तर पर confocal विश्लेषण.
Neuromast विश्लेषण से प्राप्त परिणामों के सांख्यिकीय नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच महत्वपूर्ण नहीं हैं, तो एक मात्रात्मक तुलना के लिए संकल्प के एक उच्च डिग्री प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत ओलों कोशिकाओं के स्तर को इन अध्ययनों का विस्तार हो सकता है. चित्रा 4 में संकेत दिया है, एक नियंत्रण समूह से neuromasts (एकउत्थान के 12 घंटे में Euromast) इस आंकड़े में दिखाया गया है मध्य शरीर क्षेत्र से त्वचा की तैयारी की confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जा सकता है. 8 घंटा, 10 घंटा, और उत्थान के समय के 12 घंटे में, हम नियंत्रण समूह (7 पशु / समूह) 0-4 बालों की कोशिकाओं / neuromast की एक सीमा थी. नियंत्रण समूहों के लिए उम्मीद के रूप में मात्रात्मक विश्लेषण किया है,, neuromasts के बीच कोई अंतर सांख्यिकीय (पी मूल्यों 0.230-0.472 लेकर) ऊपर बताए गए समय बिंदुओं पर neuromast प्रति बालों की कोशिकाओं की संख्या के मामले में खोजा गया था. Neuromast अध्ययन के पहले चरण से प्राप्त आंकड़ों का विस्तार या पुष्टि करने की जरूरत है जब इस तरह के एक दृष्टिकोण किसी भी नियंत्रण और प्रयोग समूह के बीच ले जाया जा सकता है.
परिभाषित पार्श्व लाइन क्षेत्र की त्वचा तैयारी का उपयोग कर बाल सेल / neuromast उत्थान की चित्रा 4. विश्लेषण मैं वर्णितn प्रोटोकॉल कदम 3.3. एक zebrafish त्वचा तैयारी से प्राप्त एक neuromast भीतर बालों की कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट confocal छवि. दो महत्वपूर्ण डाई दाग बालों की कोशिकाओं एक नियंत्रण मछली की एक neuromast (चित्रा 4) के भीतर दिखाए जाते हैं. इस छवि gentamicin के 12 घंटे के बाद हटाने (रैखिक उत्थान चरण) प्राप्त हुई थी. सफेद तीर बालों की कोशिकाओं के आसपास के एक सहायक सेल इंगित करता है, जबकि सफेद ब्रैकेट प्रतीक () एक व्यक्ति neuromast इंगित करता है. समर्थन कोशिकाओं इन परिस्थितियों में दाग और काले रिक्त स्थान के रूप में नहीं दिखाई देते हैं. बढ़ाई, 60X.
| 1 | एक मशीन का उपयोग कर 28 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए नियंत्रण और प्रयोगात्मक मछली के 1. Gentamicin उपचार [0.004% (4.32 मिमी)]. |
| 2 | 2. बालों की कोशिकाओं के उत्थान आरंभ करने के लिए gentamicin के बाहर धो लें. 8-16 घंटे के बीच अन्वेषक चयनित समय अवधि के लिए 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर मछली लौटें. |
| 2 | फिर 3. महत्वपूर्ण डाई दाग [0.08% 4-4-diethylaminostyryl एन methylpyridinium आयोडाइड (4-di-2-एएसपी)] नियंत्रण और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रयोगात्मक मछली और फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए मछली पानी के साथ दाग को धोने के. |
| 1 या 2 | 4. यदि आवश्यक हो कारण neuromasts के विश्लेषण से nonsignificant परिणाम के लिए, नियंत्रण और प्रयोगात्मक मछली की एक अलग समूह के साथ प्रोटोकॉल 1-3 दोहराने, लेकिन फिर व्यक्तिगत बालों की कोशिकाओं के confocal विश्लेषण के लिए एक त्वचा तैयारी प्राप्त करते हैं. |
तालिका 1. प्रोटोकॉल का एक सारांश ऊपर उल्लिखित.
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Discussion
भ्रूण और लार्वा zebrafish 8,24,25 में पार्श्व रेखा (करूँगा) उत्थान के विश्लेषण के लिए स्थापित किया गया है कि साहित्य का व्यापक शरीर के आधार पर, हमारे अध्ययन का लक्ष्य zebrafish में पार्श्व रेखा के उत्थान के लिए एक मात्रात्मक परख करने के लिए विकसित किया गया है कि कर सकता सर्वश्रेष्ठ वयस्क मछली में अध्ययन कर रहे हैं कि बीमारी मॉडल को लागू किया. हम वयस्क मछली को भ्रूण / लार्वा मछली के लिए विकसित की प्रक्रियाओं को लागू करने के लिए जब कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं महत्वपूर्ण हो पाया. इन बातों का सबसे महत्वपूर्ण माना जाता है: 1) पार्श्व रेखा की संख्या 2) neuromast बालों की कोशिकाओं का धुंधला की अवधि, 3) एकाग्रता और अवधि aminoglycoside के उपचार के लिए, और 4), मछली के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ neuromasts aminoglycoside इलाज के बाद पार्श्व रेखा उत्थान के समय. इन बिंदुओं को निम्नलिखित चर्चा में संबोधित किया जाएगा.
Zebrafish के पार्श्व रेखा के साथ neuromasts की संख्या के संबंध मेंभ्रूण और लार्वा zebrafish क्योंकि वयस्क मछली की तुलना में एक दिया सिलाई भीतर उनकी कम संख्या की neuromasts एक सरल पैटर्न है कि विशिष्ट लाभ है. यह कम संख्या जांचकर्ताओं स्पष्ट रूप से प्रत्येक neuromast की पहचान और यह 6 से एक नाम आवंटित करने के लिए अनुमति दी गई है. इस तरह, उत्थान अध्ययन एक aminoglycoside एजेंट से वापसी के बाद किसी भी समय नाम से एक विशेष neuromast के फिर से प्रकट होना यों कर सकते हैं. वयस्क में सिलाई प्रति neuromasts की अधिक से अधिक संख्या भ्रूण या लार्वा की तुलना में जब neuromasts regenerating के फिर से प्रकट होना दौरान सटीक गिनती और मात्रा का ठहराव में महत्वपूर्ण कठिनाई का परिचय. दिखाया गया है, हम वयस्क के टांके भीतर पार्श्व रेखा neuromasts के पैटर्न का मूल्यांकन और मध्य शरीर (Figures. 1 और 2) के विश्लेषण के लिए टांके का इष्टतम क्षेत्र प्रदान की है कि निर्धारित.
इस तरह 2 के रूप में बालों की कोशिकाओं रंगों के साथ neuromasts का धुंधला - [4 - (dimethylamino) styryl] एन ethylpyridinium आयोडाइड (DASPEI) या 4-di-2-एएसपी एक लार्वा और किशोर मछली में फ्लोरोसेंट stereomicroscopy 26,27 का उपयोग कर पार्श्व रेखा की neuromasts कल्पना करने के लिए अनुमति देता है. ये वही दाग भी वयस्क मछली में प्रभावी रहे हैं और हमारे मात्रात्मक विश्लेषण के मध्य शरीर क्षेत्र के भीतर neuromasts की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर (सामान्य नियंत्रण वयस्क मछली में 61.45 neuromasts के एक औसत के साथ) सामान्य नियंत्रण zebrafish के बीच मनाया गया कि संकेत दिया.
[4 - - (dimethylamino) styryl] एन ethylpyridinium आयोडाइड (DASPEI) या 4-di-2-एएसपी को खुद कोशिकाओं 24 neuromast को विषाक्त किया जा सकता है, और मछली को बार बार नहीं हो सकता यह इस तरह के रूप में 2 बाल सेल रंगों बताया गया है कि एक aminoglycoside प्रेरित उत्थान पर नजर रखने के लिए है, तो इन फ्लोरोसेंट एजेंटों के साथ दाग. एक ही मछली के दोहराया धुंधला 23 प्रयोग संयुक्त राष्ट्र व्याख्या करता है कि (दाग और aminoglycoside दोनों ने) कई विषाक्तता की घटनाओं का परिचय. तदनुसार, सभी प्रयोगोंneuromasts nontreated gentamicin नियंत्रण हालत में मौजूद 1) थे दिखाने के लिए कि हमारे अध्ययन के क्रम में मछली के एकाधिक सेट की समानांतर 4-di-2-एएसपी धुंधला में, 2) पूरी तरह से gentamicin प्रदर्शन के बाद तुरंत ablated, और 3) कुछ पर regenerating इस aminoglycoside के बाहर वापसी और वाशिंग निम्नलिखित घंटे के बाद gentamicin उपचार. इस तरह, सभी मछली neuromast डाई के साथ केवल एक बार सना हुआ था.
यह वैन ट्रम्प एट अल. 17 की प्रक्रियाओं वयस्क मछली में बाल सेल पृथक के लिए शर्तों की स्थापना करते हुए, वे नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच मात्रात्मक तुलना के लिए आवश्यक है जो neuromast उत्थान के लिए एक मानक वक्र स्थापित नहीं है कि कहा जाना चाहिए. इसलिए हम 24 में बाल सेल पृथक (एक 24 घंटा जोखिम समय का उपयोग 0.004% की gentamicin एकाग्रता, बाल सेल पृथक परिणाम के लिए देखें चित्र 2 के लिए वान ट्रम्प एट अल. 17 की प्रक्रियाओं का पालनमानव संसाधन) लेकिन neuromast उत्थान का एक मानक वक्र स्थापित करने के लिए अपने काम का विस्तार किया. यह हम हमारे परख स्थितियों के लिए स्थापित किया गया है कि मध्य शरीर क्षेत्र के चार टांके का उपयोग कर वयस्क zebrafish में डालूँगा उत्थान के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है (1 आंकड़े देख सकते हैं और 2). बाल सेल पृथक के लिए एक छोटी अवधि में प्राप्त किया जा सकता है, तो यह निर्धारित करने के लिए, हम भी प्रभावी ढंग से 2 घंटे के रूप में के रूप में कम समय के लिए लार्वा मछली में इस्तेमाल किया गया है जो तांबे सल्फेट के प्रभाव का परीक्षण किया. (पहले लार्वा के लिए लिआंग एट अल. 21 द्वारा सूचना मिली थी के रूप में 48 घंटे तक का समय विभिन्न जोखिम बार के लिए 5-50 मिमी) हमारे अध्ययन है कि तांबे सल्फेट संकेत बाल सेल पृथक के लिए एक एजेंट के रूप में वयस्क मछली में प्रभावी होना नहीं पाया गया. यह भ्रूण में बालों की कोशिकाओं के पृथक और लार्वा के लिए इस्तेमाल किया स्थितियां हमेशा सीधे वयस्क मछली के साथ प्रयोग के लिए स्थानांतरित नहीं किया जा सकता कि इस तथ्य पर प्रकाश डाला गया.
पार्श्व रेखा से संबंधित के रूप मेंवयस्क में उत्थान, हम भ्रूण / लार्वा और वयस्क मछली की कि बीच neuromasts के उत्थान के लिए भी इसी समय फ्रेम पाया. 12-24 घंटे बाद aminoglycoside पर दूसरों, zebrafish भ्रूण और लार्वा शो neuromast उत्थान से पहले बताया धो आउट 8. हम 16 HPG पर पहुंच गया एक पठार के साथ (चित्रा 2 में दिखाया गया है 8 घंटा समय बिंदु के लिए पूर्ण टांके के रूप में नहीं देखा) 8-12 समय सीमा में प्रदर्शित होने neuromast उत्थान के रैखिक चरण मनाया. भ्रूण और लार्वा के लिए रिपोर्ट में टांके के भीतर neuromasts का पूरा नियंत्रण उपस्थिति की तरह 24 HPG तक नहीं मनाया गया. पूरा नियंत्रण उपस्थिति की तरह वयस्क zebrafish में मध्य शरीर क्षेत्र के सभी चार टांके भीतर संख्या और neuromasts की तीव्रता दोनों अर्थ. Neuromasts के स्तर पर प्राप्त मात्रात्मक परिणामों के सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं हैं, तो इसके साथ ही, अन्वेषक neuromasts भीतर व्यक्तिगत बालों की कोशिकाओं के स्तर को अपने अध्ययन का विस्तार कर सकते हैंहमारे प्रक्रियाओं द्वारा वर्णित के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग.
इस आलेख में वर्णित neuromasts / बाल सेल पुनर्जनन परख सर्वश्रेष्ठ बल्कि जल्दी भ्रूण / लार्वा चरणों में से वयस्क zebrafish में प्रकट होते हैं कि रोग राज्यों के लिए लागू किया जा सकता है. परख की एक सीमा है कि यह 1) एक विशेष बीमारी राज्य या वयस्क zebrafish के पार्श्व लाइन प्रणाली के भीतर स्टेम सेल पर 2) एक औषधीय प्रेरित रोग राज्य] mimics कि ट्रांसजेनिक तनाव चाहे प्रयोगात्मक हालत के असर का सवाल है. इस संबंध में, वयस्क zebrafish की एक विशेष बीमारी राज्य या बाल सेल वंश की स्टेम कोशिकाओं को प्रभावित नहीं हो सकता है, और यह कि neuromast उत्थान 8,24,25 प्रक्रियाओं इन स्टेम सेल प्रसार / भेदभाव पर पूरी तरह से निर्भर है नोट करना महत्वपूर्ण है .
इस सीमा के एक उदाहरण के रूप में, हम प्रकार मैं मधुमेह के एक वयस्क zebrafish मॉडल पर प्रदर्शन प्रयोगों का वर्णन करेंगे. इस particulए.आर. रोग मॉडल hyperglycemia 28 से प्रेरित दीर्घकालिक माध्यमिक जटिलता का अध्ययन करने के क्रम में वयस्क zebrafish में विकसित किया गया था. पहले 28,29 वर्णित कारणों की एक संख्या के लिए, इन अध्ययनों केवल वयस्क zebrafish का उपयोग किया जा सकता है. वे अंदर आना विशेष सेलुलर संरचनाओं के साथ परिधीय तंत्रिकाओं पर प्रतिकूल मधुमेह के रोगियों में प्रभावित कर रहे हैं, हम neuromasts / बालों की कोशिकाओं के पार्श्व रेखा उत्थान भी मधुमेह zebrafish में ख़राब था, तो यह निर्धारित करने के लिए चाहता था. पार्श्व रेखा उत्थान परख का प्रयोग कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण देरी neuromast उत्थान में खोजा गया था. इस नकारात्मक परिणाम की पुष्टि, प्रयोगों व्यक्ति बाल सेल की अधिक परिष्कृत स्तर पर दोहराया गया. फिर से, कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर नियंत्रण और मधुमेह समूहों के बीच बाल सेल पुनर्जनन में मनाया गया. इसलिए, डेटा hyperglycemia neuromast / बाल सेल उत्थान में बाधा उत्पन्न करती है कि अनुमान के साथ असंगत थे; पीossibly hyperglycemic शर्तों को बाल सेल वंश की स्टेम कोशिकाओं के प्रतिरोध के कारण. मन में इस सीमा के साथ, इस आलेख में वर्णित neuromasts / बाल सेल पुनर्जनन परख पार्श्व रेखा प्रणाली का उपयोग निगरानी के रूप में किसी विशेष वयस्क zebrafish रोग मॉडल बाल सेल पुनर्योजी प्रक्रिया में शिथिलता शामिल है कि क्या परीक्षण करने के लिए एक साधन प्रदान करता है. सकारात्मक परिणाम स्टेम सेल भागीदारी मतलब होता है और आगे के अध्ययन इसलिए warranted किया जाएगा.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentamicin sulfate solution (50 mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-Diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) in methanol | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| 6-well Plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| ImageJ software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System | Any aquatic system can be used |
References
- Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates. Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).
- Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. Sensory Processing of Water Currents by Fishes. Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).
- Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish. Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).
- Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line. Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line. PloS One. 7 (5), e36661 (2012).
- Raible, D. W., Kruse, G. J. Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish. J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).
- Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line). J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration. Brain Res. 1277, 12-23 (2009).
- Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The Zebrafish As a Model for Cancer. Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics. BMC. Neurosci. 11, (2010).
- Mathur, P., Guo, S. Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and. Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).
- Ignatius, M. S., Langenau, D. M. Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal. Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).
- Milan, D. J., MacRae, C. A. Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia. Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).
- Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System. Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).
- Littleton, R. M., Hove, J. R. Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine. J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line). PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).
- Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected. J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).
- Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies. Ichthyol Res. , 286-290 (2012).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals. The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways. Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).
- Herrera, A. A., Banner, L. R. The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles. J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).
- Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass,, L, N. Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa. Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus. Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).
