Summary
通过超分辨率荧光成像或原子力显微镜 （AFM） 将病毒附着在表面上是单一病毒成像的要求。在这里，我们演示了一种样品制备方法，用于控制将病毒粘附到适合用于 AFM 和超分辨率荧光成像的玻璃表面。
Abstract
将病毒固定到玻璃表面是单一病毒成像的关键步骤。在这里，我们介绍了一种从单分子成像检测中采用的技术，该技术允许单个病毒粘附到具有特异性的玻璃表面。这种制备基于用PLL-g-PEG和PLL-g-PEG-生物素的混合物嫁接玻璃表面，加入一层阿维丁，最后通过附着生物基化病毒特异性抗体产生病毒锚。我们在一系列实验中应用了这项技术，包括原子力显微镜 （AFM） 和超分辨率荧光成像。此样品制备方法导致病毒对表面的控制粘附。
Introduction
基于电荷的非特异性相互作用通常用于原子力显微镜1，2中的病毒粘附。这些技术特别工作得很好，当用于非封顶的病毒与非常僵硬的辣椒3-6。虽然这些技术非常有效地固定样品，但它们不能防止蛋白质与表面的非特异性结合。当尝试使用 AFM 和超分辨率荧光技术对病毒进行成像时，非特定结合可能会产生问题，这些技术需要用各种抗体孵化样品。在这里，我们概述了特定固定病毒的样品准备方法。
聚（乙二醇）（PEG）嫁接到聚（L-赖氨酸）（PLL）和吸收到玻璃表面提供了一个重要的块蛋白质与玻璃7静电相互作用。单分子检测需要在玻璃表面固定单分子，利用这一特性，并用它来创建一个特定的PEG为基础的单分子固定技术8-10。这种制备还用于固定在玻璃表面11的克拉斯林笼，以及创建一个同质纤维素涂层控制细胞粘附12。
我们采用了基于PLL-g-PEG吸附到单分子成像方法的玻璃表面的样品制备方法，并将其应用于血管口腔炎病毒（VSV）的单病毒成像。这些单一的病毒是使用原子力显微镜（AFM）成像的。类似的实验也进行了功能化珠作为控制。病毒还通过超分辨率荧光显微镜成像，这是一种标有Alexa 647的VSV-G抗体，用于创建单病毒信封的图像。高分辨率荧光成像利用单分子的本地化来创建图像13-15。fPALM双平面成像允许在平面上定位20纳米和沿光轴15，16分辨率为50纳米的单分子。这种双平面技术用于对本研究中存在的超分辨率荧光图像进行成像。另一种具有类似结果的技术是 STORM13，17，18。
通过本文概述的程序锚定在玻璃上的 VSV 的 AFM 和超分辨率荧光图像都显示了具有最小非特定相互作用的玻璃具有特定的粘性。在这里，我们介绍自动对焦和超分辨率荧光成像实验的样品准备方案。简言之：清洁玻璃盖通过吸食PLL-g-PEG和PLL-g-PEG-生物素的混合物而功能化。这种薄膜在涂层表面上提供15-25%的功能化生物素是典型的。盖片进一步孵育四聚丁。然后，生物基化病毒抗体用于为病毒创建一个独特的结合点。抗体的结合可以通过两种方式进行。
第一种方法是优化为自动对焦，但它仍然适合超分辨率荧光成像。在这种方法中，在病毒粘附之前，用生物素化抗体处理阿维丁涂层表面。固定的病毒用Alexa 647标记的抗体处理，以覆盖信封，并允许病毒的超分辨率荧光成像。
第二种方法是在将病毒粘附到所处理表面之前，用生物基化抗体和Alexa 647标记抗体在溶液中攻击病毒：该方法用于超级分辨率荧光成像实验进行优化，其中病毒包络的恢复非常重要。这种方法的优点是允许在病毒表面涂上均匀的抗体涂层。生物素化抗体可能与 Alexa 647 标记的病毒抗体混合，其比例允许将病毒充分吸附到所处理的 avidin 表面，同时在病毒包络外部保持高浓度的荧光标签。这些Alexa 647标记的病毒抗体不生物素化，其多余的可以冲洗掉，以减少背景噪音。
Protocol
1. 化学制备
- PLL-g-PEG-生物素和阿维丁的制备和储存：
- 根据制造商的指示，在浓度为 1.0 毫克/毫升时，在 PBS 缓冲区中溶解聚合物 PLL-g-PEG-生物素。
- 阿里报价根据盖片大小（见 表1），并存储在-80°C长达一年。
- 阿维丁/纽特拉丁的准备和储存
- 根据制造商的指示，在浓度为 1.0 毫克/毫升的情况下，在 PBS 缓冲区中溶解未贴标签的阿维丁/纽特拉丁。
- 阿里报价根据盖滑大小（见 表1），并存储在-20°C长达3年。
- 病毒样本准备：在此检测之前，根据实验需要和实验室协议准备病毒样本。方法 5A 使用步骤 1.3.1，方法 5B 使用 1.3.2。
- 在第 2 阶段之前为方法 5A 准备病毒样本。在制备后1-2天内利用准备好的病毒样本，或根据盖滑尺寸（见 表1）引用，然后在液氮中闪烁冻结，储存在-80°C长达一年。解冻后，立即使用。
- 为类似于 1.3.1 的方法 5B 准备病毒样本。在5B之前解冻病毒，在与抗体混合之前，在4°C下储存不超过24小时。
- 为实验准备适当的生物素化抗体。
2. 化学处理准备中的盖滑清洁
- 将盖片放在一个适当大小的特氟隆盖滑架中，将它们保持垂直方向，并将其浸入装满过滤过的（0.2 μm）乙醇（190证明）的烧嘴中。
- 将过滤过的乙醇（190证明）中的盖片酸化30分钟。
- 从酒精中取出盖片，用超纯水广泛冲洗盖片。
- 将冲洗盖片放在一个单独的清洁特氟隆架和装满 1 M NaOH 的烧嘴中。
- 在1 M NaOH中将盖片索尼酸盐30分钟。
- 从 NaOH 中取出盖片，用超纯水广泛冲洗。
- 用氮流干燥冲洗盖片，并将它们放在干净干燥的特氟隆架中。
- 检查盖片上是否存在任何可见膜或颗粒。如果仍有任何可见的材料，盖片尚未得到适当清洁和冲洗。如果未正确清洁重复步骤 2.1-2.7。
- 用氧气等离子体清洁盖片2分钟。此步骤是可选的，但建议。
3. PLL-g-PEG 薄膜层的形成
- 氮流（或可选的氧等离子体）干燥后，立即将一个盖片水平放置在无菌的培养皿中。在盖子的中心，管道可以适当解冻 PBS 缓冲 PLL-g-PEG-生物素（见表 1）。
- 用三明治方法将另一个清洁的盖子放在液体上。请注意，此方法包括让两个盖片通过将化学处理的"活性面"定向相互孵化其化学薄膜，仅由当前的化学层分离。确保有足够的液体，使两个盖片之间的体积完全充满液体，但不得从盖片之间泄漏液体（见表1）。此后，"活动面"指定与夹心式配置中的流体接触的盖唇面。
- 将培养皿的盖子放在盖唇三明治上，在 RT 孵化 45-60 分钟。
- 取下培养皿的盖子，用一对钳子拿起三明治。小心不要捏出多余的液体。使用拇指和食指轻轻捏三明治，并水平滑动封面，彼此朝相反的方向滑动，然后将两个盖片彼此分开，而无需触摸活动面。
- 用超纯水冲洗两个活动面，将 25 毫升超纯水管道输送到活动面 2-4 倍，然后用氮流擦干盖片。请务必注意哪些遮盖面是活跃的。
- 立即使用盖片，或将 O/N 与活动面朝上存放在无菌的 Petri 菜中，置于无尘低湿度环境中。
4. 阿维丁绑定增强
- 将经过处理的 PLL-g-PEG 盖唇与主动面朝上放在无菌的培养皿中。
- 在缓冲区（以步骤 1.2 制备）中适当数量的解冻阿维丁到活动面的中间。
- 在三明治方法中的液体上放置另一个盖子（向下活动面）。注意盖片的活跃面。在孵化过程中，活动面必须与流体接触（参见步骤 3.2）。
- 将培养皿的盖子放在盖唇三明治上，在 RT 孵化 25-30 分钟。
- 取下Petri盘盖，并按步骤 3.4 描述的两个盖子唇部分开，确保跟踪并不触摸活动面。
- 用超纯水冲洗两个活动面，将 25 毫升超纯水输送到活动面 2-4 倍，然后用氮流擦干盖片。注意盖片的活跃面。立即用于下一阶段。
重要提示：根据实验需要的检测类型，有两种不同的方法可以完成样品准备。实验者应进行第5A阶段，在添加超分辨率成像所需的任何额外的抗体治疗之前，将病毒锚定在玻璃上。5B 描述了一种替代方法，在将病毒固定在玻璃上之前，在溶液中标记病毒。本手稿中的代表性数据使用 5A 编写。应根据实验分析类型选择适当的方法。
5A. 活性面部抗体系绳
- 在阶段 4.6 中用氮流干燥后，立即将经过 Avidin 处理的盖唇活面放在无菌的培养皿中。
- 在缓冲器中将适量解冻的生物基化抗体放在活动面的中间（见表1）。
- 用三明治方法将另一个盖子（向下活动面）放在液体上。注意盖片的活跃面，重要的是活动面与培养液接触（参见步骤 3.2.）。
- 将培养皿的盖子放在盖唇三明治上，在 RT 孵化 45-60 分钟。
- 取下Petri盘盖，并按步骤 3.4 描述的两个盖子唇部分开，确保跟踪并不触摸活动面。
- 用 PBS 冲洗两个活动面，通过在活动面上管道 25 毫升 PBS 2-4 倍，不要干燥并立即使用。请务必跟踪哪些遮盖面处于活动状态。
- 将经过抗体处理的盖唇活面放在无菌的Petry盘中，并将适量解冻的病毒放在活性面的中间。
- 用三明治方法将另一个盖子（向下活动面）放在液体上。注意活动面，因为活动面与流体接触进行孵化非常重要（参见步骤 3.2.）。
- 将培养皿的盖子放在盖唇三明治上，在 RT 孵化 45-60 分钟。
- 取下Petri盘盖，并按步骤 3.4 描述的两个盖子唇部分开，确保跟踪并不触摸活动面。
- 用 PBS 冲洗两个活动面，在活动面上管道 25 毫升 PBS 2-4 倍。不要擦干盖片，而是将它们放在特氟隆架和装满 PBS 的烧嘴中。请务必跟踪哪些遮盖面处于活动状态。
- 立即使用准备好的样品或在 4 °C 的适当缓冲区存储长达三天，而不会显著丧失完整性。
重要注：如果样品要用于 AFM 检测，则制备已完成，可立即使用或存储步骤 5A.20 - 5A.21 中描述的样本。如果样品要用于超分辨率荧光成像检测，则使用步骤 5A.12 - 5A.19 中描述的抗体标记。 - 将两种经过病毒处理的盖片活面朝上放在无菌的Petry盘中，并在盖片上吹出足够的蛋白质阻塞缓冲液，以达到足够的液体体积，覆盖盖片中央95%的部位，而不会将任何阻塞缓冲液从盖片上流出（通常为100- 200 μl）。在 RT 孵化 60-90 分钟。
- 小心地去除阻塞缓冲区，每次从培养皿中取出一个盖片，并将盖片上的液体倒入废烧杯中。小心不要掉盖子。
- 用 PBS 冲洗两个活动面，通过在活动面上管道 25 毫升 PBS 2-4 倍，不要干燥并立即使用。请务必跟踪哪些遮盖面处于活动状态。
- 将单个阻塞缓冲区处理的盖片活面放在无菌的Petry盘中，并在缓冲液中将适量的荧光标记病毒抗体放在活动面的中间。
- 将另一个盖滑（活性面向下）放在三明治方法的液体顶部。请注意哪个面部是活跃的，重要的是活动面与流体接触进行孵化（参见步骤 3.2）。
- 将培养皿的盖子放在盖唇三明治上，在 RT 孵化 30 分钟。
- 取下Petri盘盖，并按步骤 3.4 描述的两个盖子唇部分开，确保跟踪并不触摸活动面。
- 用 PBS 冲洗两个活动面，通过在活动面上管道 25 毫升 PBS 2-4 倍，不要干燥并立即使用。请务必跟踪哪些遮盖面处于活动状态。
- 不要擦干盖片，而是将其放在装满 PBS 的烧嘴内的特氟隆架中。请务必跟踪哪些遮盖面处于活动状态。
- 立即使用准备好的样品或在 4 °C 的适当缓冲区存储长达三天，而不会显著丧失完整性。
5B.在溶液抗体攻击中
此方法可选增强超分辨率荧光成像的标记策略。通过应用溶液攻击，可以在病毒表面实现更好的抗体涂层。
- 根据实验需要将抗体溶液按比例混合。示例 1：4 0.01 毫克/毫升生物基化抗体与 0.01 毫克/毫升荧光标记抗体的比例将具有良好的结合亲和力，并允许在超分辨率成像检测中恢复良好的信封。
- 将抗体和病毒溶液的等份量分别混合在 （5B.1） 和 （1.3） 中。通过在别名中上下吹几次轻轻混合。此由此产生的解决方案可以存储，直到需要长达 24 小时，在 4 °C。
- 完成第 4.6 步后，将经过艾维丁处理的盖唇与活面向上放在无菌的培养皿中。
- 在活动面的中间，用抗体溶液（在步骤 5B.2 中制备）的病毒量适中。
- 用三明治方法将另一个盖子（向下活动面）放在液体上。注意活动面，因为活动面与流体接触进行孵化非常重要（参见步骤 3.2）。
- 将培养皿的盖子放在盖唇三明治上，在 RT 孵化 45-60 分钟。
- 取下Petri盘盖，并按步骤 3.4 描述的两个盖子唇部分开，确保跟踪并不触摸活动面。
- 用 PBS 冲洗两个活动面，在活动面上管道 25 毫升 PBS 2-4 倍。不要擦干盖片，而是将它们放在特氟隆架和装满 PBS 的烧嘴中。请务必跟踪哪些遮盖面处于活动状态。
- 立即使用准备好的样品或在 4 °C 中储存长达三天，而不会严重丧失完整性。
6. 原子力显微镜材料属性测量
- 打开自动对焦激光并打开自动对焦软件。从打开的对话中选择适当的扫描模式，以进行所需的检测。默认情况下，所有必要的窗口都应打开：如果不咨询用户手册以打开所需的窗口。
- 选择适合所需测量的悬臂，并根据制造商指南将其插入悬臂外壳中。有各种各样的条件和实验类型，有各种各样的罐装机。实验者应该根据他们的需要研究坎蒂勒弗。
- 根据制造商的指南，将悬臂外壳插入 AFM 头。
- 如果样品在潮湿条件下使用，则从存储缓冲区中取出样品，然后继续步骤 6.7。
- 如果样品在环境（干燥）条件下使用，则从其存储缓冲区中取出样品，并浸入超纯水烧嘴中短暂冲洗。注意：这将在样品上留下一个薄的水化层，这可能会诱发毛细管的吸引力与花冠具有低弹簧常数。
- 如果样品要在环境（干燥）条件下使用，则用氮流轻轻干燥样品。
- 用无尘滤纸轻轻干燥盖片的背面，确保不接触样品的主动面。
- 将样品放在适当的 AFM 样品支架中，然后将样品放在 AFM 阶段。
- 如果样品要在潮湿条件下进行成像，则将少量缓冲液移到样品中心（~10 μl）。
- 将自动对焦头放在样品上。
- 如果样品是湿的，请确保悬臂和 AFM 尖端穿透表面层，并且悬臂和悬臂外壳之间没有气泡。
- 根据制造商的建议，将 AFM 激光器与悬臂对齐，以获得最佳信号。
- 测量悬臂共振频率，并根据实验类型设置扫描频率。
- 将自动对焦器尖端降低到表面并优化信号设置。
- 以您选择的方式执行 20μm 方形 AFM 扫描。在生成代表性数据时使用了点击 （AC） 模式。按大致高度识别病毒候选者，这通常可视为玻璃表面的尖刺。
- 选择病毒候选者并将其上方的扫描头放在中心位置。
- 对所选病毒进行 250 nm 方形扫描（或适当的超分辨率扫描），以获取其拓扑学和方向。
- 选择病毒点上的材料属性测量（例如 球形病毒的中心为杨的模组测量），并根据制造商的方向进行测量。
7. 超分辨率成像方法
- 打开超分辨率成像软件，并根据制造商的指南校准软件。
- 使用荧光珠根据制造商的指示校准超分辨率成像设备。
- 通过将 50 μl 的 1 M MEA 和 100 μl 的 10 倍 Gloxy 组合到 850 μl 的库存缓冲器，从成像前的库存中组装样品成像缓冲器。在实验期间保持冰上的成像缓冲。
- 从存储缓冲区取出带有样品的预制盖滑，通过浸入超纯水烧嘴中冲洗 5 倍。
- 使用无灰尘滤纸干燥非活性盖唇面。确保不要触摸主动面。
- 插入成像系统示例支架，并将 250 μl 的成像缓冲器添加到示例支架中。每 2 小时交换一次样品上的成像缓冲器以保持一致的结果是合理的。
- 用胶片覆盖样品架，以减少与房间环境的大气相互作用。
- 将样品支架放入成像设备中进行成像。
- 利用制造商的指示将样品集中到焦点中。
- 根据采用的超分辨率技术对样品进行成像。请务必调整成像条件以优化信号，同时减少可光开关荧光素的同步激活。
重要注：成像条件取决于样品，并根据实验需要而变化。然后，利用 Alexa 647 在成像缓冲区高效初始化到其黑暗状态的典型实验可以通过 405 nm UV 光的应用进行照片激活。图像通过在密集标记的样品中激发Alexa 647分子的稀疏子集获得，并定位每个氟磷，其精度主要受收集光子数量的限制。此程序由软件反复重复，直到出现所需的收购周期数。实验者应该将此设置与样本中已进行照片漂白的每个氟磷相关。 - 成像完成后，根据制造商的指示关闭成像设备。该软件可能留待数据分析。
- 数据分析在很大程度上依赖于实验：然而，在所有情况下，通过最大宽度一半来识别病毒，这与已知的病毒维度进行比较，确保考虑到荧光标签的额外大小。
- 为了更好地可视化，使用 Isosurface 渲染选项或体积渲染选项查看样本，这两种选项通常都位于超分辨率成像软件中。
Representative Results
使用 AFM 的单病毒成像：
上面概述的样品制备方案用于将野生型病毒锚定到玻璃表面。VSV 病毒是子弹形状的 180 nm 长和直径 80 nm。由于有多种病毒，这种技术可以应用，这个概念也在这里证明在生物基化36纳米珠。由此产生的AFM实验显示在 图1中。值得注意的是，与非病毒 （GPa） 相比，VSV 病毒的杨氏模式 （100 MPa） 较低。单病毒 VSV 的特定图像是在具有僵硬悬臂的环境条件下在攻丝模式下获得的。其目的是使病毒变形，使病毒内额外的蛋白质密度在 AFM 图像中作为凹凸可见。这种方法用于检测病毒腔19内的额外蛋白质密度。
单病毒超分辨率成像：
Alexa 647 标记 VSV-G 抗体用于使用方法 5A 涂覆单个 VSV 病毒的信封，用于超分辨率实验。为了演示系绳密度和低非特定绑定，在 图 2A中显示样本的大扫描。具有代表性的病毒信封的恢复显示在 图 2B（ 蓝色等面）中。
图1。在功能化的PEGG表面上对珠子和VSV进行自动对焦成像。AFM扫描36纳米生物基化珠（A， B） 和 VSV 病毒（C）锚定在表面与生物基化 VSVG 抗体.AFM 是在交流空气地形扫描模式下完成的。尖端半径为<25纳米，测量是在力调制和轻敲下进行的。尖端的力恒定为3N/m，谐振频率为75 kHz，不确定性为15 kHz。虽然珠子在 AFM 扫描期间保持了高度，但 VSV 病毒具有明显较小的年轻人的模组，并且高度显著变形。在这张图像中，病毒被专门用一个僵硬的悬臂在攻丝模式下成像，产生一个小的xy卷积（用于确定病毒的尖端与钝端），病毒尖端和钝端之间的高度差异用于检测病毒19的钝端额外的蛋白质密度。
图2。基于荧光的 VSV 病毒成像在 PEGG 功能化表面上。 A） 使用在广域荧光中成像的生物基化抗VSVG抗体在PEGG表面固定的重组VSV病毒。 B） 通过生物基化抗 VSVG 抗体，高分辨率荧光重建连接到 PEGG 表面的 VSV 信封，并饰有 Alexa 647 标记的反 VSVG 抗体（方法 5A 用于创建这些图像）。蓝色表面是 2D 等面投影。左图为子弹形病毒模型。
| 盖滑尺寸 | 流体 |
| 40 毫米 | 65 微升 |
| 35 毫米 | 50 微升 |
| 30 毫米 | 36 微升 |
| 25 毫米 | 25 微升 |
| 20 毫米 | 16 微升 |
表1。根据盖片大小，流体引用。
Discussion
采用 AFM 和高分辨率荧光成像的单病毒成像可用作 CryoEM 断层扫描的替代方法。这些方法中的每一个都有其特定的优势。例如，AFM 可以在 WT 病毒上完成，无需标记样本或内部病毒蛋白。病毒结构的位置与它们对病毒弹性特性的贡献不一致。
单病毒超分辨率成像与新开发的病毒反向遗传方法相结合，成为本地化低拷贝数病毒蛋白20的有力技术。重组病毒，用与荧光蛋白融合的蛋白质取代蛋白质，可以利用这些反向遗传方法制造和纯化。虽然超分辨率成像具有特异性，部分由于遗传标记，它需要使用突变病毒。
AFM 和超分辨率成像是利用非常相似的样品制剂的免费方法。本文概述的方法，采用早期单分子成像检测的形式，允许锚定单病毒，对病毒的拓扑学影响甚微。
Disclosures
作者在本文中没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢蒂尔·贝克宁博士为原来的单分子制备协议。 这项工作得到了全国社保基金赠款1121972（SS）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips (fPALM) | Electron Microscopy Services | 72225-01 | 25 mm Coverslips |
| PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | SuSoS | - | Stock: 0.5 mg/ml in PBS |
| NeutrAvidin biotin-binding protein | Invitrogen | A2666 | Stock: 0.25 mg/ml in PBS |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21245 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| α-VSV-G | Invitrogen | ab34774 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| Gluox | Sigma | G2133-250KU | Glucose oxidase type seven from Aspergillius |
| Catalase | Sigma | C40-100mg | Catalase from Bovine liver |
| MEA | Sigma | 30070-10G | Cysteamine (MEA |
| Stock Buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose | ||
| NTE | 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA | ||
| Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit | Thermo Scientific | 10,000 MW | |
| Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 | Fisherbrand | 35 CIRCLE #1 |
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