Introduction
A parede celular da planta tem uma infinidade de informações dentro de seus vários componentes: lignina, celulose, hemicelulose (xilana, glucuronoxylan, xiloglucano, arabinoxilano, ligação mista glucana, ou glucomanana) e pectina. Técnicas histológicas fornecer dicas visuais importantes no estudo das diferenças dentro das paredes celulares secundárias a nível da organização e celulares. Várias técnicas histológicas foram desenvolvidos e podem ser encontrados na literatura, mas estas técnicas pode ser um desafio para principiantes e demorada porque os protocolos muito detalhado com instruções visuais simples são raramente, se alguma vez disponível. O objetivo deste estudo é fornecer orientações simples para técnicas de coloração histológicas para obter imagens de alta qualidade.
Seccionamento do tecido do tronco é o primeiro passo para a visualização de células e paredes celulares de formas. Embora seções cortados à mão são baratos e levam menos tempo para se preparar, o uso de um vibratome oferece consistência eproduz imagens de alta qualidade. Usando um vibratome permite produzir melhor qualidade de dados, gerando até secções com a mesma espessura, o que ajuda a produzir imagens nítidas e reduz significativamente o risco de produzir diferenças entre amostras imprecisos que seria simplesmente causada por uma preparação de amostra mau. Usando resinas para fixar espécimes frescos pode ser um desafio para iniciantes e ainda pode ser demorado, mesmo para especialistas, quando uma análise precisa ser feito rapidamente. Além disso, torna-se impossível de medir qualquer actividade biológica com a amostra quando tiver sido incorporado numa resina. Uma técnica simples que emprega um molde de agarose e caseiro é útil para a incorporação de tecidos do caule, e que também pode ser utilizado em outras aplicações que requerem uma dissecção de tecidos moles. Em comparação com a incorporação de espécimes em resina, este método tem a vantagem de manter os tecidos vivos e reduzindo a manipulação da amostra. Seccionamento dos tecidos por meio de um vibratome é altamente preciso e gera homogeneaous secções, que, dependendo do objectivo do estudo, poderá, então, ser usados com várias técnicas de coloração diferentes.
Os métodos mais simples de visualizar lignina e outros compostos aromáticos empregar ultravioleta (UV). Excitação de moléculas aromáticas à base de luz UV é uma técnica antiga, mas ainda é uma das abordagens mais rápido para visualização de lignina. No entanto, a visualização UV na verdade não é ideal para a detecção de lignina porque a luz UV vão animar outros compostos aromáticos. A lignina é composta basicamente de três blocos de construção, as monolignóis (álcoois hidroxicinamil: álcool coniferil, álcool sinapyl e álcool p-cumaril) 1-3. Floroglucinol mancha pode proporcionar pistas para a extensão da cinnamaldehydes presentes no xilema, fibras e tecidos da traqueia 4. Floroglucinol é um bom indicador de cinnamaldehydes gerais e pode diferenciar entre cinnamaldehydes e outros aromáticos. Os monómeros de álcool sinapyl pode ser detectadae diferenciando-se pelo uso de Maule mancha. Azul de toluidina O é um corante policromático e, portanto, tem a capacidade de manchar os diferentes elementos da parede celular em diferentes cores 5,6. O principal uso do azul de toluidina O é detectar pectina e lignina 5,6. A vantagem do uso de azul de toluidina O é que muitos elementos da parede da célula pode ser visualizado num único passo. Ambos calcoflúor branco e vermelho congo são fáceis de trabalhar e pode ser usado para visualizar celulose. Calcofluor manchas brancas celulose, calose, e outros β-glucanas não-substituídos ou substituídos fracamente 6-9, ao passo que congo manchas vermelhas directamente para β-(1 → 4)-glucanos e em particular a celulose 10,11. O objetivo deste estudo é fornecer orientações simples para o uso das técnicas de coloração acima mencionados para obter imagens de alta qualidade a partir de A. thaliana hastes.
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Protocol
1. Tronco Embedding
- Adicione uma solução de agarose a 7% em água (7 g de agarose de electroforese em série, em 100 ml de água destilada). Dissolve-se a agarose por autoclavagem durante 20 minutos ou por microondas durante 20 minutos à menor intensidade (por exemplo, intensidade de 10% de um forno de microondas de 1.250 watts).
- Prepare um molde caseiro para a incorporação das hastes utilizando frascos de plástico.
- Usando uma lâmina de barbear, cortar o fundo cônico de 2 ml com tampa de rosca tubo de microcentrífuga (Parte A). Com uma agulha de seringa, perfurar um furo na tampa do tubo um pouco maior do que o diâmetro da haste para ser incorporado. Em seguida, corte de 0,5 cm da parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (Parte B).
- Adicionar a 0,5 centímetros parte de corte do tubo de microcentrífuga de 0,6 ml para o tubo de microcentrífuga ml pré-cortados 2. Selar as duas peças usando Parafilm (Figura 1). NOTA: A parte inferior do tubo é cortada para facilitar a remoção da amostra após o embutido de agarose foi solidificada. Tele furo na tampa vai ajudar na realização do tronco estável quando a haste é incorporado em agarose. O molde servirá para manter a agarose e mantenha o tronco reto ao incorporar. O Parafilm irá segurar as duas partes, A e B, até a agarose é ajustado e a haste é incorporado.
- Usando uma lâmina de barbear, uma secção de corte da haste a partir da área de interesse (por exemplo, meio da primeira haste de entrenós). NOTA: O ideal é que o caule deve ser cortado pouco antes embutir para evitar a destruição por desidratação. Alternativamente, a haste pode ser temporariamente armazenados numa placa contendo um filtro de papel humedecido com água. Esta placa pode ser colocada em gelo até estar pronto para ser incorporado para evitar a desidratação dos tecidos e deformação. Armazenar a haste por períodos superiores a 30 minutos, sem alta umidade fará com que o tronco para secar.
- Derreter a agarose no micro-ondas a partir da intensidade. CUIDADO: O frasco contendo agarose pode estar quente. Use uma luva para pegar a garrafa. Deixe os derretidos s de agarosetand à temperatura ambiente (entre 20 ° C e 25 ° C) até que se arrefece para cerca de 50 ° C.
- Pipeta-se lentamente 5 ml de agarose para o molde plástico premade para encher o frasco. NOTA: Certifique-se que não há bolhas de ar nos moldes. As bolhas de ar fará com que as lacunas no molde agarose e não cobrir completamente a amostra-tronco, o que acabará por levar a corte desigual das seções de amostra.
- Deixe a agarose arrefecer durante 30 a 60 segundos para se tornar semi-sólido. Teste com um pequeno palito, certificando-se de que ele pode penetrar e ficar de pé, mas não flutuar, na agarose. NOTA: Se a haste é colocada quando o agarose ainda está quente ele irá danificar a amostra por murchamento do caule, destruindo a morfologia celular.
- Coloque a haste nesse frasco encheu-agarose. Certifique-se de que a haste fica em linha reta. Coloque a tampa perfurada, de tal maneira que a ponta da haste é mantida pela tampa. Não rode a tampa de rosca. Algum tempo mais do que uma haste (de um único tipo) pode ser embedded em um único frasco; mas, nesse caso particular, não use o cap. NOTA: Se a tampa de rosca é ligado, a haste vai ter torcida.
- Deixar o frasco à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante 10-30 minutos, até que se solidifica.
- Retire o molde suavemente deslizando-a para fora do tubo. Abra o Parafilm. Empurre a parte inferior da parte B do molde suavemente com o polegar para libertar a agarose solidificado da parte A para uma lâmina de microscópio de vidro.
- Cortar a haste embutida de agarose em três partes aproximadamente iguais de 1,2 cm de comprimento. Cortar a parte do tronco que não estava no agarose e descartá-lo.
- Guarde estas peças de agarose com o embutido deriva em hermético 2 ml microtubos em uma caixa de luz, a 4 ° C até que esteja pronto para a seção. Alternativamente, os tubos de armazenar a 4 ° C durante um máximo de uma semana. NOTA: O armazenamento é possível, mas o pesquisador precisa estar ciente de que o incorporado decorre ainda estão vivos e, dependendo do experimento, Artefactos poderia potencialmente ser introduzido.
2. Stem Seccionamento
- ATENÇÃO: Leia o manual vibratome com atenção e siga todas as instruções de segurança.
- Verifique se o disco de amostra é limpa e completamente seca (livre de qualquer sólido ou líquido). Limpe o disco de amostra com uma lâmina de barbear para remover qualquer cola residual a partir de experiências anteriores e lavar com água. Em seguida, seque com toalha de papel. Nota: Isto irá assegurar que o adesivo funciona bem e se liga à amostra de agarose. Se este passo não é feito adequadamente, é possível que os espécimes não podem aderir ao disco e, mais tarde, fazer com que a amostra cair do disco durante o corte.
- Use papel macio limpa para remover qualquer umidade do bloco de agarose contendo os espécimes.
- Colocar uma pequena gota de cola de tecido sobre o disco de amostra. Expelido do adesivo para cobrir a área no centro do prato utilizando a ponta da garrafa adesiva. Rapidamente lugaro bloco de agarose de modo que as amostras são ou perpendicular ou em paralelo com a placa durante transversal ou cortes transversais longitudinais, respectivamente. Permitir que o adesivo para fixar a amostra para o disco de amostra à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante 10-30 min. NOTA: Este é um passo sensível ao tempo.
- Fixe o disco de amostra no lugar em bandeja de tampão ou cocho. Os blocos de agarose / s com as secções devem estar em paralelo com a lâmina de barbear. Encher o tabuleiro de tampão com água destilada à temperatura ambiente até que as amostras são totalmente submerso.
- Corte uma lâmina de barbear ao meio e, em seguida, apare as pontas com uma tesoura resistente para que a lâmina fica completamente plana. Fixe a metade da lâmina de barbear pré-cortados no suporte a faca.
- Defina o ângulo do suporte da faca para 84 °, a velocidade a 0,90 mm / seg (posição 8 na vibratome) e freqüência de 50 Hz (posição 5 no vibratome). Corte seções de espessura 100 m. Use o modo contínuo. NÃOTE: Esta espessura foi seleccionada para assegurar que o tecido pode suportar os vários tratamentos ácido e base utilizados em alguns dos protocolos de coloração. Defina a janela de corte e permitir 15-20 minutos em um modo contínuo para o vibratome a seção de um bloco de agarose de aproximadamente 1,2 cm.
- Recolha as seções com uma pipeta de plástico descartável durante o corte na bandeja do buffer. Em alternativa, as secções podem ser transferidos a partir da bandeja do tampão para uma proveta de vidro e, em seguida, para uma placa de Petri claro. Transferir algumas seções para os 2,0 ml microtubos. Nota: As amostras são coletadas a partir de uma placa de Petri, porque é mais fácil de ver as seções sobre um fundo claro, e porque bandeja de tampão pode ser preparada para os próximos espécime.
- As secções podem ser armazenadas em um tubo de 50 ml ou recolhido e armazenado em tubos de 1,5 a 2 ml de microcentrífuga a 4 ° C durante 30 a 60 min. NOTA: Armazenar as seções por períodos mais longos irá resultar em má qualidade de imagem.
3. Microscópio e Camera Setting for Imaging
- Ajustar a iluminação Koehler no microscópio. Escolha um objetivo. Concentre-se na amostra em primeiro lugar. Traga a intensidade da luz a um meio ou inferior. Feche o diafragma de campo (FD) e abertura (AP) ou trazê-lo para a configuração mais baixa possível nesse objetivo particular.
- Quanto maior for a ampliação, quanto maior for o anel será. Use o botão de focagem do condensador para focar as íris de campo tão nitidamente quanto possível.
- Lentamente trazer a imagem da íris de campo (pequeno anel em forma de hexágono) para o centro utilizando os botões de condensador-centralização (parafusos em forma de pino que cercam o condensador). Lentamente aumentar o diafragma (FD) de tal modo que a íris de campo atinge o limite. Pare de aumentar o FD logo após o campo íris passou a borda.
- Aumente lentamente a abertura (AP) para ajustar o contraste. Ajustar a intensidade da luz conforme requerido. NOTA: iluminação Koehler precisa ser ajustado para cada objective, cada dia experimental. Anote os números obtidos após o ajuste para o dia. Esses números serão reutilizados a cada vez que os objetivos são trocados frente e para trás para esse dia especial.
- Ajuste a abertura, intensidade, tempo de exposição, o ganho, e filtros como descrito na Tabela 1. Esta informação deve ser utilizada apenas como um guia.
- Use uma câmera digital de alta resolução com um grande chip CCD formato interline sem obturador mecânico para capturar imagens de fluorescência; e uma de alta resolução, câmera de alta velocidade para imagens brilhantes em campo.
- Processar os slides usando software padrão. Carregar o software. Clique em "Adquirir" e "Set câmera / cartão," em seguida, selecionar a câmera a ser utilizado. Clique em "OK". Clique em "Adquirir" seguido de "guia de cores." Under "guia Cor", escolha "método Bayer" seguido de "Média de quatro." Adicionar o ganho sugerido (vermelho, verde, azul) from Tabela 1. Selecione a opção "Definir salvar" e clique sobre o diretório onde as imagens devem ser armazenadas. Defina "tempo de exposição" a partir das sugestões da Tabela 1. Set "Binning" em "1" e "binning Live" em "1". Foco na região de interesse e clique em "Salvar ao vivo."
- Saída de imagens no software da câmera estão no formato "TIF". Analisar as imagens para histoquímica dos tipos de células. Use um software de computador padrão para utilizações a jusante de apresentação e publicação.
4. Ultravioleta e Bright-campo de imagem
- Usar uma pipeta de 1 ml, com o corte da ponta da pipeta, de modo que as secções podem ser pipetado para fora facilmente. Gentilmente seções pipeta na ponta e sobre a uma lâmina de microscópio. Cubra as seções com uma lamela. Observe as seções sob luz UV ou iluminação de campo claro.
5. Floroglucinol-HCl (Wiesner) Coloração 12
- Dissolve-se 0,3 g de f loroglucinol em 10 ml de etanol absoluto para se preparar uma solução de floroglucinol 3%. Misturar um volume de HCl concentrado (37 N) a dois volumes de 3% em etanol floroglucinol; esta solução é floroglucinol-HCl (pH-HCl) ou Wiesner mancha. NOTA: esta solução é para ser feito fresco no dia da coloração e não pode ser armazenada, porque a solução irá degradar ao longo do tempo e a coloração se tornará ineficaz. CUIDADO: HCl é altamente corrosivo, por isso tenha muito cuidado ao manusear a mancha Ph-HCl.
- Transferir secções tronco para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicionar 1 ml de solução de Ph-HCl ao tubo contendo as secções e cap imediatamente porque o HCl na mancha Ph-HCl é altamente corrosivo. Mova suavemente o tubo para garantir que todas as seções estão manchadas. Uma alternativa para esta etapa é a de manter a tampa aberta do tubo de modo que a solução de Ph-HCl pode ser pipetado para cima e para baixo, de preferência, sem perturbar o segções. NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções na ponta da pipeta, pois isso pode danificar essas seções.
- Usar uma pipeta de 1 ml, com o corte da ponta da pipeta, de modo que as secções podem ser pipetado para fora facilmente sem danos. Pipeta suavemente seções na ponta e sobre uma lâmina de microscópio. Cubra as seções com tampa deslizante. Observe as seções sob iluminação de campo claro. Nota: A solução Ph-HCl seca em 5-10 min, causando uma deterioração dos espécimes. Portanto, a imagem tem de ser concluída dentro desse período de tempo.
6. Maule Coloração 13,14
- Dissolve-se 0,2 g de permanganato de potássio em 40 ml de água destilada para preparar uma solução de permanganato de potássio a 0,5%. Guarde em um frasco escuro à temperatura ambiente por um período máximo de 7 dias.
- Prepara-se uma solução de HCl a 3,7% pela adição de 1 ml de HCl concentrado (37 N) a 9 ml de água destilada (01:10). Prepara-se uma solução fresca de 3,7% de HCl nadia do experimento. Certifique-se de que a solução de HCl 37 N a ser utilizado não é muito antiga. Solução de hidróxido de amónio concentrado (14,8 M) deve ser armazenado a 4 ° C para evitar que a molaridade da solução saturada de diminuir.
- Transferir secções tronco para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicionar 1 ml de solução de permanganato de potássio a 0,5% para o tubo contendo as secções.
- Pipetar a solução de permanganato de potássio 0,5% para cima e para baixo com cuidado, de preferência, sem perturbar as seções. Incubar durante 2 minutos e repetir a pipetagem. Deixe o tubo de microcentrífuga de ficar até que todas as seções sossegar. NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções na ponta da pipeta, como as seções pode ficar danificado. Pode ser difícil ver as seções de tronco como a solução é escuro, de modo a manter o tubo com as seções sobre rack de tubo de ensaio e permitir-lhes que se contentar com 2 min.
- Usando uma pipeta de 1 ml, tirar 700 ml de solução de permanganato de potássio 0,5%.Adicionar 700 mL de água destilada para lavar a solução de permanganato de potássio. Repita 3-4x ou até que a solução de água permanece clara.
- Descarte a água. Adicione rapidamente 1 ml de HCl 3% até que a cor marrom profundo é descarregada a partir das seções. Isso pode acontecer dentro de 3-5 min ou pode exigir duas lavagens de 5 min cada. Pipetar para fora toda a solução de HCl 3% e proceder de imediato para a próxima etapa.
- Adicionar 1 ml de solução de hidróxido de amónio concentrado. Usar uma pipeta de 1 ml, com o corte da ponta, de tal maneira que as secções podem ser pipetado para fora facilmente sem danos. Pipeta suavemente seções na ponta e sobre uma lâmina de microscópio. Cubra as seções com uma lamela. Observe as seções sob iluminação de campo claro. ATENÇÃO: Devido hidróxido de amônio é extremamente corrosivo, requer cuidado e atenção para evitar causar corrosão ao palco do microscópio ou lente. NOTA: Os vapores de hidróxido de amónio pode embaçar a lamela, tornando-se difícil de observar a amostra. Portanto cuidado extra antes de adicionar a lamela. A solução seca em 5-10 min, por isso a imagem tem de ser concluída dentro desse período de tempo.
7. Vermelho do Congo Coloração 11,15
- Dissolve-se 0,5 g de vermelho do Congo em 100 ml de água destilada para preparar uma solução de vermelho Congo a 0,5%.
- Transferir secções tronco para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicionar 1 ml de solução de vermelho Congo a 0,5% para o tubo. Pipeta suavemente a solução vermelho congo 0,5% para cima e para baixo, sem perturbar as seções. NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções para a ponta da pipeta, pois isso pode danificar as seções.
- Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos e repetir a pipetagem. Seguir com mais 3 minutos de incubação à temperatura ambiente.
- Use uma pipeta de 1 ml para tirar 700 mL de 0,5% solução de vermelho congo. Adicionar 700 mL de água destilada para lavar a solução de vermelho congo. Repita a lavagem 3-4x até a solução de lavagemé clara.
- Usar uma pipeta de 1 ml com a sua ponta de corte, de tal modo que as secções podem ser pipetado para fora facilmente sem danos. Pipeta suavemente seções na ponta e sobre uma lâmina de microscópio, e cobri-los com lamela. Observar as amostras sobre a lâmina sob o microscópio de luz azul de excitação, utilizando um filtro com uma banda de passagem de 560/40. NOTA: Não armazenar as seções na água por muito tempo, antes da análise microscópica, como a água vai lavar o vermelho Congo em 10-30 min.
8. Branco Calcofluor Coloração 9
- Dissolve-se 0,02 g de branqueador fluorescente 28 (calcoflúor branco M2R) em 10 ml de água destilada para preparar uma solução de estoque de 0,2%. A solução a 0,2% pode ser armazenado durante seis meses em um frasco escuro a 4 ° C. Preparar uma solução de trabalho de 0,02% por diluição da solução de reserva 10x de 0,2% com água destilada.
- Transferir secções tronco para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicionar ao tubo 1 ml da calcof 0,02%luor solução branca. Pipeta suavemente a solução branco 0,02% calcofluor cima e para baixo. NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções para a ponta da pipeta, pois isso pode danificar as seções.
- Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos e repetir a pipetagem. Incubar a secção por mais 3 min, à temperatura ambiente. NOTA: Permita que as seções para resolver para o fundo do tubo para facilitar a pipeta a solução, sem danificar as seções.
- Use uma pipeta de 1 ml para tirar 700 ml de solução de branco 0,02% calcofluor e adicionar 700 mL de água destilada; aguarde 5 minutos para lavar a solução branco calcofluor. Repita a lavagem 3-4x. Use uma pipeta de 1 ml com o corte da ponteira de tal forma que as seções podem ser pipetado para fora facilmente, sem danos.
- Pipeta suavemente seções na ponta e sobre uma lâmina de microscópio e cobrir com uma lamela. Observe as seções sob luz UV.
9. Toluidine Blue O Coloração 16,17
- Dissolve-se 0,02 g de azul de toluidina O em 100 ml de água destilada para preparar uma solução a 0,02%. NOTA: A solução de azul de toluidina O podem ser armazenadas durante duas semanas num frasco escuro à temperatura ambiente.
- Transferir secções tronco para um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Adicionar 1 ml de solução de azul de toluidina a 0,02% de S para o tubo. Pipeta suavemente a solução de azul de toluidina O 0,02% para cima e para baixo. Em seguida, incuba-se a temperatura ambiente durante 5 min e depois repetir a pipetagem. NOTA: Tenha cuidado para não pipetar as seções para a ponta da pipeta, pois isso pode danificar as seções. Deixe o tubo de microcentrífuga de ficar parado até que as seções sossegar. Isso pode ser difícil de ver, como a solução é escuro, de modo a manter o tubo que contém as seções na cremalheira tubo de ensaio e permitir-lhes que se contentar com 2 min à temperatura ambiente.
- Use uma pipeta de 1 ml para tirar 700 ml de solução de azul de toluidina O 0,02%. Adicionar 700 mL de água destilada para lavar o azul de toluidina O solution. Repita 3-4x ou até que a solução de lavagem é clara. Usar uma pipeta de 1 ml, com o corte da ponta da pipeta, de modo que as secções podem ser pipetado para fora facilmente sem os danificar.
- Pipeta suavemente seções na ponta e sobre uma lâmina de microscópio e cobrir com uma lamela. Observe as seções sob iluminação de campo claro.
- Ajustar a iluminação Koehler no microscópio. Escolha um objetivo. Concentre-se na amostra em primeiro lugar. Traga a intensidade da luz a um meio ou inferior. Feche o diafragma de campo (FD) e abertura (AP) ou trazê-lo para a configuração mais baixa possível nesse objetivo particular.
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Representative Results
Stem Embedding e Seccionamento:
A utilização do molde de plástico caseiro para incorporar os caules em 7% de agarose revelou-se fácil e rapidamente (Figura 1). As duas partes (A e B; Figura 1) do sistema de frasco incorporado torná-lo simples para liberar facilmente a haste incorporado em agarose como a agarose não se ater às partes dos frascos que são inertes, mantendo o sistema limpo. Os frascos podem ser reutilizados várias vezes durante anos. A conveniência de armazenamento a haste incorporado também torna mais fácil os passos seguintes. De modo a poupar algum, semelhante incorporado hastes podem ser agrupadas (até 3) sobre uma única placa de corte para o corte.
Observação de Aromáticos Sob UV:
As secções foram montadas em tronco de água destilada sobre as lâminas de vidro e observados sob luz ultravioleta. Os compostos aromáticos, incluindo a lenhina nas células, pode ser visualizada pela sua autofluorescência sob luz UV. Xilema (XY) e fibras interfasciculares (Fi)mostrou autofluorescência sob iluminação UV, mas não na medula (Pi) e córtex ou epiderme (Ep) (Figura 2), porque a lenhina, um polímero aromático, é depositada durante a biossíntese da parede celular secundária. Em alguns casos, quando as plantas se acumulam quantidades significativas de compostos aromáticos nos seus vacúolos (por exemplo, de antocianina), a fluorescência pode ser observada em células corticais (dados não mostrados). Stem secções transversais foram analisados sob 5X, 10X, 20X, 40X e ampliação (figura 2 Painéis A, B, C, e D - E, respectivamente) para visualizar melhor distribuição aromático parede celular através da haste.
Observação de lignina nas Seções-tronco manchado com Floroglucinol e Maule Stains:
O xilema composto de vasos e fibras e fibras interfasciculares eram os únicos elementos do tronco que foram manchadas pelas manchas de lignina (Floroglucinol e Maule) Usando uma amostra de tipo selvagem secção de proa. Floroglucinol mancha reage com finais grupos cinamaldeído de lignina para dar uma rosa ou cor fúcsia 4 (Figura 3). Como observado sob iluminação UV, uma coloração fucsia é observado nas fibras do xilema e interfasciculares mas está ausente no córtex e medula ou da epiderme (Figura 3). Stem secções transversais foram analisados sob 5X, 10X, 20X, 40X e ampliação (figura 3 Painéis A, B, C, e D - E, respectivamente) para visualizar melhor distribuição mancha floroglucinol através da haste e diferenciar os principais tecidos; xilema e fibras interfasciculares; medula e córtex; e epiderme. Normalmente, a intensidade da cor está correlacionado com o nível de lignificação de uma forma qualitativa - excepto quando o mutante ou transgénicos analisados é anormalmente enriquecido em unidades derivadas de cinamaldeído (por exemplo, mutantes) cad <sup> 14. A mancha de Maule é específico para detectar as unidades de lignina siringila no xilema e fibras interfasciculares. Coloração vermelha, indica a presença de unidades de lenhina siringil nos elementos de lignina (Figura 4) 18. No entanto, uma coloração vermelho brilhante é observado nas fibras, quando comparado com os tecidos do xilema que sugere que as fibras contêm um nível mais elevado de lignina S enquanto que o xilema é mais enriquecido em unidades L. Como pode ser observado, após coloração floroglucinol, uma coloração vermelha é observado nas fibras do xilema e interfasciculares mas está ausente no córtex e medula ou da epiderme (Figura 4). Também se relaciona com a distribuição de lignina observada sob UV (Figura 2) e mostra que as unidades de siringil estão presentes em todos os tecidos lignificação desta amostra haste. Stem secções transversais foram analisados sob 5X, 10X, 20X, 40X e ampliação (figura 2 Painéis A, B, C, eD - E, respectivamente) para melhor visualizar a distribuição mancha Maule em todo o tronco e diferenciar os principais tecidos: fibras do xilema e interfasciculares, medula e córtex e epiderme. É importante notar que a quantidade e distribuição de unidades de siringil entre tecidos lenhificados variar com a idade do caule e pode estar ausente em uma nova haste (dados não mostrados).
Observação das Seções tronco manchado com calcofluor Branco e Congo manchas vermelhas:
Calcofluor manchas brancas celulose, calejado e outros β-glucanas não substituído ou fracamente substituídos; Considerando congo manchas vermelhas directamente para β-(1 → 4)-glucanos e em particular a celulose. Seções tronco corados com calcofluor branco foram observadas sob luz UV 6-9. Congo secções manchadas de vermelho foram observados sob excitação de luz azul, utilizando um filtro com uma banda de passagem de 560/40. Ambos calcofluor branco e vermelho Congo manchado a epiderme, córtex e medula; ºé é porque todos estes tecidos contêm celulose como polímero principal polissacarídeo nas suas paredes celulares (Figura 5 e Figura 6, respectivamente). Em contraste com Calcofluor branco, vermelho congo polissacáridos coradas melhor no xilema e fibras interfasciculares e parece menos afectado pela presença de lignina (Figura 5 e Figura 6) 10,11. Stem secções transversais foram analisados sob 5X, 10X, 20X, 40X e ampliação (Painéis A, B, C, e DE, respectivamente, das figuras 5 e 6) para visualizar melhor calcoflúor distribuições mancha vermelho congo e através da haste e do grande tecidos (xilema e fibras interfasciculares, medula e córtex e epiderme).
Observação das Seções tronco corados com Azul de Toluidina O:
O azul de toluidina é classificada como um corante policromática porque reage com vários componentes químicos das células de forma diferente e resultauma amostra de multi-coloridas (Figura 7). As cores geradas podem fornecer informações sobre a natureza da célula e as suas paredes. Azul de toluidina O é um corante catiónico que se liga aos grupos carregados negativamente 5. Uma solução aquosa deste corante é azul, mas de cores diferentes são gerados quando o corante liga-se com diferentes grupos aniónicos na célula 6,9. Por exemplo, uma cor púrpura rosado aparecerá quando o corante reage com polissacarídeos carboxilados como o ácido péctico; verde, azul esverdeado ou azul brilhante com substâncias aromáticos policíclicos, tais como lignina e taninos; e púrpura ou azul esverdeado com ácidos nucléicos. O azul de toluidina-tronco secções transversais revelou que as fibras do xilema e interfasciculares são lignificadas pois mostram uma coloração azul ou azul-esverdeado (Figura 7, Painel C), o que está de acordo com o UV e observações de coloração Ph-HCl (Figuras 2 e 3). Em contraste, a medula e tecidos do córtex e epiderme esverdeada mostrar coloração azul ou azul, porque, embora eles não são lignificadas, eles contêm alguns polímeros de pectina em suas paredes celulares. Stem secções transversais foram analisados sob 5X, 10X, 20X, 40X e ampliação (Figura 7 Painéis A, B, C, e D - E, respectivamente) para visualizar melhor distribuição mancha azul de toluidina O outro lado da haste e para diferenciar os principais tecidos .
Molde Figura 1 caseiro para a incorporação das hastes No lado esquerdo..; superior do tubo de 2 ml com tampa de rosca de microcentrífuga (Parte A) e a parte inferior do tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (Parte B). No lado direito; o Parafilm segurando as duas partes; A e B para formar o molde final.
Fluorescência Figura 2. UV A. tronco thaliana secções transversais seções transversais de um tipo A. selvagem. haste thaliana sob luz UV de fluorescência que mostra a presença de compostos aromáticos, incluindo lenhina, apenas nas paredes das fibras interfasciculares e células do xilema (A - E). São indicadas as posições da epiderme e córtex (EP), fibras interfasciculares (FI), medula (Pi) e xilema (XY). Ampliações: Painel A: 5X; Painel B: 10X; Painel C: 20X; painéis D e E: 40X. Barra = 100 um.
A Figura 3. Floroglucinol-HCl coloração de A. tronco thaliana secções transversais. Coloração Floroglucinol-HCl (rosa ou cor fúcsia) de um tipo selvagem A. secção de proa thaliana que mostra a deposição de lenhina normal nas paredes das fibras interfasciculares e células do xilema (A - E). São indicadas as posições da epiderme e córtex (EP), fibras interfasciculares (FI), medula (Pi) e xilema (XY). Ampliações: Painel A: 5X; Painel B: 10X; Painel C: 20X; painéis D e E: 40X. Barra = 100 um.
Figura 4. Maule coloração A. tronco thaliana secções transversais. coloração Maule (cor vermelha) de um tipo selvagem A. thaliana </ Em> secção haste mostrando a deposição de lenhina normal nas paredes das fibras interfasciculares e células do xilema (A - E). São indicadas as posições da epiderme e córtex (EP), fibras interfasciculares (FI), medula (Pi) e xilema (XY). Ampliações: Painel A: 5X; Painel B: 10X; Painel C: 20X; painéis D e E: 40X. Barra = 100 um.
Figura 5. Calcofluor coloração branca de A. tronco thaliana secções transversais. calcofluor coloração branco de um tipo selvagem A. secção de proa thaliana que mostra deposição de celulose nas paredes celulares das células da epiderme, o córtex, medula, fibras interfasciculares e xilema (A - E). O positions da epiderme e córtex (Ep), são indicados fibras interfasciculares (FI), medula (Pi) e xilema (XY). Ampliações: Painel A: 5X; Painel B: 10X; Painel C: 20X; painéis D e E: 40X. Barra = 100 um.
Figura 6. Coloração vermelho congo A. caule thaliana secções transversais. Congo coloração vermelha de um tipo selvagem A. secção de proa thaliana que mostra deposição de celulose nas paredes celulares das células da epiderme, o córtex, medula, fibras interfasciculares e xilema (A - E). São indicadas as posições da epiderme e córtex (EP), fibras interfasciculares (FI), medula (Pi) e xilema (XY). Ampliações: Painel A: 5X; Painel B Painel C: 20X; painéis D e E: 40X. Barra = 100 um.
Figura 7. Toluidine azul O coloração A. tronco thaliana secções transversais. Toluidine azul O coloração de um tipo selvagem A. secção de proa thaliana que mostra a deposição de lenhina normal nas paredes das fibras interfasciculares e células do xilema (A - E). São indicadas as posições da epiderme e córtex (EP), fibras interfasciculares (FI), medula (Pi) e xilema (XY). Ampliações: Painel A: 5X; Painel B: 10X; Painel C: 20X; painéis D e E: 40X. Barra = 100 um.
Tabela 1. Microscópio e as configurações da câmera para a imagem latente. Diretrizes para trabalhar com filtros de fluorescência e de imagem de campo claro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Secções tronco de A. thaliana são amplamente usados para o estudo da organização das células da parede celular secundária e para examinar qualitativamente as diferenças entre o tipo selvagem e plantas transgénicas. As técnicas comumente utilizadas para a secção dos espécimes são corte manual direta; ou quando as amostras são incorporados em agarose ou fixador, o seccionamento pode ser feito com um vibratome ou micrótomo. Em contraste com o lado de corte, os dois últimos permitem reduzir o risco de produzir diferenças imprecisos entre amostras que seriam simplesmente causadas por uma má preparação de amostra causado por diferenças de espessura entre as amostras e as superfícies irregulares. Todos esses métodos têm seus prós e contras. Escolhemos inclusão em agarose, seguido de corte usando um vibratome, e fê-lo pelas seguintes razões: a facilidade de incorporação e tempo gasto na utilização de agarose elimina a necessidade de processamento elaborado de tecido fresco. Além disso, nossos moldes caseiros são fácil e barato de fazer, pode manter ªe tronco reto, pode ser usado ao longo de muitos anos, e pode ajudar na fácil liberação de espécimes sem fazer uma bagunça. A melhor maneira de se dissolver de alta percentagem de agarose e obter uma solução homogénea (dissolução total de 7 g de agarose em 100 ml, sem a formação de grânulos grossos) é de autoclave ou de micro-ondas que ao menor intensidade. É importante para cortar o tecido do tronco fresco, ou, alternativamente, para guardá-lo em uma placa colocada sobre gelo contendo um papel de filtro molhado com água para evitar a desidratação dos tecidos e deformação. Armazenar a haste por períodos superiores a 30 minutos, sem alta umidade fará com que o tronco para secar. A temperatura de agarose a direita antes de a haste é incorporado deve ser de cerca de 50 ° C. É crítico para verificar a presença de bolhas de ar depois da agarose foi vertida para dentro do frasco, porque as bolhas de ar causar falhas no molde e, consequentemente, o corte será irregular. As bolhas de ar podem ser removidos rapidamente por colocação da solução sob vácuo antes despejandolo. A haste deve ser colocado no agarose, quando ainda não é suave e quente do que 50 ° C. O calor pode danificar a amostra por enrugamento da haste e vai destruir a morfologia celular. Se a agarose é muito frio a haste não irá penetrar através da incorporação de agarose e não será possível. Depois de incorporação de agarose, amostras do caule pode ser armazenado a 4 ° C até uma semana.
O uso de um vibratome em vez de rendimentos-seccionamento mão precisamente amostras e melhor qualidade de imagem cortada. Todas as instruções de segurança devem ser cuidadosamente lidas e seguidas ao usar um vibratome. É importante assegurar que o disco de amostra é limpo e seco para que o tecido adesivo para segurar a amostra fortemente no lugar de modo que não caia durante o corte. A espessura das amostras é especificado para suportar o ácido dura e tratamentos de base durante os procedimentos de coloração. A lâmina usada no vibratome deve ser completamente plana para garantir que a secção é cortada evenly. Seccionamento demora cerca de 20 min por amostra; , a fim de poupar tempo, amostras semelhantes podem ser seccionados em grupos em uma única placa de amostra. Durante o corte, as seções são transferidas da bandeja de tampão em uma pequena placa de Petri para fazer as seções mais fácil de ver em um fundo claro e para liberar a bandeja de tampão para os próximos espécime. As secções podem ser imediatamente utilizados para procedimentos de coloração a jusante ou armazenada para uso posterior. Alíquotas das seções do caule a 2,0 ml microtubos ajuda no condicionamento para procedimentos de coloração. Fazer ajustes corretos e configurações da câmera e microscópio são muito críticos para alcançar imagens de alta qualidade. Ajustar a iluminação Kohler é um dos passos mais importantes na utilização do microscópio. Os ajustes para a abertura ea intensidade da luz, como descrito na seção de métodos, são destinadas apenas como uma diretriz. Eles podem ter de ser modificado, dependendo do microscópio e camera utilizado. Nós usamos uma alta resoluçãocâmera digital com um chip grande formato CCD interline e sem obturador mecânico para imagens UV, calcofluor branco, e congo coloração vermelha; e uma câmera de alta resolução e cores de alta velocidade para imagens brilhantes em campo de Maule, floroglucinol e azul de toluidina O coloração. Foram analisadas imagens, processados e montados usando software de imagem padrão.
Floroglucinol é a mancha mais comumente utilizado para a determinação de lignina; não é um verdadeiro mancha lignina, uma vez que apenas as manchas com grupos terminais cinamaldeído. A mancha floroglucinol, também conhecido como Weisner mancha, produz uma cor de rosa ou cor de cereja característica fucsia no xilema e fibras interfasciculares onde estes grupos aldeído estejam presentes 4. A intensidade da cor rosa varia com o grau de lignificação. Apesar de diferenças sutis são mais difíceis de observar, é fácil de detectar diferenças entre o tipo selvagem e seções tronco mutantes que têm variações no seu teor de lignina 19. É também easy observar diferenças entre jovens (em direção ao ápice da haste) e mais velhos (caule base) tecidos, porque os níveis de lignificação entre esses tecidos variar. Normalmente em tipo selvagem caule, córtex e medula epiderme não contêm cinnamaldehydes (portanto, não se colorido) a menos que haja lignificação ectópica 20. Mancha Maule, por outro lado, é específica para unidades de lignina siringila e pode ser usado para diferenciar diferentes enriquecimentos de lignina em unidades S ou G (por exemplo, fibra contra os tecidos do xilema) 14,18. O permanganato de potássio e ácido clorídrico ato no núcleo de siringil da unidade S na lenhina para formar um methoxycatechol e, em seguida, ao metoxi-o-quinona seguindo a reacção com hidróxido de amónio. A mancha de Maule é um bom indicador para diferenciar os mutantes que não possuem ou são amplamente empobrecido em unidades S de lignina (eg em mutantes F5H de A. thaliana e plantas gimnospermas gerais), Maule dá amarelo-marrom coloração instead de vermelho, tanto no xilema e do esclerênquima 21. Pela mesma razão, a coloração Maule pode ser utilizado para diferenciar angiospermas, que contêm principalmente a partir de lignina S gimnospérmicas que tipicamente não possuem o aparelho S 18. Como o ácido forte e de base são utilizados durante o floroglucinol e procedimentos de coloração Maule, respectivamente, alguns passos experimentais devem ser realizados com cuidado. Ambos HCl concentrado e hidróxido de amônio são corrosivos fortes; eles podem deteriorar o estágio do microscópio e as lentes se os slides contendo os Ph-HCl e Maule amostras coradas não são tratadas adequadamente. Eles também podem secar-se rapidamente, dentro de 5-10 minutos, fazendo com que as amostras a deteriorar-se, de modo que a imagem tem que ser feito rapidamente. Azul de toluidina O é uma mancha policromática e manchas diferentes componentes da parede celular em diferentes cores como ele reage com diferentes componentes químicos da parede celular de forma diferente, produzindo uma amostra multi-coloridas. As cores geradas podem provide informação sobre a natureza da célula. Azul de toluidina O é também um corante catiónico que se liga aos grupos carregados negativamente 5,6. Uma solução aquosa deste corante é azul, mas de cores diferentes são gerados quando o corante liga-se com diferentes grupos aniónicos na célula. Por exemplo, as cores são uma púrpura rosada quando o corante reage com os polissacáridos carboxilados, tais como a pectina; verde, azul esverdeado ou azul brilhante com substâncias aromáticas, como lignina e taninos; e púrpura ou azul esverdeado com ácidos nucléicos. A coloração é fácil e pode durar durante dois dias.
Calcofluor manchas brancas celulose, calose, e outros β-glucanas não substituído ou fracamente substituído de 6-9, e manchas vermelhas congo directamente para β-(1 → 4)-glucanos e em particular a celulose 8,10,11. Calcofluor manchas brancas brilhantemente a epiderme, córtex e medula, mas que o brilho é reduzido significativamente no xilema e fibras interfasciculares. Há dois pOSSÍVEIS explicações para a fluorescência reduzida de branco calcofluor em tecidos fortemente lignificadas; um atribui à presença de lignina, o que, por sua vez, reduzir a capacidade de branco calcoflúor difundir adequadamente através dos polissacáridos. A segunda explicação aponta para uma extinção parcial da fluorescência emitida pelo calcoflúor branco animado sob UV. Em contraste com Calcofluor branco, congo coloração vermelha parece menos afectado pela presença de lignina. Ele pode estar relacionado com a diferença de propriedades de fluorescência entre calcofluor branco e vermelho congo; uma melhor capacidade de difusão de vermelho Congo através dos tecidos lignificadas que calcofluor branco; ou uma pequena diferença de polissacarídeos propriedades de ligação 22. É importante notar que os cortes corados com vermelho congo não deve ser armazenado por muito tempo antes de imagem, porque congo vermelho tende a ficar lavado em água.
Embora a coloração histoquímica é nem quantitativanem absolutamente conclusivo, pode revelar por meio de sinais visuais uma riqueza de informações sobre características importantes, tais como a integridade dos tecidos ou à deposição da parede celular anormal e lignificação. As técnicas de coloração acima descritos são fáceis de realizar e são aplicáveis a elementos críticos em uma parede de célula de planta, tais como a lenhina e de celulose. Em contraste, a imunofluorescência utilizando anti-soros específicos e os anticorpos monoclonais é necessário para a detecção de vários componentes de hemicelulose e pectina. Este relatório foi criado para servir como um primer para iniciantes no campo da coloração da parede celular secundária que usam A. thaliana como sistema modelo.
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Acknowledgments
Somos gratos a Sabin Russell para a assistência edição. Este trabalho fez parte do Instituto Joint BioEnergy DOE (http://www.jbei.org), apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Instituto de Pesquisa Ambiental e Biológica, por meio do contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley Laboratório Nacional e do Departamento de Energia dos EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2 ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6 ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4 °C or 20 °C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17 mm. |
| Frosted Micro Slides, 1 mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm - 1 mm |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 | |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
References
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M.
- Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W.
- Humphreys, J. M., Chapple, C.
- Adler, E.
- Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
- Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
- Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
- Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
- Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
- Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
- Liljegren, S.
- Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
- Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
- Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
- Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
- Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
- Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
- Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
- Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).
