Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Nukleosidtrifosfaterna - Genom syntes till Biochemical karakterisering

Published: April 3, 2014 doi: 10.3791/51385
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

Summary

Protokollet som beskrivs här syftar till att förklara och förkorta de många hinder i vägen för den intrikata vägen som leder till modifierade nukleosidtrifosfater. Följaktligen underlättar detta protokoll både syntesen av dessa aktiverade byggstenar och deras tillgänglighet för praktiska tillämpningar.

Abstract

Den traditionella strategin för införandet av kemiska funktionaliteter är användningen av fast-fas-syntes genom att lägga lämpligt modifierade fosforamidit prekursorer till den framväxande kedjan. Men de villkor som används under syntesen och begränsningen till ganska korta sekvenser hindra tillämpligheten av denna metod. Å andra sidan, är modifierade nukleosidtrifosfater aktiverade byggstenar som har använts för den milda inledningen av ett stort antal funktionella grupper i nukleinsyror, en strategi som banar väg för användning av modifierade nukleinsyror i en bred palett av praktiska tillämpningar såsom funktionell märkning och generering av ribozymer och DNAzymes. En av de stora utmaningarna är bosatt i intrikat av den metod som leder till isolering och karakterisering av dessa nukleosidanaloger.

I denna video artikeln presenterar vi ett detaljerat protokoll för syntes av these modifierade analoger med hjälp av fosfor (III)-baserade reagenser. Dessutom är det förfarande för biokemisk karakterisering röjas, med särskild tonvikt på primerextensionsprodukter reaktioner och TdT svans polymerisation. Denna detaljerade protokoll kommer att vara till nytta för att tillverka av modifierade dNTP och deras vidare användning i kemisk biologi.

Introduction

5'-nukleosidtrifosfater ((d) NTP) representerar en klass av viktiga biomolekyler som är inblandade i otaliga processer och funktioner som sträcker sig från att vara den universella valutan av energi till regulatorer av cellmetabolism. Förutom deras roll i dessa fundamentala biologiska förändringar, har sina modifierade motsvarigheter fram som en mångsidig och mild plattform för införandet av funktionella grupper i oligonukleotider, en metod som fint kompletterar den automatiska fastfassyntesen som brukar tillämpas 1,2. I själva verket, förutsatt att (d) NTP kan fungera som substrat för RNA-och DNA-polymeraser 3, en mängd funktionella grupper bland aminosyrorna 4-13, boronsyror 14,15, nornbornene 16, diamondoid liknande rester 17, sidokedjor för organocatalysis 18, gallsyror 19 och till och med oligonukleotider 20 kan föras in i oligonukleotider.

_content "> Bortom representerar ett bekvämt vektor för funktionalisering av nukleinsyror, kan modifierade dNTP vara engagerade i SELEX och andra kombinatoriska metoder för in vitro-selektion för generering av modifierade katalytiska nukleinsyror 21-30 och aptamers för olika praktiska tillämpningar 10, 31-36. De extra sidokedjor som införs genom polymerisation av de modifierade dNTP tros öka den kemiska utrymme som kan utforskas under ett urval experiment och komplettera ganska dålig funktionella arsenal av nukleinsyror 37. Trots dessa attraktiva egenskaper och den senaste tidens framsteg som gjorts i utvecklingen av både syntetiska och analytiska metoder, inte allmängiltiga och högavkastande förfarande existerar för crafting av modifierade nukleosidtrifosfater 2,38.

Syftet med detta protokoll är att belysa i den (ibland) invecklade procedurer leder to syntesen och biokemisk karaktärisering av dessa aktiverade byggstenarna (Figur 1B). Särskild vikt kommer att läggas på alla syntetiska detaljer som ofta är svåra att hitta eller är frånvarande i experimentella sektioner men är ändå avgörande för ett framgångsrikt slutförande av den syntetiska väg som leder till isolering av rena (d) NTP (Figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntes av de modifierade nukleosidtrifosfatema

Den syntetiska strategi som valts följer det förfarande som utvecklats av Ludwig och Eckstein eftersom denna metod är i allmänhet pålitliga och leder till mycket få sidoprodukter (Figur 1A) 39.

  1. Samindunsta den lämpligen 3'-OAc-skyddad nukleosid (typiskt 0,1 mmol) två gånger med vattenfri pyridin (2 ml) och torka sedan under vakuum över natten. Samtidigt, torr tributylammoniumpyrofosfat (0,13 mmol) under vakuum över natten.
  2. Lös nukleosiden i ett minimum av torr pyridin (0,2 ml) och tillsätt torr dioxan (0,4 ml) som ett samlösningsmedel. Slutligen, tillsätt 2-klor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (0,11 mmol) och låt reagera vid rumstemperatur under 45 min.
    OBS: Det är anmärkningsvärt att särskild försiktighet bör iakttas med 2-klor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-en-reagens. I själva verket, även lagring av detta reagens under en inert gas atmosfhär är inte tillräcklig för att förhindra dess nedbrytning. Sålunda den vita fasta substansen som bildas i denna sönderdelning kan och bör skrapas bort före användning.
  3. Bered en lösning av tributylammoniumpyrofosfat i torr DMF (0,17 ml) och nydestillerad tributylamin (58 pl, aldrig lägga molekylära filter). Lägg till den resulterande lösningen till reaktionsblandningen (en vit fällning bildas men snabbt försvinner) och lämnas att reagera vid rumstemperatur under 45 min.
  4. Bered en lösning av jod (0,16 mmol) i pyridin (0,98 ml) och H2O (20 ^ il) och tillsätt till reaktionsblandningen i syfte att oxidera Pα (III) centrum. Låt den resulterande mörka lösningen omrördes vid rumstemperatur under 30 min.
  5. Använd en 10% vattenhaltig lösning av NaS 2 O 3 för att släcka överskottet av I2. Avlägsna lösningsmedlet under vakuum (temperaturen på vattenbadet på den roterande torken måste hållas under 30 ° C). Lägg H2O (5 ml) och låt mixture stå vid rumstemperatur under 30 min för att hydrolysera cyklisk trifosfat molekyldel.
  6. I detta skede är de skyddande grupperna avlägsnas vanligtvis (dvs. i 3'-OAc och grupperna på sidokedjorna av nukleobasen). Följaktligen lägger NH4OH (30% i H2O, 10 ml) till den råa och rör om under 1,5 h vid rumstemperatur, och avlägsna lösningsmedlet under vakuum.
  7. Tillsätt 2 ml H2O och delas upp i två rör. Lägg till 12 ml av en 2% lösning av NaClO 4 i aceton och centrifugera (1000 xg) i 30 min. Detta förfarande upprepas en gång till. Denna utfällning möjliggör separation av lösningsmedlen och reagensen som används vid syntesen av trifosfat (som kommer att fälla ut), vilket förenklar den efterföljande RP-HPLC-rening avsevärt.
  8. Efter lufttorkning av den oljiga återstoden, spela in ett 31 P-NMR-spektrum av den råa (enligt standardförfaranden, se även lista över material och fig. 3) ochlös upp i 4 ml H2O
    OBS: Denna syntetiska procedur är främst inriktad på generering av modifierade deoxinukleosidtrifosfater, men ett mycket liknande förfarande kan tillämpas för deras RNA motsvarigheter (genom att bara använda 2 ', 3'-bis-O-acetylerade prekursorer).

2. HPLC Rening av de modifierade nukleosidtrifosfatema

  1. Framställning av en 1 M stamlösning av trietylammoniumbikarbonat (TEAB): 40
    1. Bered en lösning av 1 mol av trietylamin (139 ml) i ≈ 600 ml destillerat och filtrerat H2O
    2. Bubbla CO 2 (via torris och gasinloppsrör) in i lösningen under kraftig omrörning tills ett pH av 7,6 uppnåtts (detta kommer att ta minst 10 h). Denna stamlösning kan förvaras i kylen i upp till en månad.
  2. Rening:
    1. Bered två buffertlösningar från 1 M lager: 2 L 50 mM TEAB i ultrarent vatten (eluent A) and 1 L av 50 mM TEAB i 50% MeCN (eluent B). Degas båda eluenter under vakuum och omrörning under 20 min (uppmärksamhet krävs för att inte ändra pH genom att avlägsna CO 2 under avgasning).
    2. Framställ ett analytiskt prov genom att lösa upp 10 | il av den råa trifosfat i 300 | il destillerat H2O och injicera i ett HPLC-system utrustat med en semipreparativ RP-kolonn (C18) och med användning av en gradient som sträcker sig från 0-100% B under 40 min (Figur 4). Justera HPLC-programmet enligt den Rt av trifosfat (som vanligtvis är den största toppen på kromatogrammet) och difosfat (som har en något lägre R t). Rena den råa blandningen med hjälp av dessa villkor och genom att ta bort tidiga fraktioner som kan innehålla något difosfat.
    3. Kombinera alla fraktioner som innehåller produkten och frystorka (vilket är föredraget att avdunstning i en rotationsindunstare för att minimera hydrolys till den oönskade diphosphåt). Samindunsta flera gånger med ultrarent vatten (för att avlägsna kvarleva trietylamin från eluenter). Bedöm renheten av trifosfat genom NMR (båda 1 H och 31 P-NMR) och MALDI-TOF genom tillämpning av standardprotokoll (se figur 5). Typiska utbyten som erhållits genom tillämpning av detta protokoll ligger typiskt i intervallet 30-70%, beroende på underlaget.

3. Primerförlängningsreaktioner och TdT Polymerisation

  1. 5'-änden märkning av primern
    1. Blanda 30 pmol av lämplig primer (t ex P1, Lista över material) med 4 l av 10x polynukleotidkinas (PNK) buffert, 3 pl av γ-[32 P]-ATP, 1 pl PNK, och DDH 2 O (för en total reaktionsvolym av 40 pl). Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C under 30 min och sedan värme-inaktivera kinaset (10 min vid 70 ° C).
    2. Under märkningsreaktionen förberedaen G10 Sephadex-kolonn genom att ansluta en 1 ml pipettspets med silaniserad glasull och fylla spetsen med G10-lösning (10% i DDH 2 O, autoklaverat). Spinn ner och tvätta tre gånger med 500 l DDH 2 O och en slutlig tvätt med 50 ^ DDH 2 O. Kör reaktionsblandningen genom G10 (för att avlägsna fri radioaktiv markör).
    3. Gel rena (SIDA 20%) den radiomärkta primer och återhämta sig genom tillämpning av trängseln och blöt metod (dvs. eluering med 500 l av en vattenlösning innehållande 1% LiClO 4 och 1 mM NEt3 (pH 8) vid 72 ° C i 15 min). Etanol fällning och G10 avsalta eluerade oligonukleotiden.
  2. Primer-förlängningsreaktion
    1. Glödgning 1 pmol av radioaktivt märkt primer P1, 10 pmol primer P1, och 10 pmol av mall T1 (Lista över material) i 10x reaktionsbuffert (tillhandahålls av leverantören av polymeras som ska användas) genom att placera tUbe i varmt (90-95 ° C) vatten och genom att den fick gradvis svalna till rumstemperatur (under 45 min).
    2. Placera röret på is och tillsätt (i sin tur) dNTP cocktail (som innehåller både den modifierade och de naturliga trifosfater, 100 mikroM slutlig koncentration) och 1 U av DNA-polymeras (Vent (exo -), Klenow, Pwo eller 9 ° N m) och komplett med vatten (för en total reaktionsvolym av 20 pl). Inkubera vid optimal arbetstemperatur av enzymet (t ex 60 ° C i 30 minuter när Vent (exo -) används).
    3. Tillsätt 20 | il stopplösning (formamid (70%), etylendiamintetraättiksyra (EDTA, 50 mM), bromfenolblått (0,1%), xylencyanol (0,1%)), värma proven (95 ° C, 5 min), kyla ned (0 ° C), och lösa genom denaturerande polyakrylamidgelelektrofores. Visualisera genom fosforavbildning.
  3. TdT-polymerisation
    1. Späd 7 pmol av enkelsträngat, Omärkt primer P2 (Lista över material), 1 pmol av radioaktivt märkt primer i 1 pl TdT buffert 10x.
    2. Placera röret på is och tillsätt (i sin tur) dNTP cocktail (vid en adekvat koncentration av mellan 10 och 200 | iM) och TdT-polymeras (4 U). Inkubera vid 37 ° C under 1 timme. Tillsätt 10 | il stopplösning, värma proven (95 ° C, 5 min), nedkylning (0 ° C), och lösa genom denaturerande polyakrylamidgelelektrofores (PAGE 15%). Visualisera genom fosforavbildning.

4. PCR med modifierade nukleosidtrifosfatema

  1. Blanda 8 pmol både framåt och bakåt primers med 0,5 pmol av den mall som ska förstärkas. Lägg 10x reaktionsbuffert och dNTP-cocktail (för en 200 mikroM slutlig koncentration) och sätta röret på is. Lägg ett U av DNA-polymeraset och komplett med H2O för att nå en slutlig volym av 20 | il. Överför blandningen till en PCR-rör och genomför 30 PCR-cykler.
  2. Späd 6 jil med 6 pl av 2x sackaros laddningsbuffert och lösa genom agaros 2% (färgade med etidiumbromid) elektrofores. Visualisera genom fosforavbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Modifierade nukleosidtrifosfater är lockande syntetiska mål eftersom de möjliggör den enkla införandet av ett brett spektrum av funktionella grupper i nukleinsyror 41. Emellertid är isolering och karakterisering av dessa aktiverade byggstenarna ofta visar sig vara mödosam. Följaktligen är de resultat som visas häri tänkt att ge en hjälpande hand för att följa de olika stegen inom tidigare nämnda syntetiska och biokemiska förfaranden (se figur 1b).

Särskilt Figur 3 visar en typisk rå 31 P-NMR-spektrum av en modifierad dNTP (i detta fall, dU BPU TP (4) 18, figur 2), där kan observeras de karakteristiska signaler för fosforcentra (dvs. en dubblett vid -5,02 (P γ), en dubblett vid -10,44 (P α) och en triplett vid -20,55 (P β) ppm). Dessutom ärignals härrör för difosfat (två dubbletter på -4,84 och -10,63 ppm) och monofosfat (sing -0.18 ppm vid) sidoprodukter tillsammans med högre fosfater (signaler på -21,02 och -23,19 ppm) alltid observeras i detta skede. En första RP-HPLC-analys av den råa blandningen som visas på figur 4 (för dU BPU TP (4)) där den största toppen (Rt = 30,78 min) motsvarar den 5'-trifosfat, medan det huvudsakliga biprodukt, den 5 '-difosfat, visar en något lägre retentionstid (Rt = 30,03 min). Slutligen, efter en grundlig RP-HPLC-rening, behöver den modifierade dNTP ska präglas av NMR och MALDI-TOF (Figur 5). Både 1 H-NMR och 31 P-NMR-spektra är avgörande för att bedöma renheten av de modifierade dNTP, eftersom närvaron av oönskade di-och mono-fosfater ger särskiljande signaler.

Efter upprättandet av renheten hos de nucleoside analoga och bedöma koncentrationen av stamlösningen antingen massa eller med UV-spektroskopi, kan den modifierade dNTP användas i primerextensionsprodukter reaktioner för att bedöma sin kapacitet substrat acceptans av olika polymeraser. Figur 6 visar resultatet av primerförlängningsreaktioner med dU t P TP (2), dA Hs TP (6), och dC Val TP (7) användas antingen som ensamstående modifieringar (spår 5-7), som kombinationer av två modifierade dNTP (spår 8-10), eller tillsammans tillsammans med den ensamme naturliga dGTP (bana 11).

Slutligen visar Figur 7 visar representativa TdT-medierade polymerisationsreaktioner med olika modifierade dUTP analoger. I detta sammanhang dU c P TP (1) och dU FP TP (3) är de bästa substraten för TdT (fält 1 och 4), eftersom slagg effektivitet är jämförbara eller överstiger kraven i naturliga dTTP (spår 6). Istället dU BPU TP (4) (spår 5) är en ganska dålig substrat i sammanhanget eftersom kan observeras lite polydispersa längre stora oligonukleotider.

Figur 1
Figur 1. A) Ludwig-Eckstein metod för syntes av (bas) modifierade nukleosidtrifosfater 39. B) Schematisk bild av alla de steg som krävs för syntes och biokemisk karakterisering av modifierade dNTP före deras användning i applikationer såsom SELEX. Klicka här för att se större bild .

"Fo: innehåll-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figur 2. Kemiska strukturer hos de modifierade nukleosidtrifosfater: dU c P TP (1), dU t P TP (2), dU FP TP (3) dU BPU TP (4) dU B TP (5), 18 dA Hs TP ( 6), och dC Val TP (7) 13. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
31 P-NMR-spektrum (121 Figur 3. 0,4 MHz, D 2 O) av den råa reaktionsblandningen av dU BPU TP (4). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4
Figur 4. RP-HPLC-profilen av rå dU BPU TP (4): 0-100% elueringsmedel B i 40 min, flödeshastighet: 3,5 ml / min (elueringsmedel A: 50 mM TEAB i H2O, eluent B: 50 mM TEAB i H 2 O / CH 3 CN (1/1)). Klicka här för att visa en större bild .

/ 51385fig5.jpg "width =" 600px "/>
Figur 5. Karakterisering av den modifierade nukleosidtrifosfat dU B TP (5): A) 31 P-NMR-spektrum (121,4 MHz, D2O, 128 scanningar), 18 B) 1 H-NMR-spektrum (300 MHz, D2O, 128 scanningar ). C) MALDI-TOF-spektrum Klicka här för att visa en större bild .

Figur 6
Figur 6. Representativ bild av gelen (SIDA 15%) av primerextensionsprodukter reaktioner med olika bas modifierat dNTP-analoger Lane 1:. Primer; bana 2: natur dNTP utan dUTP; bana 3: naturliga dNTP utan dATP; bana 4: naturliga dNTP utan dCTP; lane 5: dU <em> t P TP (2); lane 6: dA Hs TP (6); spår 7: dC Val TP (7); bana 8: dA Hs TP (6) och dU t P TP (2); körfält 9: dA Hs TP (6) och dC Val TP (7); bana 10: dU t P TP (2) och dC Val TP (7); bana 11: dU t P TP (2), dA Hs TP (6), och dC Val TP (7); bana 12:. naturliga dNTP Klicka här för att visa en större bild .

Figur 7
Figur 7. Gel bilden (PAGE 20%) av TdT polymerisationsreaktioner med olika bas modifierad dUTP analoger Lane 1:. DU c P TP (1); lane 2: dU t P TP (2); lane 3: dU B TP (5); lane 4: dU FP TP (3); lane 5: dU BPU TP (4); lane 6: dTTP; lane 7: primer. Koncentrationer:. 10 ^ M, 25 pm, 50 pm, 75 pm, och 100 ^ M Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Införandet av ändringar i nukleinsyror är av intresse för många praktiska tillämpningar, inklusive utvecklingen av antisens-och antigenmedel 42,43, märkning och funktionell märkning av oligonukleotider 41, och i arbetet med att utvidga den genetiska alfabetet 44-46. Kemiska förändringar och funktionella grupper vanligen införes i nukleinsyror genom användning av standard-och automatiserade fastfas-syntesprotokoll. Men fosforamiditmetoden byggstenar måste vara motståndskraftiga mot de ganska hårda villkor som denna metod, vilket i sin tur innebär en allvarlig begränsning på naturen av den kemiska funktionalitet 47. Istället enzymförmedlad polymerisation av modifierade nukleosidtrifosfater möjliggör införandet av ett bredare spektrum av funktioner, eftersom den enda begränsningen är att de fungerar som substrat för polymeraserna 1,2. Även om det finns en märkbar brist på genmänhet tillämplig metodik, tillförlitlig och robust syntetiska och analytiska metoder har utvecklats för syntes av modifierade dNTP. Dessutom, på grund av sin beskaffenhet modifierade trifosfater är ganska känsliga för olika yttre förhållanden (t.ex. pH, temperatur) och därmed är mycket fördelaktigt ett detaljerat protokoll för deras syntes och karakterisering.

Arbetsflödet presenteras häri innefattar kemisk syntes av modifierade dNTP, RP-HPLC-rening, NMR-analys, och enzymatiska analyser för den biokemiska karakteriseringen av dessa nukleosidanaloger. De mest kritiska stegen för en lyckad syntes och karakterisering av modifierade dNTP är analysen av den råa produkten (genom NMR), den grundliga HPLC-rening, analys av det renade materialet, och val av ett lämpligt DNA (RNA)-polymeras.

För syntes av de modifierade dNTP tillämpade vi den metod som utvecklats av Ludwig och Eckstein 39, eftersom färre biprodukter bildas jämfört med andra förfaranden, om än på bekostnad av en något längre syntetisk väg. Vidare representerar RP-HPLC-rening verkligen svängnings steget i hela syntesvägen, eftersom det kommer att möjliggöra separationen av de nukleosida difosfater (dNDPs) som ofta kraftigt hämmar DNA-och RNA-polymeraser 48. Efter att ha uppnått den syntes och rening, måste bedömas både genom NMR och MALDI-TOF för att säkerställa att ingen polymerashämmande difosfat är närvarande är renheten hos den resulterande trifosfat.

Införlivandet analysen visas i figur 6 stryker tydligt nyttan av detta tillvägagångssätt. I själva verket alla av dNTP som används i detta representativt exempel avslöja att vara goda substrat för DNA-polymeras (i det här fallet Vent (exo -)) eftersom ingen snabbare kör band motsvarande mindre fragment kunde observeras. Besides, tolererar enzymet två substrat prydd med karboxylsyrarester (dU t P TP (3) och dC Val TP (7)) och polymerisation av båda dNTP ger en oligonukleotid bär inte mindre än 39 andra negativa laddningar. En annan slående är att de band som följer av införlivandet av modifierade dNTP visar ofta långsammare elektroforetiska rörlig än de naturliga kontroller (jämför t.ex. banorna 11 och 12). Således primerextensionsprodukter reaktioner utgör ett kraftfullt men ändå enkelt sätt att bedöma underlaget acceptans av modifierade dNTP.

Dessutom är TdT-förmedlad polymerisation av trifosfater på 3'-termini av enkelsträngade oligonukleotider en lockande strategi för generering av högt funktionaliserade nukleinsyror 49-52. Det representativa exempel visas i Figur 7 visar klart förfarandet för selekting de funktioner som tolereras av Co2 +-beroende TdT 53. Faktum dU c P TP (1) och dU FP TP (3), som är utrustade med den proteinogenic aminosyran L-prolin och dipeptiden α-Phe-Pro, respektive, är de bästa substrat för TdT och gav upphov till svans effektivitetsvinster som jämför gynnsamt till den omodifierade dTTP kontroll, även vid så låga koncentrationer som 10 ^ M (fält 1 och 4). Överraskande, analog dU t P TP (2) Om den prolinrest är ansluten till länkarmen i träns i förhållande till den fria karboxylsyran, är inte lika bra substrat som dess cis motsvarighet sedan polydispers längre stora oligonukleotider endast observerades vid högre dNTP-koncentrationer (> 100 fiM, lane 2). Vidare är den sulfonamid-modifierade dNTP 5 en moderat substrat för TdT och jämförbar med dU t P TP (2) (bana 3). Dessutom dU BPU TP (4), som bär en stark vätebindningsdonerande motiv, är ett ganska dåligt substrat för TdT och polymerisationsreaktionen verkar vara likgiltig för koncentrationen av den modifierade dNTP. Således kan följande ordning av substrat acceptans tolkas från Figur 7: dU c P TP (1), dU FP TP (3)> dU t P TP (2), dU B TP (5)> dU BPU TP (4 ).

Slutligen är det förfarande som beskrivs för polymerisationsreaktioner enligt PCR-betingelser med användning av de modifierade analoger snarare liknar ärendet naturliga dNTP. Det är dock av avgörande betydelse förenlighet modifierade dNTP med polymeraser under dessa förhållanden för generering av hög densitet functionalized nukleinsyror 7, i synnerhet med avseende på deras användning i in vitro-selektionsexperiment.

Sammanfattningsvis var metoden för syntes och karakterisering av modifierade nukleosidtrifosfater betonas och inrättandet av ett sådant protokoll kommer säkert att bidra i utvecklingen och tillverka av nya analoger. Samtidigt skall framväxten av sådana nya dNTP underlättar uppkomsten av funktion oligonukleotider; bestämt katalytiska nukleinsyror.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (Grants n ° PZ00P2_126430 / 1 och PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann är tacksamma för att tillhandahålla labb utrymme och utrustning, liksom för hans ständiga stöd. Ms Sue Knecht är känd för givande diskussioner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
Dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
γ-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo-) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).

Tags

Kemi nukleinsyraanaloger bioorganisk kemi PCR primerförlängningsreaktioner organisk syntes PAGE HPLC nukleosidtrifosfater
Nukleosidtrifosfaterna - Genom syntes till Biochemical karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hollenstein, M., Smith, C. C.,… More

Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter