Summary
तरीके पौधों के अर्क की पतली परत chromatographic (टीएलसी) जुदाई और जीवाणुरोधी मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए संपर्क bioautography के लिए वर्णित हैं. तरीकों गोजातीय रूमेण का निवासी हाइपर अमोनिया उत्पादन बैक्टीरिया (HAB) बाधा लाल तिपतिया घास phenolic यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए लागू कर रहे हैं.
Abstract
संयंत्र रोगाणुरोधी यौगिकों के लिए एक सामान्य स्क्रीन (जैसे कवक या बैक्टीरिया शोरबा में या अगर), रोगाणुओं के लिए समय में विकसित करने की अनुमति माइक्रोबियल निलंबन को chromatograms उजागर, कागज या पतली परत क्रोमैटोग्राफी (पीसी या टीएलसी) द्वारा पौधों के अर्क को अलग करने के होते हैं एक आर्द्र वातावरण, और कोई माइक्रोबियल विकास के साथ क्षेत्रों visualizing. bioautography के रूप में जाना जाता है इस स्क्रीनिंग विधि की प्रभावशीलता, chromatographic जुदाई की गुणवत्ता और माइक्रोबियल संस्कृति शर्तों के साथ ध्यान रखा दोनों पर निर्भर करता है. इस पत्र एसिड fermenting बैक्टीरिया एमिनो एक उपन्यास आवेदन के साथ टीएलसी और संपर्क bioautography के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. निकालने लचीला (एल्यूमीनियम समर्थित) सिलिका टीएलसी प्लेटों पर अलग है, और बैंड पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत कल्पना कर रहे हैं. जोन परीक्षण सूक्ष्मजीव साथ inoculated अगर पर बाहर कटौती और चेहरा नीचे incubated हैं. निरोधात्मक बैंड अगर प्लेट धुंधला द्वारा कल्पना कर रहे हैंएस के साथ tetrazolium लाल. विधि लाल तिपतिया घास की जुदाई (Trifolium pratense CV. Kenland) phenolic यौगिकों और क्लोस्ट्रीडियम sticklandii, गोजातीय रूमेण का निवासी है कि एक अति अमोनिया उत्पादन जीवाणु (HAB) के खिलाफ गतिविधि के लिए उनकी स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जाता है. टीएलसी तरीकों (एरोबिक या anaerobic), साथ ही कवक पौधों के अर्क और अन्य प्रजातियों के जीवाणु के कई प्रकार के लिए लागू संस्कृति शर्तों प्रजातियों के विकास की आवश्यकताओं को फिट करने के लिए संशोधित कर रहे हैं, परीक्षण जीवों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
पौधों में रोगाणुरोधी यौगिकों के लिए परख, एक संयंत्र निकालने के घटकों को अलग करने के लिए उन घटकों के लिए एक परीक्षण सूक्ष्मजीव उजागर, और सूक्ष्मजीव के विकास यौगिकों में से किसी से हिचकते है निर्धारित करने की आवश्यकता है. कई यौगिकों एक planar सतह पर अलग किया जा सकता है क्योंकि कागज या पतली परत क्रोमैटोग्राफी (पीसी या टीएलसी) द्वारा विभाजन सुविधाजनक हैं. पृथक्करण कुछ यौगिकों पी लेनेवाला (पीसी के मामले में सेल्यूलोज, और टीएलसी के मामले में Adsorbents की एक किस्म) को कसकर बाध्यकारी और दूसरों को कम से कम 1 पलायन के साथ, ध्रुवता पर आधारित है. संख्या 1 के सापेक्ष स्थिति का एक उदाहरण प्रदान करता है एक सिलिका टीएलसी थाली पर जुदाई के बाद ध्रुवीय और nonpolar phenolic यौगिकों.
चित्रा 1. एक सिलिका पतली परत chromatographic (टीएलसी) प्लेट पर अलग होने के बाद अलग छोर के यौगिकों का वितरण illustrating आरेख. लाल तिपतिया घास (Trifolium pratense एल) के फिनोलिक यौगिकों एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. ऐसे clovamide के रूप में ध्रुवीय यौगिकों,,, सिलिका की तरह एक ध्रुवीय पी लेनेवाला के लिए एक मजबूत संबंध हैं और मूल (या) के पास रहते हैं, जबकि इस तरह के विलायक सामने के पास तीन isoflavones (एस एफ), विभाजन और अधिक आसानी से विलायकों में के रूप में कम ध्रुवीय यौगिकों, (पानी, एसिड, या कुर्सियां शामिल किए गए हैं, जब तक कि सिलिका से भी कम ध्रुवीय हैं) और आगे थाली ऊपर की ओर पलायन.
एक टीएलसी थाली पर एक उद्धरण की जुदाई के बाद, परीक्षण सूक्ष्मजीवों इस प्रकार एक उद्धरण 2 के सक्रिय घटकों की पहचान तेजी, थाली पर सभी यौगिकों से अवगत कराया जा सकता है. एक कवक या जीवाणु संस्कृति वर्णलेख के संपर्क में है, तो माइक्रोबियल विकास विकास अवरोध करनेवाला के साथ क्षेत्रों में छोड़कर हर जगह पाए जाते हैं जाएगाY यौगिकों. निषेध के क्षेत्रों तब कवक 3 लागू किया गया है अगर mycelial विकास और विकास से मुक्त क्षेत्रों के बीच विपरीत देख कर या कोशिकाओं 4 रहने से कम या hydrolyzed जब रंग बदलने कि यौगिकों के साथ छिड़काव द्वारा देखे जा सकते हैं. रोगाणुरोधी assays के लिए कागज या पतली परत chromatograms का उपयोग पहली एंटीबायोटिक दवाओं 5 और fungicides 3,6 करने के लिए लागू किया गया था हालांकि, संयंत्र निष्कर्षों अब अक्सर अक्सर bioautography के रूप में निर्दिष्ट इस विधि के साथ रोगाणुरोधी यौगिकों के लिए जांच कर रहे हैं. वर्णित प्रोटोकॉल के साथ साथ पतली परत chromatograms के bioautography पर लागू होते हैं. यह अपेक्षाकृत तेजी से है और विभिन्न Adsorbents (जैसे सिलिका, स्टार्च, एल्यूमिना), के रूप में भी अच्छा संकल्प और संवेदनशीलता 1 प्रदान करने पर किया जा सकता है क्योंकि टीएलसी व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है.
पौधों के अर्क कई मायनों में टीएलसी के लिए तैयार किया जा सकता है. आम तरीकों कृत्रिम अंग केन्द्र में निकालने संयंत्र सामग्री शामिलऐसे संभवतः एसिड या आधार 9 के अलावा के साथ 80% इथेनॉल 7,8, के रूप में ohol पानी के मिश्रण. वे एक न्यूनतम मात्रा में टीएलसी प्लेटों के लिए लागू किया जा सकता है, ताकि कुछ पानी रोकने और संभवतः अम्लीय या बुनियादी रहे हैं जो इस तरह के विलायकों, में एक निकासी के बाद, अर्क केंद्रित किया जाना चाहिए. शराब से पानी के अर्क की एकाग्रता पानी अमिश्रणीय कार्बनिक विलायकों 8 के साथ या इस तरह के एथिल एसीटेट एथिल ईथर (1:1, वी / वी) 10,11 जैसे विलायकों, का एक मिश्रण के साथ विभाजन से हासिल किया जा सकता है. विभिन्न संयंत्र मेटाबोलाइट्स उनके छोर पर निर्भर करता है, विभिन्न कार्बनिक विलायकों में निकाले जाते हैं. संयंत्र है कि कार्बनिक अम्ल या ठिकानों इस स्तर पर कार्बनिक विलायकों में निकाला हैं सुनिश्चित करने के लिए, एक शराब का पानी निकालने के पीएच उठाया या तो कर रहे हैं, जो उनके nondissociated रूपों में अलग analytes कन्वर्ट करने के लिए एक पानी में घुलनशील एसिड या आधार के साथ उतारा जा सकता है तटस्थ कार्बनिक विलायकों 9 में घुलनशील. जैविक चरण तो ई किया जा सकता हैकम दबाव के तहत या नाइट्रोजन के तहत vaporated और टीएलसी के लिए वांछित मात्रा को समायोजित. निकालने के पीएच तटस्थ विलायकों, छोटे अंतिम मात्रा, और पूर्व जुदाई के लिए टीएलसी थाली पर निकालने का वाष्पीकरण में analytes के विभाजन की वजह से bioassay सूक्ष्मजीवों के लिए घातक होने की संभावना नहीं है.
कवक और बैक्टीरिया दोनों 2 निकालता संयंत्र की bioautography में परीक्षण सूक्ष्मजीवों के रूप में कार्यरत हैं. एक पोषक तत्व समाधान में प्लेटों पर छिड़काव किया और कई दिन 3 के लिए एक नम वातावरण में incubated अगर ऐसी Cladosporium cucumerinum के रूप में कुछ कवक के बीजाणु, (अलावा निरोधात्मक यौगिकों के साथ क्षेत्रों से) टीएलसी प्लेटों पर उगना. सी. के अंधेरे फुई noninhibitory क्षेत्रों पर cucumerinum mycelial विकास के मुक्त क्षेत्र के लिए एक तेज विपरीत प्रदान करता है. बैक्टीरिया में एक ही तरीके 4,12 में पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) प्लेटों के लिए लागू किया गया है, जीवाणु भी टीएलसी पर डालते रहे हैंअगर में थाली सतहों 13,14 overlays. ऐसे Candida albicans के रूप में खमीर,, साथ ही 14 अगर ओवरले में लागू किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, टीएलसी प्लेटें बैक्टीरिया 10,15 या खमीर 8, संपर्क bioautography 2 के रूप में जाना विधि के साथ inoculated अगर पर नीचे चेहरा रखा जा सकता है.
हम लाल तिपतिया घास (Trifolium pratense CV. Kenland) से रोगाणुरोधी phenolic यौगिकों के लिए स्क्रीन संपर्क bioautography के लिए एक विधि का वर्णन. परीक्षण सूक्ष्मजीव क्लोस्ट्रीडियम sticklandii, एक ruminal हाइपर अमोनिया उत्पादन जीवाणु (HAB) और आग्रही वातनिरपेक्षी है. इस्तेमाल किया विभाजन निकालने के सभी घटकों को हल नहीं करते हैं, वे इस प्रकार संभव रोगाणुरोधी यौगिकों के पूल संकुचन, रोगाणुरोधी गतिविधि के क्षेत्रों की पहचान की सुविधा. प्रोटोकॉल टीएलसी 1 के लिए मानक प्रक्रियाओं का इस्तेमाल करता. प्रोटोकॉल भी संवर्धन obli के लिए आवश्यक तकनीक का वर्णनइस तरह के एक परख के लिए गेट anaerobes, जीवित कोशिकाओं 2,4 दाग जो एक tetrazolium नमक, साथ संपर्क bioautography 15 और एक दृश्य विधि का उपयोग.
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Protocol
1. संयंत्र निकालें की तैयारी
- Trifolium pratense CV से phenolic यौगिकों की निकासी के लिए कगन और Flythe 10 देखें. Kenland.
- अन्य संयंत्रों में अन्य यौगिकों निकालने के लिए, (कई वर्णित हैं) संयंत्र या metabolite विशेष निकासी तरीकों के लिए phytochemical विश्लेषण साहित्य की जांच, या एक व्यापक साथ कई यौगिकों को अलग जो इस तरह के खुर्रम एट अल. 7,8 के रूप में उन प्रोटोकॉल के लिए देखो छोर की सीमा होती है.
2. पतली परत प्लेट्स की तैयारी
- दूर विकास के क्षेत्र से adsorbed contaminants ले जाने के क्रम में एक या एक से अधिक ध्रुवीय, तटस्थ विलायकों में विकसित करके स्वच्छ टीएलसी प्लेटें.
- एक धूआं हुड में, पर्याप्त सफाई विलायक तैयार (एथिल एसीटेट मेथनॉल 2:1 जैसे 15-100 मिलीग्राम, वी / वी) टीएलसी विकासशील कक्ष के नीचे, साथ ही एक टीएलसी थाली के निचले छोर सेट जब कवर करने के लिए कक्ष के अंदर.
- व्यावसायिकता का प्रयोग करेंखासकर उपलब्ध कांच टीएलसी या पन्नी से ढके Pyrex बीकर या संरक्षण जार (lids के साथ उपलब्ध विभिन्न आकारों,) कक्षों का विकास.
- एल्यूमीनियम या उपलब्ध विकासशील कक्ष फिट करने के लिए, विभिन्न आकारों (20 सेमी x 20 सेमी और छोटे) में आते हैं, जो प्लास्टिक समर्थित (लचीला) सिलिका जेल प्लेटें, कट करने के लिए कैंची का प्रयोग करें. (चेतावनी:. सिलिका साँस अगर एक धूआं हुड में काम फेफड़ों को नुकसान का कारण है, और सिलिका पर त्वचा तेल मिल रहा से बचने के लिए दस्ताने के साथ टीएलसी प्लेटें संभाल कर सकते हैं.)
- कक्ष की दीवारों के खिलाफ झुकाव सबसे ऊपर के साथ, चेंबर में प्लेटें डालें. प्लेट्स एक दूसरे को स्पर्श नहीं करना चाहिए. चैम्बर कवर और विलायक केशिका क्रिया द्वारा थाली चलते हैं.
- विलायक प्लेटों के शीर्ष पर पहुँच गया है, चैम्बर से प्लेटें हटाने और विलायक हवा हो गया है जब तक धूआं हुड के भीतर एक खड़ी स्थिति में व्यवस्था.
- दोष दिखाई तहत एक पीला बैंड की तलाश द्वारा टीएलसी थाली के शीर्ष के पास चले गए हैं, तो देखने के लिए जाँचप्रकाश, या पराबैंगनी तहत एक फ्लोरोसेंट बैंड (यूवी) प्रकाश (चित्रा 2B में "अशुद्धता सामने" या देखो अगर). थाली का बहुमत अभी भी एक पीले रंग है, तो सफाई की प्रक्रिया को दोहराएँ.
- चैम्बर से टीएलसी प्लेटें हटाने के बाद, विलायक त्यागें. अवशिष्ट विलायक प्रोटोकॉल 2 के लिए कक्ष का उपयोग करने से पहले पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें.
- एक x 20 सेमी प्लेट 20 सेमी, और x 10 सेमी प्लेटें 7 सेमी के लिए 5 मिनट के लिए सिलिका 16 पर यौगिकों के प्रवास को प्रभावित कर सकते हैं कि अवशिष्ट नमी को दूर करने के लिए, 100 डिग्री सेल्सियस पर एक सुखाने ओवन में ईमानदार प्लेटें सहारा (10-15 मिनट ).
- एक 100 डिग्री सेल्सियस सुखाने ओवन उपलब्ध नहीं है, तो कम तापमान (60 डिग्री सेल्सियस पर यानी 40 मिनट) पर समय की एक लंबी अवधि के लिए गर्मी प्लेटें.
- प्लेटें सूख रहे हैं के बाद, उन्हें लोड करने से पहले परिवेश के तापमान को शांत करते हैं.
3. निकालें पृथक्करण के लिए मंडलों विकास की तैयारी
4. टीएलसी प्लेट्स के लोड हो रहा है और विकास
- हल्के से पेंसिल के साथ मूल निशान. टीएलसी थाली पी लेनेवाला नरम और आसानी से क्षतिग्रस्त है, किनारों पर निशान बनाते हैं. यौगिकों प्लेटें टीएलसी चेंबर में डाला जाता है जब विकासशील विलायक की सतह से ऊपर होना चाहिए.
- बजाय एक पंकिल का एक केंद्रित समाधान करने के लिए पर्याप्त कार्बनिक विलायक (इस मामले में, मेथनॉल) में अर्क भंगनिलंबन.
- थाली के किनारों पर एक 1 सेमी की सीमा छोड़ने के एक microliter सिरिंज या केशिका micropipettes साथ संकीर्ण बैंड के रूप में लोड के नमूने और मानकों. बैंड (एक धूआं हुड में थाली को हवा देने या इसे लोड करने में मदद करता है) सूखे की अनुमति दें.
- नमूना का एक बड़ा एकाग्रता सूखे बैंड पर फिर से लोड हो रहा नमूने से एक थाली, "overspot" पर की जरूरत है.
- संदंश या चिमटे से संतृप्त टीएलसी कक्ष के अंदर प्लेट (एस) की स्थापना की. यह इस प्रकार यौगिक प्रवास के मार्ग में फेरबदल, संपर्क के अंक में प्लेटों के लिए विलायक प्रदान कर सकता है क्योंकि प्लेट्स बाती स्पर्श नहीं करना चाहिए. चैम्बर कवर और प्लेटों का विकास करते हैं.
5. Bioassay के लिए प्लेट्स की तैयारी
- विलायक सामने थाली के शीर्ष तक पहुंचने से पहले टीएलसी टैंक से थाली (ओं) को हटाने, और एक पेंसिल के साथ विलायक सामने की ऊंचाई के निशान. धूआं हुड में थाली सूखी हैं.
- जीई है जो एक ही टीएलसी कक्ष में किसी भी शेष टीएलसी प्लेटों का विकासरखा अगर एक पूरे दिन के लिए nerally प्रयोग करने योग्य बंद हुआ. चैम्बर में विलायक की राशि विशेष रूप से कम हो जाती है अगर टीएलसी चैम्बर के लिए विलायक मिश्रण रीमेक.
- प्लेटें सूख रहे हैं के बाद, दृश्य या पराबैंगनी प्रकाश के तहत बैंड कल्पना, और एक पेंसिल के साथ बैंड चित्रित. दीपक 254 एनएम (छोटी लहर यूवी) और 365 एनएम (लंबी लहर यूवी) दोनों में यौगिकों का पता लगा सकता है, खासकर अगर एक पोर्टेबल यूवी दीपक के साथ एक को देखने के चैम्बर, सुविधाजनक है.
नोट: इस बिंदु पर या अगले कदम के बाद, प्लेटें पन्नी के साथ कवर, प्लास्टिक की चादर में लपेटा जा सकता है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अधिकतम भंडारण समय परिसर स्थिरता पर निर्भर करता है. सिलिका तटस्थ नहीं है, क्योंकि कुछ यौगिकों टीएलसी थाली पर जबकि नीचा हो सकता है. - प्लेटों तस्वीर या खींचना.
- ओवरहेड यूवी और / या दिखाई रोशनी से सुसज्जित एक उपलब्ध है अगर एक जेल photodocumentation प्रणाली का प्रयोग करें.
- कोई वाणिज्यिक photodocumentation प्रणाली उपलब्ध है, तो एक बॉक्स के अंदर तस्वीर प्लेटें वाई, काले कागज या कपड़े से अटेएक तिपाई पर एक कैमरा सेट और एक पोर्टेबल पराबैंगनी प्रकाश वें 17 खड़े एक अंगूठी के लिए clamped. कोई फ्लोरोसेंट सूचक है कि प्लेटों जब photographing, बैंड उपस्थिति 17 में सुधार करने के लिए कैमरे के लेंस पर एक नीले प्रकाश फिल्टर का उपयोग करें.
- , बैंड निस्र्पक में सहायता यौगिक और विलायक सामने से कूच दूरी मापने, और उत्तरार्द्ध (2A चित्रा) द्वारा पूर्व विभाजित करके प्रतिधारण कारक (आर एफ) मूल्यों की गणना करने के लिए.
6. जीवाणु संस्कृति और परख
- तैयार करें और anaerobic परिस्थितियों में मीडिया टीका लगाना. इस मामले में इस्तेमाल संस्कृति जेम्स बी रसेल, कॉर्नेल विश्वविद्यालय, इथाका, न्यूयॉर्क की संस्कृति संग्रह से प्राप्त हुई थी जो क्लोस्ट्रीडियम sticklandii तनाव एसआर था.
- Flythe और कगन 13 और HAB मीडिया का एक विवरण के लिए सामग्री सूची देखें.
- घातीय या स्थिर चरण के लिए संस्कृति के लिए आगे बढ़ें. बाँझ अवायवीय तकनीकों का प्रयोग करेंतों anaerobic सूक्ष्मजीवों के साथ काम कर रहे हैं.
- कम से कम 60 डिग्री सेल्सियस की कमी आई है अगर (w / v 0.75%) के तापमान के बाद पिघला हुआ अगर में (1% v / v) संस्कृति टीका लगाना धीरे मिलाएं और तुरंत डालना (HAB मीडिया के लिए 95% सीओ 2 -5% एच 2 वातावरण) एक anaerobic चेंबर में लाना.
- 15 मिमी x 100 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में डालो, और दृढ़ करने की अनुमति देते हैं.
- कैंची के साथ, ब्याज की बैंड (ओं) युक्त क्षेत्रों में टीएलसी थाली में कटौती. बैंड टीएलसी थाली पर मूल अभिविन्यास का ट्रैक रखने के लिए थाली समर्थन पर बैंड अंकन, अगर प्लेटों पर नीचे का सामना करना पड़ा रहा. एक नियंत्रण के रूप में एक अगर प्लेट पर एक अप्रयुक्त टीएलसी पट्टी निर्धारित करना.
- अगर प्लेटों, नीचे अगर पक्ष, अवायवीय कक्ष में (24 घंटा, 39 डिग्री सेल्सियस) सेते हैं.
7. Bioassayed अगर प्लेटों के दृश्य
- वे अवायवीय कक्ष में हैं जबकि संदंश के साथ, अगर प्लेटों से बैंड को हटा दें.
- 1% जोड़ें (w / v) तेपानी में तैयार trazolium लाल,, अगर प्लेटों की सतहों पर dropwise. नियंत्रण थाली अवायवीय कक्ष से हटाने से पहले पूरी तरह से लाल हो जाता है जब तक रंग में कम से कम 20 मिनट के लिए विकसित करने, या करने की अनुमति दें. anaerobic बैक्टीरिया तुरंत अवायवीय कक्ष से हटाने के बाद व्यवहार्यता खोने के लिए शुरू हो जाएगा, लेकिन रंग और अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए स्थिर है.
- दृश्य प्रकाश के तहत तस्वीर.
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Representative Results
लाल तिपतिया घास (Trifolium pratense CV. Kenland) के अर्क, phenolic यौगिकों से युक्त के प्रतिनिधि सिलिका टीएलसी विभाजन चित्रा 2 में दिखाया गया. एथिल एसीटेट हेक्सेन में लाल तिपतिया घास निकालने का पृथक्करण (09:01, वी / वी), 8.5 सेमी, पांच बैंड, अधूरे मूल से सुलझाया एक (2A चित्रा) में हुई. हालांकि, चित्रा 2B लाल तिपतिया घास निकालने (एक ही किस्म से, लेकिन एक ही खेत में एक अलग साजिश में उगाई) की एक अलग नमूना एक बड़ी दूरी पर अलग किया (15 सेमी के बजाय गया था जब के बारे में दो बार के रूप में कई बैंड पता चला रहे थे दर्शाता है कि 8.5 सेमी) और विभिन्न विलायक प्रणालियों में लगातार दो घटनाओं के साथ. चित्रा 2B के वर्णलेख (09:01, वी / वी), और फिर सूखे की अनुमति दी और एथिल एसीटेट मेथनॉल में अलग एथिल एसीटेट हेक्सेन में पहले विकसित किया गया था (78:22, वी / वी). ये परिणाम दिखाना है कि विलायक प्रणाली (या विलायक है की श्रृंखला की थाली आकार और चुनाव दोनोंystems) एक वर्णलेख पर अलग यौगिकों की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं. इस विशेष मामले में, क्षालन और उसी के अर्क के अन्य टीएलसी विभाजन से बैंड के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) मूल में या निकट शेष यौगिकों मुख्यतः ध्रुवीय moieties संयुग्मित phenolic यौगिकों (phenolic एसिड या isoflavones) शामिल थे पुष्टि की है कि एमिनो एसिड डेरिवेटिव, शक्कर, या मेलिक एसिड के रूप में इस तरह के. इसके विपरीत, ध्रुवीय moieties संयुग्मित नहीं isoflavones आगे टीएलसी प्लेटें 10 ऊपर चले गए.
क्लोस्ट्रीडियम sticklandii, एक ruminal हाइपर अमोनिया उत्पादन जीवाणु (HAB), के साथ चित्रा 2A में दिखाया टीएलसी थाली का एक bioassay का परिणाम चित्रा 3 में दिखाया गया. जीवित कोशिकाओं दाग रहे थे जब (w / v) एक 24 घंटा ऊष्मायन के बाद अगर प्लेटों को tetrazolium लाल के जलीय घोल एक चमकदार लाल रंग में हुई एक 1% जोड़ने. बैंड 1 की ऊष्मायन (ए biochanin) और बीए का हिस्साएन डी 2 बैक्टीरिया वरीयता प्राप्त अगर पर (formononetin) निषेध की एक अच्छी तरह से परिभाषित क्षेत्र (चित्रा 3) में हुई. हालांकि, बैंड 3 और 4 के साथ बैंड 2 के शेष के ऊष्मायन, बैक्टीरियल वृद्धि (3B चित्रा) को बाधित नहीं किया. इन परिणामों biochanin एक सी. के लिए निरोधात्मक था कि प्रदर्शन किया sticklandii वृद्धि, लेकिन formononetin नहीं था.
Trifolium pratense CV के निकालने की चित्रा 2. सिलिका पतली परत chromatographic (टीएलसी) विभाजन. एक ही विलायक (78:22, वी / वी). दूरी से माइग्रेट एथिल एसीटेट मेथनॉल में विकास के बाद कि (क) एथिल एसीटेट hexanes (09:01, वी / वी), या (बी) में विकसित Kenland, मूल (या) और विलायक फ्रंट (एस एफ) के बीच विलायक निकट संकेत दिया हैउन दो सीमाओं के बीच कोष्ठक. चित्रा 2B, "अशुद्धता सामने" में (यदि दोष का स्थान ध्रुवीय विलायकों में prewashing से थाली तक ले जाया गया) थाली के शीर्ष के निकट एक अंधेरे बैंड के रूप में देखा जाता है. 180-250 मिलीग्राम फ्रीज सूखे लाल तिपतिया घास पत्तियों से तैयार है और उपजी अर्क, मेथनॉल में भंग कर रहे थे, और निकालने (ए) या 32% (बी) के 10% सिलिका प्लेटों पर लोड किया गया था. भरी हुई मानकों को एक (बीए, 7.4 nmol) biochanin, (च, 7.1 nmol) formononetin गया, genistein (G, 9.8 nmol), और clovamide (सी.एल., चित्रा 2B केवल 8.7 nmol). 254 एनएम (छोटी लहर यूवी) और 365 एनएम (लंबी लहर यूवी) पर एक हाथ से आयोजित यूवी दीपक के नीचे देखा, जबकि बैंड परिक्रमा कर रहे थे. एक डिजिटल कैमरा छोटी लहर यूवी के तहत थाली तस्वीर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. चित्रा 2A में तिपतिया घास निकालने बैंड क्षेत्रों का उल्लेख करने के अधिकार के लिए संख्या bioassays के लिए काट दिया. रिटेंशन कारकों (आर एफ, दूरी traveleएस एफ से कूच बैंड / दूरी) द्वारा डी चित्रा 2A में बैंड संख्या के बाद कोष्ठकों में हैं.
चित्रा 3. (ए) बैंड 1 और चित्रा 2A, और (बी) बैंड एक ही टीएलसी थाली से 2-4 से टीएलसी थाली से 2 बैंड के अधूरे संकल्प लिया ऊपरी भाग की टीएलसी थाली bioassays परिणाम. बैंड नीचे चेहरा रखी थी HAB मध्यम क्लोस्ट्रीडियम sticklandii साथ inoculated और 39 डिग्री सेल्सियस पर anaerobically 24 घंटा incubated पर इस ऊष्मायन अवधि के अंत में, बैंड हटा दिया गया है, और अगर प्लेट 1% की एक जलीय घोल (w / v) tetrazolium लाल और दृश्य प्रकाश के नीचे फोटो के साथ दाग रहे थे.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल यौगिकों के सबसेट में एक उद्धरण को अलग करने और संपर्क bioautography द्वारा उन कैंपेन्स परख करने की क्रिया के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है. विधि सूजाक बैक्टीरिया पैदा करने के लिए निरोधात्मक संयंत्र मेटाबोलाइट्स के लिए स्क्रीन Chomnawang एट अल. 15 से इस्तेमाल किया एक के समान है. रोगाणुरोधी संयंत्र यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए नियोजित bioautography के प्रकार के परीक्षण सूक्ष्मजीव, प्रयोगशाला की स्थापना, और bioassay प्रदर्शन व्यक्ति (ओं) की प्राथमिकताओं सहित कई कारकों पर निर्भर करता है. संपर्क bioautography, इस अध्ययन में इस्तेमाल विधि, टीका मीडिया 12 में फैलाना करने के लिए एक यौगिक की क्षमता पर निर्भर करता है के लिए आलोचना की गई है. विकास diffusate नीचे अगर में आती है, तो कम मात्रा में यौगिकों से अधिक निषेध, या मीडिया में फैलाना छोटे क्षमता के साथ के क्षेत्रों, पता लगाने योग्य नहीं हो सकता है. इसके अलावा, एक बैंड द्वारा बनाई गई निषेध के एक क्षेत्र को बैंड की प्रारंभिक बाहर फैल सकता हैसीमाओं, इस प्रकार संभवतः पड़ोसी यौगिकों 14 के द्वारा बनाई गई निरोधात्मक क्षेत्रों मास्किंग. हालांकि, संपर्क bioautography उपयोग करने के लिए एक आसान तरीका है, और पेट्री प्लेटें ढेर करने की क्षमता की जरूरत स्थान की मात्रा को कम करता है. इसके अलावा, अगर पर टीएलसी बैंड बिछाने बैंड विघटन और एक टीएलसी थाली टीका अगर साथ मढ़ा या परीक्षण सूक्ष्मजीव साथ छिड़काव किया जाता है जब कि हो सकता है के प्रसार के खतरे को समाप्त.
Bioautography के उपरोक्त प्रकार से किसी से जानकारी प्राप्त करने के chromatographic शर्तों, परीक्षण सूक्ष्मजीव एकाग्रता, और संस्कृति / ऊष्मायन शर्तों पर निर्भर करता है. रोगाणुरोधी बैंड की chromatographic संकल्प अपरिहार्य नहीं है, लेकिन संवेदनशीलता एक अच्छी तरह से सुलझाया बैंड 6 अधिक हो सकता है. बैंड 90 डिग्री विकास से पहले एक टीएलसी प्लेट बदल कर एक आयाम (चित्रा 2B) में, या दो आयामों में अब प्लेटों पर या एकाधिक विलायक प्रणालियों में विकास के द्वारा अलग किया जा सकता हैएक दूसरे विलायक 16,19 में. ध्रुवीय यौगिकों एसिड या अड्डों होते हैं कि विलायक मिश्रण का उपयोग किए बिना सिलिका पर अलग करने के लिए मुश्किल हो सकता है. एसिड की थोड़ी मात्रा का उपयोग 14,15 सूचित किया गया है हालांकि ये परीक्षण सूक्ष्मजीव 12 के लिए घातक हो सकता है. वैकल्पिक विलायक सिस्टम घटकों 20,21 के रूप में पानी या मेथनॉल शामिल हो सकते हैं. ध्रुवीय यौगिकों भी ऐसे 18 सी पी लेनेवाला या माइक्रोक्रिस्टलाइन सेलुलोज के साथ लेपित प्लेटों के रूप में टीएलसी प्लेटें, के विभिन्न प्रकारों पर हल किया जा सकता है. हालांकि, वृद्धि 12 या दृश्य एजेंट से 14 संवेदनशीलता नकारात्मक इन Adsorbents में से कुछ पर प्रभावित हो सकती है.
परीक्षण सूक्ष्मजीव और मीडिया के कई विभिन्न संयोजन bioautography के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सूक्ष्मजीव और मीडिया का चयन करते हैं, तथापि, कई कारकों पर विचार किया जाना चाहिए. मीडिया TET कम है कि कोई घटक हैं कि निर्धारित करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिएनमक razolium और एक nonbiological रंग परिवर्तन का कारण. अगर यह भी दाग कोशिकाओं और निषेध के बेदाग क्षेत्रों के बीच विपरीत प्रदान करने के लिए रंग में पर्याप्त प्रकाश होना चाहिए. केवल अगर की सतह पर विकसित कर सकते हैं कि एक सूक्ष्मजीव टीएलसी बैंड के साथ ही हटा या धुंधला दौरान बंद धोया जा सकता है. साथ ही, गैस उत्पादन कम करता है कि सूक्ष्मजीव / मध्यम संयोजन का चयन अगर में बुलबुले कम हो जाएगा. रूमेण HAB विकास सब्सट्रेट के रूप में अमीनो एसिड या पेप्टाइड्स के एक मिश्रण के साथ एक कार्बोनेट बफर, कार्बोहाइड्रेट मुक्त माध्यम में हो जाना. अगर प्लेट प्रकाश सोने और पारदर्शी हैं. जब सी. sticklandii मध्यम में उगाया जाता है, उत्पादों की सबसे अधिक (अस्थिर फैटी एसिड, अमोनिया) घुलनशील हैं. बहुत कम गैस कोई बुलबुले के साथ एक चिकनी अगर थाली में जो परिणाम का उत्पादन किया है.
इस bioassay संभावित अनुप्रयोगों की एक जोड़ी है. निषेध क्षेत्र के आकार का एक मोटा अनुमान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैनिरोधात्मक परिसर की राशि, निरोधात्मक क्षेत्र की त्रिज्या के बाद से निषेध 17,22 के कारण परिसर की राशि का लघुगणक के लिए आनुपातिक है. शायद टीएलसी थाली bioassays का सबसे आम उपयोग एक संयंत्र निकालने में संभव रोगाणुरोधी यौगिकों की सीमा को कम करना है. निरोधात्मक जोनों एक bioassay द्वारा की पहचान करने के बाद, एक नकली टीएलसी थाली पर इसी क्षेत्रों मेथनॉल या एथिल एसीटेट के रूप में, एक विलायक के साथ eluted, और bioactive यौगिकों 10,14 निस्र्पक शुरू करने के लिए पराबैंगनी स्पेक्ट्रोस्कोपी का पता लगाने के साथ HPLC द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
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Disclosures
लेख में व्यापार के नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख विशेष जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य से है और यूएसडीए ने सिफारिश या बेचान संकेत नहीं करता है. लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित की घोषणा.
Acknowledgments
हम हमें इस अध्ययन के लिए अपने लाल तिपतिया घास भूखंडों से नमूने का उपयोग करने की अनुमति के लिए, स्वर्गीय डॉ. नॉर्म टेलर, विभाग प्लांट और केंटकी के विश्वविद्यालय में मृदा विज्ञान धन्यवाद. इस परियोजना के कृषि संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
