Summary
Fremgangsmåter er beskrevet for tynn-sjikt kromatografi (TLC) separering av planteekstrakter og kontakt bioautography for å identifisere anti-bakterielle metabolitter. Metodene brukes på screening av rød kløver fenoliske forbindelser som hemmer hyper ammoniakk-produserende bakterier (HAB) innfødt til storfe vomma.
Abstract
En felles skjerm for plante antimikrobielle forbindelser består av separering av plante-ekstrakter med papir-eller tynnsjikt-kromatografi (PC eller TLC), utsette kromatogrammene til mikrobielle suspensjoner (for eksempel sopp eller bakterier i buljong eller agar), slik at tiden for mikrobene til å vokse i et fuktig miljø, og visualisere soner uten mikrobiell vekst. Effektiviteten av denne screening-metoden, kjent som bioautography, avhenger både av kvaliteten av kromatografisk separasjon og av nøyaktigheten med mikrobiell kultur forhold. Dette notatet beskriver standardprotokoller for TLC og kontakt bioautography med en roman søknad til aminosyre-fermen bakterier. Ekstraktet separeres på fleksible (aluminium-støttet) silica TLC-plater og bånd blir visualisert under ultrafiolett (UV) lys. Sonene er skåret ut og inkubert med forsiden ned på agar podet med forsøksmikroorganisme. Hemmende band er visualisert ved farging på agarplates med tetrazolium rødt. Metoden brukes til separasjon av rødkløver (Trifolium pratense cv. Kenland) fenoliske forbindelser og deres screening for aktivitet mot Clostridium sticklandii, en hyper ammoniakk-produserende bakterie (HAB) som er innfødt til storfe vomma. TLC fremgangsmåter gjelder for mange typer av plante-ekstrakter og andre bakteriearter (aerobe eller anaerobe), så vel som sopp, kan anvendes som testorganismer dersom dyrkningsbetingelser er modifisert for å passe til de vekstbetingelser av arten.
Introduction
Analysering med hensyn antimikrobielle forbindelser i planter trenger å skille komponentene av et planteekstrakt, utsette et testmikroorganisme til disse komponentene, og å bestemme om mikroorganismene er veksten hemmes av en hvilken som helst av forbindelsene. Separasjoner av papir eller tynn-sjiktskromatografi (PC eller TLC) er fordelaktig fordi mange forbindelser kan separeres på en plan overflate. Separasjon er basert på polaritet, med enkelte forbindelser binding tett til adsorpsjonsmidlet (cellulose i tilfelle av PC, og en rekke av adsorbenter i tilfelle av TLC) og migrering mindre enn andre en. Figur 1 gir et eksempel på de relative posisjonene polare og ikke-polare fenoliske forbindelser etter separasjon på en silika-TLC-plate.
Figur 1. Diagram som illustrerer fordelinger av forbindelser med forskjellige polariteter etter separasjon på en silika-tynnsjikt kromatografi (TLC)-plate. Fenoliske forbindelser av rødkløver (Trifolium pratense L.) brukes som eksempel. Polare forbindelser, for eksempel clovamide, har en sterk affinitet for et polart adsorpsjonsmiddel som silika, og forblir i nærheten av origo (OR), mens mindre polare forbindelser, slik som de tre isoflavoner nær løsningsmiddelfronten (SF), partisjon lettere i løsningsmidlene (som er mindre polar enn silica med mindre vann, syrer eller baser er inkludert) og vandrer lenger opp tallerkenen.
Etter separasjon av en ekstrakt på en TLC-plate, kan test mikroorganismer utsatt for alle forbindelser på platen, og dermed påskynde identifikasjon av de aktive komponentene av en ekstrakt 2.. Hvis en sopp-eller bakteriekultur blir utsatt for kromatogrammet, oppstår mikrobiell vekst overalt unntatt over områder med vekst-inhibitory forbindelser. Soner av inhibering deretter kan visualiseres ved å observere kontrasten mellom mycelial vekst og vekstfrie områder hvis sopper har blitt anvendt 3, eller ved sprøyting med forbindelser som endrer farge når det reduseres eller hydrolyseres ved hjelp av levende celler 4.. Selv om bruken av papir eller tynnsjiktskromatogrammer for antimikrobielle analyser først ble brukt på antibiotika 5 og soppmidler 3,6, er planteekstrakter nå ofte skjermet for antimikrobielle forbindelser med denne metoden, ofte referert til som bioautography. De protokoller som her er beskrevet gjelder bioautography av tynnsjiktskromatogrammer. TLC er mye brukt fordi den er relativt rask og kan utføres på forskjellige adsorbenter (f.eks silika, stivelse, alumina), i tillegg til å gi god oppløsning og sensitivitet 1..
Planteekstrakter kan være forberedt på TLC på mange måter. Vanlige metoder inkluderer utdrager plantemateriale i alcohol-vann-blandinger som for eksempel 80% etanol 7,8, eventuelt med tilsetning av syre eller base 9. Etter en ekstraksjon i slike løsningsmidler, som inneholder litt vann, og er eventuelt sur eller basisk, må ekstrakter konsentreres, slik at de kan brukes på TLC-plater i et minimalt volum. Konsentrasjonen av alkohol-vann-ekstrakter kan oppnås ved oppdeling av med vann blandbare organiske oppløsningsmidler 8 eller med en blanding av slike oppløsningsmidler, slik som etyl-acetat-etyleter (01:01, v / v) 10,11. Forskjellige plante metabolitter blir ekstrahert inn i forskjellige organiske løsningsmidler, avhengig av deres polaritet. For å sikre at plante organiske syrer eller baser er ekstrahert i organiske oppløsningsmidler på dette stadiet, kan pH i en alkohol-vann-ekstrakt heves eller senkes med en vann-oppløselig syre eller base for å konvertere dissosiert analytter i sine nondissociated former, som deretter løselig i nøytrale organiske løsemidler ni. Den organiske fase kan deretter einndampet under redusert trykk og under nitrogen og ble justert til ønsket volum for TLC. PH i ekstraktet er lite sannsynlig å være dødelig for bioassay mikroorganismer på grunn av oppdeling av analytter i nøytrale oppløsningsmidler, små sluttvolum, og fordampning av ekstraktet på TLC-platen før separasjon.
Både sopp og bakterier er ansatt som testmikroorganismer i bioautography av planteekstrakter to. Sporer av noen sopper, slik som Cladosporium cucumerinum, spire på TLC-plater (bortsett fra områder med inhiberende forbindelser) hvis sprøytet på plater i en næringsoppløsning, og inkubert i et fuktig miljø i flere dager 3. Den mørke mycelium av C. cucumerinum på noninhibitory soner gir en skarp kontrast til soner uten mycelial vekst. Selv om bakterier er blitt anvendt på tynnsjiktskromatografi (TLC) plater på samme måte 4,12, blir bakterier også helles over TLCplate overflater i agar overlegg 13,14. Gjær, slik som Candida albicans, kan anvendes i agar overlegg så vel 14. Alternativt kan TLC-plater legges med forsiden ned på agar inokulert med bakterier 10,15 eller gjær 8, en metode som kalles kontakt bioautography to.
Vi beskriver en metode for kontakt bioautography å screene for antimikrobielle fenoliske forbindelser fra rødkløver (Trifolium pratense cv. Kenland). Testen mikroorganisme er Clostridium sticklandii, en ruminalt hyper ammoniakk-produserende bakterie (HAB) og forplikte anaerobt. Selv om de separasjoner som brukes ikke løser alle komponentene i ekstrakten, er de lette å identifisere soner med antimikrobiell aktivitet, og dermed begrense utvalget av mulige antimikrobielle forbindelser. Protokollen benytter standardprosedyrer for TLC en. Protokollen beskriver også noen av de teknikker som kreves for dyrking forplikgate anaerober for en slik assay, en bruk av kontakt bioautography 15 og en visualisering metode med et tetrazoliumsalt, som flekker levende celler 2,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Plant Extract
- Se Kagan og Flythe 10 for utvinning av fenoliske forbindelser fra Trifolium pratense cv. Kenland.
- For å trekke ut andre forbindelser i andre planter, kontrollerer phytochemical analyse litteraturen for plante-eller metabolitter spesifikk ekstraksjonsmetoder (mange er beskrevet), eller se etter protokoller som for eksempel de av Khurram et al. 7,8 som isolerer mange forbindelser med et bredt spekter av polene.
2. Utarbeidelse av Thin-lags plater
- Rene TLC-plater ved å utvikle i ett eller flere polare, nøytrale oppløsningsmidler, for å kunne bevege seg adsorberte forurensninger bort fra den sone av utviklingen.
- I et avtrekksskap, forbereder tilstrekkelig renseløsningsmiddel (for eksempel 15 til 100 ml etylacetat-metanol 2:1, volum / volum) for å dekke bunnen av TLC fremkallingskammeret, så vel som den nedre kant av en TLC plate når sett inne i kammeret.
- Bruk kommersieltvanlig glass TLC utvikle kamre (forskjellige størrelser er tilgjengelige, med lokk) eller foliekledd Pyrex begre eller hermetiseringsglass.
- Bruk saks til å kutte aluminium-eller plastbakside (fleksible) silikagelplater, som kommer i ulike størrelser (20 cm x 20 cm og mindre), for å passe den tilgjengelige utvikle kammeret. (Advarsel: silika kan forårsake lungeskade ved innånding Arbeid i et avtrekksskap, og håndtere TLC-plater med hansker for å unngå å få hudfett på silika..)
- Før platene inn i kammeret, med topper lent mot kammerveggene. Plater skal ikke berøre hverandre. Dekk til kammeret og la oppløsningsmidlet beveger seg opp platen ved kapillærvirkning.
- Når løsningsmiddel har nådd toppen av platene, fjernes platene fra kammeret og arrangere i en stående posisjon i avtrekksskap inntil oppløsningsmidlet er fordampet.
- Sjekk om urenheter har migrert nær toppen av TLC-platen ved å se etter en gul bandet henhold synliglys, eller et fluorescent bånd under ultrafiolett (UV) lys (se "urenhet front" eller IF i figur 2B). Dersom flertallet av platen har fortsatt en gulaktig skjær, gjenta rengjøringsprosessen.
- Etter fjernelse av TLC-plater fra kammeret, forkaste løsningsmidlet. Tillat rest løsemiddel fordampe helt før du bruker kammeret for protokoll 2.
- For å fjerne gjenværende fuktighet som kan påvirke migreringen av forbindelser på silika 16, prop platene oppreist i en tørkeovn ved 100 ° C (10 til 15 min for en 20 cm x 20 cm plate, og 5 min til 7 cm x 10 cm plater ).
- Ved en 100 ° C tørkeovn ikke er tilgjengelig, varmeplater for et lengre tidsrom ved lavere temperaturer (dvs. 40 min ved 60 ° C).
- Etter at platene er tørre, la dem avkjøles til omgivelsestemperatur før lasting.
Tre. Utarbeidelse av Utvikling Chambers for Extract Separation
4. Lasting og Utvikling av TLC-plate
- Forsiktige merker opprinnelsen med blyant. Ved TLC-platen adsorbent er mykt og kan lett skades, må merker på kantene. Forbindelser bør være over overflaten av det fremkallende løsningsmiddel når platene er satt inn i TLC kammeret.
- Oppløs-ekstrakter i tilstrekkelig organisk oppløsningsmiddel (i dette tilfellet, metanol) til å ha en konsentrert oppløsning i stedet for en turbidsuspensjon.
- Belastningsprøver og standarder som smale bånd med en mikroliter sprøyte-eller kapillær mikropipetter, og etterlater en 1 cm kant på sidene av platen. Tillate band å tørke (Fanning plate eller legger det i et avtrekksskap hjelper).
- Hvis en større konsentrasjon av prøven er nødvendig på en plate, "overspot" etter at prøver igjen på de tørkede band.
- Med tang eller tang, sett plate (e) inne i mettet TLC kammeret. Platene bør ikke berøre veken, da dette kan gi løsningsmiddel til platene ved kontaktpunktene, og dermed å endre banen av forbindelse migrasjon. Dekk kammer og la platene utvikle.
5. Utarbeidelse av plater for bioassay
- Fjern platen (e) fra TLC tanken før løsningsmiddelfronten når frem til toppen av platen, og markere høyden av løsningsmiddelfronten med en blyant. La platen tørke i avtrekksskap.
- Develop eventuelle gjenværende TLC-plater i samme TLC-kammer, som er generally brukbare for en hel dag hvis holdes lukket. Remake oppløsningsmiddelblanding for TLC kammer hvis mengden av oppløsningsmidlet i kammeret reduseres særlig.
- Etter platene er tørre, visualisere band henhold synlig eller UV-lys, og avgrense band med en blyant. En visning kammer med en bærbar UV-lampe er praktisk, spesielt hvis lampen kan oppdage forbindelser både 254 nm (kortbølget UV) og 365 nm (langbølget UV).
Note: På dette tidspunkt eller etter det neste trinnet, kan platene være innpakket i plastfolie, dekket med folie og lagret ved -20 ° C. Maksimal lagringstid er avhengig av sammensatte stabilitet. Fordi silika ikke er nøytral, kan enkelte forbindelser nedbrytes når de er på TLC-plate. - Fotografere eller tegne plater.
- Bruk en gel photodocumentation system hvis man er utstyrt med overhead UV og / eller synlig lys er tilgjengelig.
- Hvis ingen kommersiell photodocumentation system er tilgjengelig, fotografi plater inne i en eske foret med mørk papir eller klut, with et kamera satt på et stativ og en bærbar UV lys klemt til en ring stå 17. Når fotografere plater som ikke har noen fluorescerende indikator, bruke et blått lys filter over kameralinsen for å forbedre bandet utseende 17.
- Til hjelp i karakter band, beregne oppbevaring faktor (Rf) verdier ved å måle avstander reist med sammensatte og væske foran, og dele det tidligere av sistnevnte (Figur 2A).
6. Bakteriell Kultur og analysen
- Utarbeide og vaksinere media under anaerobe forhold. Kulturen anvendes i dette tilfellet var Clostridium sticklandii belastning SR, som ble erholdt fra kultursamlingen James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
- Se Flythe og Kagan 13 og listen materialer for en beskrivelse av HAB media.
- Grow kulturen til eksponentiell eller stasjonær fase. Bruk sterile anaerob techniques når du arbeider med anaerobe mikroorganismer.
- Inokuler kulturen (1% v / v) i smeltet agar etter at temperaturen på agar (0,75% vekt / volum) er redusert til mindre enn 60 ° C. Bland forsiktig og umiddelbart få inn en anaerob kammer (95% CO 2 -5% H 2 atmosfæren for HAB media) å helle.
- Hell i 15 mm x 100 mm plast petriskåler, og la det stivne.
- Med saks, kutt TLC-plate i soner inneholdende bånd (r) av interesse. Lay band med ansiktet ned på agar plater, merking band på plate backing å holde styr på originalretning på TLC plate. Lå en ubrukt TLC strimmel på en agarplate som en kontroll.
- Inkuber agarplater, agar side ned, i det anaerobe kammer (24 t, 39 ° C).
7. Visualisering av Bioassayed Agar Plates
- Med pinsett, fjerner band fra agar plater mens de er i den anaerobe kammeret.
- Tilsett 1% (w / v) tetrazolium rødt, fremstilt i vann, dråpevis på overflaten av agar-platene. Tillat farge å utvikle seg i minst 20 minutter, eller inntil styreplaten blir helt rødt, før fjerning fra den anaerobe kammeret. Den anaerobe bakterier vil begynne å gå ned i levedyktighet umiddelbart etter fjerning fra det anaerobe kammer, men fargen er stabil i mer enn 24 timer.
- Foto ligger under synlig lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative silica TLC separasjoner av rødkløver (Trifolium pratense cv. Kenland) ekstrakter, inneholder fenoliske forbindelser, er vist i figur 2. Separasjon av rødkløver ekstrakt i etylacetat-heksan (9:1, v / v), mer enn 8,5 cm, resulterte i fem bånd, en ufullstendig løst fra origo (figur 2A). Imidlertid, viser figur 2B at omtrent to ganger så mange bånd ble avslørt når en annen prøve av rødkløver ekstrakt (fra samme sorten, men dyrkes i en separat plotting på samme gård) ble fraskilt over en større avstand (15 cm i stedet for 8.5 cm) og med to påfølgende utvikling i forskjellige løsningsmiddelsystemer. Kromatogrammet i fig 2B ble utviklet først i etylacetat-heksan (9:1, v / v), og deretter tillatt å tørke og separert i etylacetat-metanol (78:22, v / v). Disse resultater viser at både platestørrelse og valg av oppløsningsmiddel-systemet (eller en serie av løsemiddel systems) kan påvirke antallet av forbindelser separeres på et kromatogram. I dette spesielle tilfellet, eluering og høy-ytelse væskekromatografi (HPLC) av båndene fra andre TLC separasjoner av de samme ekstraktene bekreftet at forbindelsene rester ved eller nær origo besto hovedsakelig av fenoliske forbindelser (fenoliske syrer eller isoflavoner) konjugert til polare rester slik som amino-syrederivater, sukker eller eplesyre. I kontrast til isoflavoner ikke konjugert til polare rester migrerte lenger opp på TLC-plater 10.
Resultatene av en bioassay av TLC-platen vist i figur 2A med Clostridium sticklandii, en ruminale hyper ammoniakk-produserende bakterie (HAB), er vist i figur 3.. Legge til en 1% (w / v) vandig løsning av tetrazolium rødt til agar plater etter en 24 timers inkubering resulterte i en rød farge når levende celler ble farget. Inkubasjon av bandet 1 (biochanin A) og en del av band 2 (formononetin) på bakterier-seeded agar resulterte i en veldefinert sone av hemming (figur 3A). Imidlertid, inkubasjon av den resterende del av båndet 2, sammen med båndene 3 og 4, ikke inhiberer bakteriell vekst (figur 3B). Disse resultatene demonstrerte at biochanin A var hemmende overfor C. sticklandii vekst, men formononetin var ikke.
Figur 2. Silica tynnsjikt kromatografi (TLC) separasjoner av ekstrakt av Trifolium pratense cv. Kenland, utviklet i (A) etylacetat-heksaner (9:01, v / v), eller (b) det samme oppløsningsmiddel etterfulgt av utvikling i etylacetat-metanol (78:22, v / v). Avstanden migreres ved oppløsningsmidlet mellom origo (OR), og løsningsmiddelfronten (SF) er indikert vedbraketter mellom disse to grensene. I figur 2B, vil "urenhet front" (IF, plassering av urenhetene beveges opp platen ved forvask i polare løsningsmidler) er sett på som et mørkt bånd nær toppen av platen. Ekstrakter, fremstilt 180-250 mg fryse-tørket rødkløver blader og stengler, ble oppløst i metanol, og 10% av ekstrakt (A) eller 32% (B) ble påsatt på silikaplater. Standarder ble lastet formononetin (f, 7,1 nmol), biochanin A (ba, 7,4 nmol), genistein (g, 9,8 nmol) og clovamide (Cl, figur 2B bare, 8,7 nmol). Bånd ble sirklet mens sees under et håndholdte UV-lampe ved 254 nm (kortbølget UV) og 365 nm (langbølget UV). Et digitalt kamera ble brukt til å fotografere plate under kortbølget UV. Tallene til høyre for kløver ekstrakt band i figur 2A refererer til sonene kutte ut for bioassay. Retention faktorer (R f, avstand traveled etter band / distanse ved SF) står i parentes etter bandet tallene i figur 2A.
Figur 3. Resultater av TLC-platen bioassay av (A) båndet 1, og ufullstendig løst øvre del av båndet 2 fra TLC-platen på fig 2A, og (B) båndene 2-4 fra det samme TLC-plate. Bånd ble lagt med ansiktet ned på HAB medium inokulert med Clostridium sticklandii og inkuberes anaerobt 24 timer ved 39 ° C. På slutten av denne inkuberingsperioden ble bandene fjernet, og de agarplater ble farget med en vandig løsning av 1% (w / v) tetrazolium rødt og fotografert i henhold synlig lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en enkel metode for separering av en ekstrakt til undergrupper av forbindelser, og analysering av disse undergrupper av kontakt bioautography. Fremgangsmåten er ganske lik den som brukes av Chomnawang et al. 15. for å screene for plante metabolitter hemmende til gonoré-bakterier. Den type bioautography ansatt til skjermen for antimikrobielle plantesammensetninger avhenger av mange faktorer, blant annet testmikroorganisme, laboratorieoppsett, og preferansene til den personen (e) som utfører bioassay. Kontakt bioautography, metoden brukt i denne studien, er blitt kritisert for avhengig av muligheten for en forbindelse til diffus i inokulerte media 12. Soner med inhibering enn forbindelsene ved lave konsentrasjoner, eller med liten evne til å diffundere inn i mediet, ikke kan påvises dersom veksten foregår i agaren under diffusate. Dessuten kan en sone av inhibering laget av ett bånd spres utover bandets innledendegrenser, og dermed muligens maske hemmende soner opprettet av nabo forbindelser 14. Imidlertid er kontakt bioautography en enkel metode for å bruke, og muligheten til å stable petriplater minimaliserer mengden av plass som trengs. I tillegg legging TLC bånd på agar eliminerer risikoen for bandet oppløsning og spredning som kan oppstå når en TLC-plate er belagt med inokulerte agar eller sprøytet med forsøksmikroorganisme.
Innhenting av informasjon fra noen av de ovennevnte typer bioautography avhenger kromatografiske betingelser, test mikroorganisme konsentrasjon, og kultur / inkuberingsforhold. Kromatografisk oppløsning av antimikrobielle band er ikke uunnværlig, men følsomheten kan være større for et godt løst bandet seks. Band kan separeres ved utvikling på lengre plater eller flere oppløsningsmiddelsystemer i en dimensjon (figur 2B), eller i to dimensjoner ved å dreie en TLC-plate 90 grader før utviklingi en andre løsemiddel 16,19. Polare forbindelser kan være vanskelig å separere uten å på kiselgel ved bruk av løsningsmiddelblandinger som inneholder syrer eller baser. Disse kan være dødelig for testmikroorganisme 12, selv om bruken av små mengder av syrer er blitt rapportert 14,15. Alternative løsningsmiddelsystemer kan inneholde vann eller metanol som komponentene 20,21. Polare forbindelser kan også løses på ulike typer av TLC-plater, slik som plater belagt med C 18 adsorbent eller mikrokrystallinsk cellulose. Imidlertid kan vekst 12 eller følsomhet for visualisering middel 14 bli negativt påvirket på noen av disse adsorbenter.
Mange forskjellige kombinasjoner av testmikroorganismen og mediet kan benyttes til bioautography. Men, må flere faktorer tas i betraktning ved valg av mikroorganismen og media. Mediene bør testes for å fastslå at det ikke er noen komponenter som reduserer tetrazolium salt og forårsake en nonbiological fargeendring. Den agar bør også være lett nok i farge for å gi kontrast mellom de fargede celler og ufargede soner av hemming. En mikroorganisme som bare kan vokse på overflaten av agaren kan fjernes sammen med TLC band eller vaskes av under farging. I tillegg vil valget av mikroorganismen / medium kombinasjon som minimaliserer gassproduksjon redusere bobler i agaren. Rumen HAB vokse i en karbonat-bufret, karbohydratfritt medium med en blanding av aminosyrer eller peptider som vekstsubstrat. Agarplatene er lys gull og gjennomsiktig. Når C. sticklandii er dyrket i mediet, de fleste av produktene er oppløselige (flyktige fettsyrer, ammoniakk). Meget lite gass produseres, noe som resulterer i en jevn agarplate uten bobler.
Dette bioassay har et par potensielle bruksområder. Størrelsen på den sone av inhibering kan brukes som et grovt estimat avmengden av den hemmende forbindelsen, siden radiusen til den hemmende sonen er proporsjonal med logaritmen av den mengde av forbindelsen som forårsaker inhibering 17,22. Kanskje den mest vanlige bruken av TLC-platen bioassay er å begrense omfanget av mulige antimikrobielle forbindelser i en planteekstrakt. Etter inhibitoriske soner identifiseres ved hjelp av en bioanalyse, kan de tilsvarende regionene på et duplikat TLC plate elueres med et oppløsningsmiddel, slik som metanol eller etylacetat, og analysert ved hjelp av HPLC med UV-spektroskopi deteksjon til å begynne karakteriserer bioaktive forbindelser 10,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Omtale av varemerker eller kommersielle produkter i artikkelen er utelukkende for det formål å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke en anbefaling eller godkjenning av USDA. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Vi takker den avdøde Dr. Norm Taylor, Dept. Plant og Soil Science ved University of Kentucky, for å tillate oss å bruke samples fra hans røde kløver tomter for denne studien. Dette prosjektet ble finansiert av United States Department of Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
