Summary
שיטות מתוארות להפרדת chromatographic בשכבה דקה (TLC) של תמציות צמחים וbioautography קשר לזהות מטבוליטים אנטי בקטריאליים. השיטות מיושמות להקרנה של תרכובות פנוליות תלתן אדומים עיכוב חיידקים מייצרי אמוניה היפר (HAB) יליד המסס השור.
Abstract
מסך משותף לתרכובות מיקרוביאלית צמח מורכב של הפרדת תמציות צמחים על ידי נייר או כרומטוגרפיה בשכבה דקה (PC או TLC), חושפת את chromatograms להשעיות של חיידקים (למשל פטריות או חיידקים במרק או אגר), ומאפשרים זמן לחיידקים לגדול ב סביבה לחה, באופן חזותי אזורים ללא התפתחותם של חיידקים. היעילות של שיטת הקרנה זו, הידועה בשם bioautography, תלויה הן באיכות של הפרדת chromatographic והטיפול נלקח בתנאי תרבות של חיידקים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים עבור TLC וbioautography מגע עם יישום חדשני לאמין חיידקי תסיסת חומצה. התמצית מופרדת על צלחות TLC סיליקה (מגובות אלומיניום) גמישות, ולהקות הם דמיינו תחת אור אולטרה סגול (UV). אזורים הם לגזור וטופחו על פנים על אגר מחוסן עם מיקרואורגניזם הבדיקה. להקות מעכבות הם דמיינו ידי מכתימים את הצלחת אגרים עם tetrazolium אדום. השיטה מיושמת להפרדה של תלתן אדום (Trifolium pratense קורות חיים. Kenland) תרכובות פנוליות וההקרנה שלהם לפעילות נגד sticklandii Clostridium, חיידק היפר לייצור אמוניה (HAB) כי הוא יליד המסס השור. שיטות TLC תחולנה על סוגים רבים של תמציות צמחים ומיני חיידקים אחרים (אירוביים או אנאירובי), כמו גם פטריות, ניתן להשתמש בם כיצורי מבחן אם תנאי התרבות שונו כדי שיתאימו לדרישות הצמיחה של המינים.
Introduction
מנסה לאמוד עבור תרכובות מיקרוביאלית בצמחים דורש הפרדת המרכיבים של תמצית צמח, חושף מיקרואורגניזם בדיקה לרכיבים אלה, וקביעה אם הצמיחה של מיקרואורגניזם הוא מעוכב על ידי כל אחת מהתרכובות. הפרדות על ידי נייר או כרומטוגרפיה בשכבה דקה (PC או TLC) הן נוחים, כי תרכובות רבות יכולות להיות מופרדות על משטח מישורי. הפרדה מבוססת על קוטביות, עם כמה תרכובות מחייבות בחוזקה לבעלי כושר ספיגה (תאית במקרה של מחשב, ועוד מגוון של חומרי ספיחה במקרה של TLC) ונודדות פחות מאחרים 1. איור 1 מספק דוגמא למיקומים היחסי של תרכובות פנוליות קוטב ופולרי לאחר הפרדה על צלחת TLC סיליקה.
איור 1. דיאגרמה המדגימה הפצות של תרכובות של קטבים שונים לאחר הפרדה על chromatographic דק שכבה סיליקה צלחת (TLC). תרכובות פנול של תלתן אדום (Trifolium pratense L.) משמשות כדוגמא. תרכובות קוטביות, כגון clovamide, יש זיקה חזקה עבור בעלי כושר ספיגה קוטביים כמו סיליקה ולהישאר קרובים למקור (OR), ואילו תרכובות קוטביות פחות, כגון שלושה איזופלבונים קרובים לחזית הממס (SF), מחיצה יותר בקלות לממסים (שהם פחות קוטביים מסיליקה, אלא אם כן מים, חומצות, בסיסים או כלולים) ולהעביר הלאה את הצלחת.
לאחר ההפרדה של תמצית על צלחת TLC, יכולים להיחשף מיקרואורגניזמים מבחן לכל התרכובות על הצלחת, ובכך להאיץ את זיהוי של הרכיבים הפעילים של תמצית 2. אם תרבות פטרייתי או חיידקים חשופה להכרומתוגרמה, התפתחותם של חיידקים תתרחש בכל מקום פרט מעל אזורים עם צמיחת מעכביםתרכובות y. אזורים של עיכוב לאחר מכן ניתן לראות על ידי הניגוד בין צמיחת mycelial והאזורים ללא צמיחת פטריות אם כבר הוחלו 3 או על ידי ריסוס עם חומרים שמשנים את צבעם כאשר מופחת או הידרוליזה על ידי תאי חיים 4. למרות שימוש chromatograms נייר או בשכבה דקה למבחנים מיקרוביאלית יושם לראשונה לאנטיביוטיקה 5 וקוטלי פטריות 3,6, תמציות צמחים נמצאות כעת בתדירות גבוהה לגילוי תרכובות מיקרוביאלית בשיטה זו, המכונים לעתים קרובות bioautography. הפרוטוקולים שתוארו לעיל חלים על bioautography של chromatograms בשכבה דקה. TLC נעשה שימוש נרחב בגלל זה הוא מהיר יחסית ויכול להתבצע על חומרי ספיחה שונות (לדוגמא: סיליקה, עמילן, אלומינה), כמו גם לספק רזולוציה טובה ורגישות 1.
ניתן להכין תמציות צמחים לTLC בדרכים רבות. שיטות נפוצות כוללות חומר צמחי חילוץ בALCתערובות ohol מים כגון 80% אתנול 7,8, אולי עם התוספת של חומצה או בסיס 9. בעקבות מיצוי בממסים כאלה, המכילים מעט מים והם אולי חומצי או בסיסיים, תמציות חייבת להיות מרוכזות, כך שהם יכולים להיות מיושמים על צלחות TLC בנפח מינימאלי. הריכוז של תמציות אלכוהול מים יכול להיות מושגת על ידי החלוקה עם ממסים אורגניים במים immiscible 8 או בתערובת של ממסים כאלו, כגון אתר אתיל אצטט, אתיל (1:1, V / V) 10,11. מטבוליטים שונים של צמחים המחולצים לממסים אורגניים שונים, בהתאם לקוטביות שלהם. כדי להבטיח כי חומצות אורגניות צמח או בסיסים המחולצים לממסים אורגניים, בשלב זה, ה-pH של תמצית אלכוהול מים יכול להיות עלה או מונמכת עם חומצה מסיס במים או בסיס להמיר analytes ניתק לצורות nondissociated, אשר לאחר מכן מסיס בממסים אורגניים ניטראליים 9. לאחר מכן השלב האורגני יכול להיות דוארvaporated תחת לחץ מופחת או תחת חנקן ומותאם להיקף הרצוי עבור TLC. ה-pH של התמצית לא סביר שיהיה קטלני למיקרואורגניזמים מבדק בשל המחיצות של analytes לממסים ניטראליים, נפח סופי קטן, ואידוי של התמצית על צלחת TLC לפני ההפרדה.
פטריות וחיידקים שניהם מועסקים כמיקרואורגניזמים מבחן בbioautography של תמציות צמחים 2. נבגים של פטריות מסוימות, כגון cucumerinum Cladosporium, לנבוט על צלחות TLC (מלבד אזורים עם תרכובות מעכבות) אם ריססו על צלחות בפתרון תזונתי וטופחו בסביבה לחה במשך כמה ימים 3. התפטיר האפל של ג cucumerinum באזורי noninhibitory מספק ניגוד חריף לאזורים ללא צמיחה mycelial. למרות שחיידקים יושמו לכרומטוגרפיה בשכבה דקה צלחות (TLC) באותו אופן 4,12, חיידקים הם גם שפכו על TLCמשטחי צלחת אגרה שכבות 13,14. שמרים, כמו קנדידה אלביקנס, יכולים להיות מיושמים בשכבות אגר כמו גם 14. לחלופין, ניתן להציב צלחות TLC עם פנים כלפי מטה על גבי אגר מחוסן עם חיידקים או שמרי 10,15 8, בשיטה המכונה קשר bioautography 2.
אנו מתארים שיטה לbioautography מגע מסך עבור תרכובות פנוליות מיקרוביאלית מתלתן אדום (Trifolium pratense קורות חיים. Kenland). מיקרואורגניזם המבחן הוא sticklandii Clostridium, חיידק כרס היפר לייצור אמוניה (HAB) ולחייב anaerobe. למרות הפרדות שימוש אינן פותרות את כל הרכיבים של התמצית, הם להקל על זיהוי של אזורים של פעילות מיקרוביאלית, ובכך מצמצם את הבריכה של תרכובות מיקרוביאלית אפשריות. הפרוטוקול מנצל נהלים סטנדרטיים ל1 TLC. הפרוטוקול מתאר גם כמה הטכניקות הנדרשות לobli culturingאנאירוביים שער עבור assay כגון, שימוש בקשר bioautography 15 ושיטת הדמיה עם מלח tetrazolium, אשר כתמי תאי חיים 2,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תמצית צמח
- ראה קגן וFlythe 10 להפקת תרכובות פנוליות מקורות חי pratense Trifolium. Kenland.
- כדי לחלץ תרכובות אחרות בצמחים אחרים, בדוק את ספרות ניתוח Phytochemical לשיטות מיצוי צמחים או המטבוליט ספציפי (רבים מתוארות), או לחפש פרוטוקולים כגון אלה של חוראם et al. 7,8 שבודד תרכובות רבות עם רחב מגוון רחב של קטבים.
2. הכנת לוחות דק שכבה
- צלחות TLC נקיות על ידי פיתוח בממסים קוטביים, ניטראליים אחד או יותר, על מנת להתרחק מהאזור של פיתוח המזהמים adsorbed.
- במנדף קטר, להכין מספיק ממס ניקוי (למשל 15-100 מיליליטר של 2:1 יצטט מתנול אתיל, V / V) כדי לכסות את החלק התחתון של חדר פיתוח TLC, כמו גם את הקצה התחתון של צלחת TLC כאשר סט בתוך החדר.
- השתמש commerזכוכית זמינה cially TLC פיתוח תאים (בגדלים שונים זמינים, עם מכסים) או כוסות פיירקס מכוסה בנייר כסף או צנצנות שימור.
- השתמש במספריים כדי לחתוך אלומיניום או צלחות בציפוי פלסטיק (גמישות) סיליקה ג'ל, המגיעים בגדלים שונים (סנטימטר וקטן יותר 20 x 20 סנטימטר), כדי שיתאימו לתא פיתוח זמין. (זהירות: סיליקה יכולה לגרום נזק לריאות אם בשאיפה לעבוד במנדף, ולהתמודד עם צלחות TLC עם כפפות כדי להימנע מקבלת שמני עור על גבי סיליקה..)
- הכנס את הצלחות לתוך התא, עם צמרות נשענו על קירות החדר. צלחות לא צריכים לגעת זה בזה. כסה את החדר ולתת לי הממס להזיז את הצלחת על ידי פעולת נימים.
- כאשר הממס הגיע לחלק העליון של הצלחות, להסיר צלחות מהחדר ולסדר בעמידה בתוך מנדף עד הממס התאדה.
- בדקו אם זיהומים היגרו בחלק העליון של צלחת TLC ידי מחפש להקה צהובה מתחת לעיןאור אור, או להקת ניאון מתחת לאולטרה סגול (UV) (ראה "מול הטומאה", או אם באיור 2 ב). אם הרוב של הצלחת עדיין יש גוון צהבהב, חזור על תהליך הניקוי.
- לאחר הסרת צלחות TLC מהאולם, לבטל את הממס. לאפשר ממס שיורי להתאדות לחלוטין לפני השימוש בחדר לפרוטוקול 2.
- כדי להסיר את הלחות שיורית שיכול להשפיע על הגירה של תרכובות על סיליקה 16, לתמוך הצלחות זקופות בתנור ייבוש ב100 ° C (10-15 דקות ל20 סנטימטר x 20 צלחת סנטימטר, ו -5 דקות ל7 ס"מ X 10 צלחות סנטימטר ).
- אם תנור ייבוש 100 ° C אינו זמין, צלחות חום לתקופה ארוכה יותר של זמן בטמפרטורות נמוכות יותר (כלומר 40 דקות על 60 מעלות צלזיוס).
- לאחר הצלחות יבשות, תן להם להתקרר לטמפרטורת סביבה לפני הטעינה.
3. הכנת פיתוח צ'יימברס להפרדת חלץ
4. טעינה ופיתוח של צלחות TLC
- קל לסמן את מוצאם עם עיפרון. אם בעלי כושר ספיגה צלחת TLC הוא רך ובקלות פגומה, להפוך את הסימנים בקצוות. תרכובות צריכה להיות מעל פני השטח של ממס הפיתוח כאשר צלחות מוכנסות לתוך תא TLC.
- ממיסים תמציות במספיק ממס אורגני (במקרה זה, מתנול) יש פתרון מרוכז במקום עכורהשעיה.
- דגימות עומס וסטנדרטים כמו להקות צרות עם מזרק microliter או micropipettes נימים, משאירים גבול 1 סנטימטר בצדדים של הצלחת. לאפשר ללהקות לייבוש (מלבה את הצלחת או טוען אותו במנדף עוזר).
- אם ריכוז גדול יותר של מדגם יש צורך בצלחת, "overspot" על ידי דגימות טעינה שוב בלהקות מיובשות.
- עם מלקחיים או מלקחיים, הניח את הצלחת (ים) בתוך חדר TLC הרווי. צלחות לא צריכים לגעת בפתיל כי זה עשוי לספק ממס לצלחות בנקודות מגע, ובכך לשנות את נתיב הגירת מתחם. כסה קאמרי ולתת צלחות להתפתח.
5. הכנת צלחות למבדק
- הסר את הצלחת (ים) מיכל TLC לפני מול הממס מגיע העליון של הצלחת, ולסמן את הגובה של חזית הממס בעיפרון. בואו יבש צלחת במנדף.
- לפתח כל צלחות TLC שנותרו באותו התא TLC, שזה generally שמיש עבור כל יום אם כל הזמן סגור. מהדורה מחודשת תערובת ממס עבור חדר TLC אם כמות הממס בתא יורדת בעיקר.
- לאחר הצלחות יבשות, לדמיין להקות תחת אור הנראה או UV, ולהתוות להקות בעיפרון. תא צפייה עם מנורת UV ניידת הוא נוח, במיוחד אם את המנורה יכולה לזהות תרכובות בשני 254 ננומטר (UV בגלים קצרים) ו365 ננומטר (UV גל ארוך).
הערה: בשלב זה או לאחר השלב הבא, יכולות להיות עטופים צלחות בניילון נצמד, מכוסות בנייר כסף, ומאוחסנות ב -20 ° C. זמן אחסון מרבי תלוי ביציבות תרכובת. בגלל סיליקה אינה ניטראלית, כמה תרכובות עלולות לבזות ואילו על צלחת TLC. - לצלם או לצייר צלחות.
- השתמש במערכת photodocumentation ג'ל אם אחד מצויד בUV תקורה ו / או אורות גלויים הוא זמין.
- אם אין מערכת photodocumentation מסחרית זמינה, צלחות צילום בתוך קופסא מרופדת בנייר או בד כהה, wiה להגדיר את המצלמה על חצובה ואור UV נייד מהודק לטבעת לעמוד 17. כאשר מצלמים צלחות שאין להן חיווי ניאון, השתמש במסנן אור כחול על עדשת המצלמה כדי לשפר את המראה של להקת 17.
- כדי לסייע באפיון להקות, לחשב גורם שימור (ו R) ערכים על ידי מדידת מרחקים נסעו במתחם וחזית ממס, וחלוקה לשעבר על ידי (איור 2 א) האחרון.
6. חיידקי תרבות וAssay
- להכין ולחסן תקשורת בתנאים אנאירוביים. התרבות משמשת במקרה זה הייתה SR Clostridium sticklandii המתח, אשר התקבל מאוסף התרבות של ג'יימס ב 'ראסל, אוניברסיטת קורנל, איתקה, ניו יורק.
- ראה Flythe ו13 קגן ורשימת החומרים לתיאור תקשורת HAB.
- לגדול התרבות לשלב מעריכי או נייח. השתמש techniqu אנאירובי סטריליes כאשר עובד עם מיקרואורגניזמים אנאירובי.
- לחסן התרבות (1% V / V) לתוך אגר מותך לאחר הטמפרטורה של אגר (0.75% w / v) ירד ל פחות מ 60 ° C. מערבבים בעדינות ולהביא מייד לחדר אנאירובי (95% H CO 2 -5% 2 אווירה לתקשורת HAB) לשפוך.
- יוצקים לתוך 15 מ"מ x 100 צלחות פטרי פלסטיק מ"מ, ומאפשר לחזק.
- עם מספריים, לחתוך את צלחת TLC לאזורים המכילים להקה (ים) של עניין. הנח להקות עם הפנים כלפי מטה על גבי צלחות אגר, לציון להקות בגיבוי הצלחת כדי לעקוב אחר כיוון המקורי על צלחת TLC. הנח רצועת TLC שאינו בשימוש על גבי צלחת אגר כביקורת.
- דגירה צלחות אגר, אגר צד למטה, בתא אנאירובי (שעה 24, 39 מעלות צלזיוס).
7. ויזואליזציה של צלחות Bioassayed אגר
- עם מלקחיים, להסיר להקות מצלחות אגר בזמן שהם בתא אנאירובי.
- להוסיף 1% (w / v) teאדום trazolium, שהוכן במים, dropwise על גבי המשטחים של הצלחות אגר. לאפשר את הצבע לפתח לפחות 20 דקות, או עד שצלחת השליטה הופכת לאדומה לגמרי, לפני הסרת מתא אנאירובי. החיידקים אנאירוביים יתחילו לאבד את יכולת הקיום מייד לאחר ההסרה מתא אנאירובי, אבל הצבע הוא יציב יותר מ24 שעות.
- לצלם מתחת לאור הנראה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרדות TLC סיליקה נציג של תלתן אדום תמציות (CV pratense Trifolium. Kenland), המכילים תרכובות פנוליות, מוצגות באיור 2. הפרדה של תמצית תלתן אדומה ביצטטו-הקסאן אתיל (9:01, v / v), מעל 8.5 סנטימטר, הביא חמש להקות, (איור 2 א) אחד חלקי נפתר מהמקור. עם זאת, איור 2 מראה כי להקות על כפליים נחשפו כאשר מדגם של תמצית תלתן אדומה (מאותו הזן, אבל גדלו בחלקה נפרדת באותו המשק) שונה הופרד על פני מרחק גדול יותר (15 סנטימטר במקום 8.5 סנטימטר) ועם שתי התפתחויות רצופות במערכות ממסים שונות. הכרומתוגרמה של תרשים 2B פותחה לראשונה ביצטט-הקסאן אתיל (09:01, V / V), ולאחר מכן להתייבש והפרידו ביצטטו אתיל מתנול (78:22, V / V). תוצאות אלו מראות כי גם בגודל צלחת ובחירה של מערכת ממס (או סדרה של ממסystems) יכול להשפיע על מספר התרכובות המופרדים בהכרומתוגרמה. במקרה הספציפי הזה, elution וכרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלית (HPLC) של להקות מהפרדות TLC אחרות מאותו תמציות אישרו כי התרכובות שנותרו בבית או ליד המקור כללו בעיקר של תרכובות פנוליות (חומצות פנוליות או איזופלבונים) מצומדת לmoieties קוטב כגון נגזרות חומצת אמינו, סוכרים, או חומצת מאלית. לעומת זאת, איזופלבונים לא מצומדת לmoieties הקוטבי נדדו במעלה צלחות TLC 10.
תוצאות מבדק של צלחת TLC שמוצגת באיור 2 א עם sticklandii Clostridium, חיידק כרס היפר לייצור אמוניה (HAB), מוצגות באיור 3. הוספת 1% (w / v) תמיסה מימית של אדום tetrazolium לצלחות אגר לאחר דגירה 24 שעות הביאה צבע אדום בהיר כאשר תאי חיים היו מוכתמים. דגירה של להקת 1 (biochanin) וחלק מהתואר ראשוןnd 2 (formononetin) על אגר חיידקים נזרעו הביא לאזור מוגדר היטב של עיכוב (איור 3 א). עם זאת, דגירה של שאר להקה 2, יחד עם להקות 3 ו -4, לא לעכב את צמיחת חיידקים (איור 3 ב). תוצאות אלו הראו כי biochanin הייתה מעכב לג צמיחת sticklandii, אבל formononetin לא היה.
הפרדות איור 2. chromatographic דק השכבה סיליקה (TLC) של תמצית של קורות חיים pratense Trifolium. Kenland, שפותח ב (א) יצטט hexanes אתיל (09:01, V / V), או (ב) באותו ממס ואחריו פיתוח ביצטט אתיל מתנול (78:22, V / V). היגר המרחק על ידי הממס בין המקור (OR) ומול ממס (SF) מצויינים לידסוגריים בין שני גבולות אלה. באיור 2 ב, "מול הטומאה" (IF, מיקום של הזיהומים עבר את הצלחת על ידי prewashing בממסים קוטביים) נתפסת כלהקה כהה בחלק העליון של הצלחת. תמציות, שהוכנו 180-250 עלים תלתן אדום המיובש בהקפאה מ"ג וגבעולים, היו מומסים במתנול, ו10% מתמצית () או 32% (B) הועמסו על גבי צלחות סיליקה. תקנים הטעונים היו formononetin (ו, 7.1 nmol), biochanin (ba, 7.4 nmol), גניסטאין (ז, 9.8 nmol), וclovamide (Cl, 2B איור בלבד, 8.7 nmol). להקות הקיפו בעוד שנצפו תחת מנורת UV כף יד ב254 ננומטר (UV בגלים קצרים) ו365 ננומטר (UV גל ארוך). מצלמה דיגיטלית הייתה בשימוש כדי לצלם את הצלחת תחת UV בגלים קצרים. המספרים בצד הימין של להקות תמצית התלתן באיור 2 א מתייחסים לאזורים בנויים למבדקים. גורמי שימור (ו R, travele מרחקד על ידי להקה / מרחק שעובר SF) הם בסוגריים אחרי מספרי להקה באיור 2 א.
איור 3. תוצאות של מבדקי צלחת TLC של () להקה 1 ואת החלק העליון באופן חלקי נפתר של להקה 2 מצלחת TLC של איור 2 א, ולהקות (ב ') 2-4 מאותה הצלחת TLC. להקות הונחו עם פנים כלפי מטה על מדיום HAB מחוסן עם sticklandii Clostridium וטופחו אנאירובי 24 שעות ב39 ° C. בסוף תקופת דגירה זה, הלהקות הוסרו, והצלחות אגר היו מוכתמות בתמיסה מימית של 1% (w / v) tetrazolium אדום וצילם באור הנראה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה להפרדת תמצית לתוך תת קבוצות של תרכובות ומנסים לאמוד תת אלה על ידי bioautography ליצירת קשר. השיטה די דומה לזו ששמשה את Chomnawang et al. 15 למסך למטבוליטים צמח מעכבים לחיידקי גורמי זיבה. הסוג של bioautography המועסק מסך לתרכובות צמחים מיקרוביאלית תלוי בגורמים רבים, כולל בקטריה הבדיקה, התקנת המעבדה, ואת ההעדפות של האדם (ים) ביצוע המבדק. bioautography לתקשר, השיטה המשמשת במחקר זה, זכה לביקורת על תלוי ביכולת של מתחם כדי לפזר לתקשורת מחוסנת 12. אזורים של עיכוב על תרכובות בריכוזים נמוכים, או עם יכולת קטנה לנטרל לתוך תקשורת, לא יכולים להיות לגילוי אם צמיחה מתרחשת באגרה מתחת diffusate. כמו כן, אזור של עיכוב שנוצר על ידי להקה אחת עלול להתפשט מעבר ראשוני של הלהקהגבולות, ובכך אולי מיסוך אזורים מעכבים נוצרו על ידי תרכובות השכנות 14. עם זאת, bioautography המגע הוא שיטה קלה לשימוש, ואת היכולת לערום צלחות פטרי ממזערת את כמות השטח הדרושה. כמו כן, הנחת להקות TLC על אגר מבטלת את הסיכון של פירוק להקה והפצה שיכול להתרחש כאשר צלחת TLC היא ועליהן אגר מחוסן או רוססה בקטריה במבחן.
קבלת מידע מכל אחד מהסוגים לעיל של bioautography תלוי בתנאי chromatographic, ריכוז מיקרואורגניזם הבדיקה, ותנאי התרבות / דגירה. רזולוציה כרומטוגרפי של להקות מיקרוביאלית היא לא הכרחית, אבל רגישות עשויה להיות גדולה יותר עבור להקה נפתרה היטב 6. ניתן להפריד להקות ידי פיתוח על צלחות ארוכות יותר או במערכות ממס מרובות בממד אחד (איור 2), או בשני ממדים על ידי הפיכת צלחת TLC 90 מעלות לפני הפיתוחב16,19 ממס שני. תרכובות קוטביות עלולות להיות קשות להפריד על סיליקה ללא שימוש בתערובות ממיסים המכילות חומצות או בסיסים. אלה עשויים להיות קטלניים למיקרואורגניזם המבחן 12, למרות שהשימוש בכמויות קטנות של חומצות דווח 14,15. מערכות ממיסים אלטרנטיביים עשויות לכלול מים או מתנול כרכיבי 20,21. יכולות גם להיפתר תרכובות פולאר על סוגים שונים של צלחות TLC, כגון צלחות מצופים C 18 בעלי כושר ספיגה או תאית מייקרו. עם זאת, צמיחת 12 או רגישות לסוכן ההדמיה מאי 14 להיות מושפעת לרעה על חלק מחומרי הספיחה אלה.
שילובים שונים של מיקרואורגניזם מבחן ותקשורת יכולים לשמש לbioautography. עם זאת, מספר גורמים יש לקחת בחשבון בעת בחירת מיקרואורגניזם ותקשורת. התקשורת צריכה להיבדק כדי לקבוע שאין רכיבים המצמצמים את טrazolium מלח ולגרום לשינוי צבע לא ביולוגי. אגר צריך להיות גם מספיק אור בצבע כדי לספק ניגוד בין התאים המוכתמים ואזורים בלא כתם של עיכוב. מיקרואורגניזם שיכול לגדול רק על פני השטח של אגר ניתן להסיר יחד עם להקת TLC או לרחוץ אותו בזמן הצביעה. בנוסף, הבחירה של שילוב מיקרואורגניזם / בינוני שממזערת הפקת גז תפחית בועות באגר. יגדל הכרס הפנימי HAB ב, בינוני נטולות פחמימות שנאגרו פחמה בתערובת של חומצות אמינו או פפטידים כמצע גידול. הצלחות אגר הן זהב ושקוף לאור. כאשר ג sticklandii הוא גדל בטווח הבינוני, רוב המוצרים הם מסיסים (חומצות שומן נדיפות, אמוניה). גז מעט מאוד מיוצר, שתוצאתה צלחת אגר חלקה ללא בועות.
יש מבדק זה כמה יישומים פוטנציאליים. גודלו של האזור של עיכוב יכול לשמש כאומדן גס שלהסכום של המתחם המעכב, שכן את הרדיוס של האזור המעכב הוא יחסי ללוגריתם של הסכום של המתחם גורם לעיכוב 17,22. אולי השימוש הנפוץ ביותר של bioassays צלחת TLC הוא לצמצם את מגוון של תרכובות מיקרוביאלית אפשריות בתמצית צמח. לאחר אזורים מעכבים מזוהים במבדק, האזורים המתאימים בצלחת TLC כפולה ניתן eluted עם ממס, כגון מתנול או אתיל אצטט, ונותחו על ידי HPLC עם זיהוי ספקטרוסקופיה סגול כדי להתחיל אפיון תרכובות ביו 10,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות. המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר הנור טיילור המנוח, מח' צמח ומדעי קרקע באוניברסיטת קנטאקי, על שאפשרת לנו להשתמש בדגימות מחלקות התלתן האדומות שלו למחקר זה. פרויקט זה מומן על ידי ארצות הברית מחלקת החקלאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
