Summary
Des méthodes sont décrites pour chromatographie sur couche mince (CCM) la séparation d'extraits de plantes et le contact bioautographie pour identifier les métabolites antibactériens. Les méthodes sont appliquées à la sélection de composés phénoliques de trèfle rouge inhibant les bactéries hyper-production d'ammoniac (HAB) originaires de la panse de bovin.
Abstract
Un écran commun pour les composés antimicrobiens de plantes consiste en la séparation d'extraits de plantes en papier ou en chromatographie sur couche mince (PC ou TLC), ce qui expose les chromatogrammes de suspensions microbiennes (par exemple, de champignons ou de bactéries dans un bouillon ou la gélose), laissant du temps pour les microbes de se développer en un environnement humide, et la visualisation des zones de pas de croissance microbienne. L'efficacité de cette méthode de dépistage, connu sous le nom bioautographie, dépend à la fois de la qualité de la séparation chromatographique et le soin apporté aux conditions de cultures microbiennes. Ce document décrit les protocoles standards pour la CCM et le contact bioautographie avec une nouvelle application aux acides des bactéries d'acide de fermentation. L'extrait est séparé sur flexibles (support aluminium) des plaques de CCM de silice, et les bandes sont visualisées sous lumière ultraviolette (UV). Les zones sont découpées et incubées visage vers le bas sur de la gélose inoculé avec le micro-organisme d'essai. Bandes inhibitrices sont visualisés par coloration de la plaque de géloses avec tétrazolium rouge. Le procédé est appliqué à la séparation de trèfle rouge (Trifolium pratense cv. Kenland) des composés phénoliques et leur criblage pour l'activité contre Clostridium sticklandii, une bactérie produisant de l'ammoniac hyper (HAB) qui est natif de la panse de bovin. Les procédés de CCM s'appliquent à de nombreux types d'extraits de plantes et d'autres espèces bactériennes (aérobie ou anaérobie), ainsi que les champignons, peuvent être utilisés comme organismes d'essai, si les conditions de culture sont modifiées pour être compatibles avec les exigences de l'espèce de croissance.
Introduction
Le dosage de composés antimicrobiens dans des plantes nécessite la séparation des constituants d'un extrait de plante, l'exposition d'un micro-organisme d'essai à ces composants, et pour déterminer si la croissance du micro-organisme est inhibée par l'un quelconque des composés. Séparations par papier ou chromatographie sur couche mince (CCM ou PC) sont pratiques car de nombreux composés peuvent être séparés sur une surface plane. La séparation est basée sur la polarité, avec des composés de liaison étanche à l'adsorbant (cellulose dans le cas de PC, et une variété d'adsorbants dans le cas de la Chromatographie sur couche mince) et la migration de moins que les autres une. Figure 1 donne un exemple de la position relative des des composés phénoliques polaires et non polaires après la séparation sur une plaque de TLC de silice.
Figure 1. Diagramme illustrant la répartition des composés de polarités différentes après la séparation sur une couche mince de silice chromatographique (CCM) plaque. Composés phénoliques de trèfle rouge (Trifolium pratense L.) sont utilisés comme un exemple. Des composés polaires tels que le clovamide, ont une forte affinité pour un adsorbant polaire comme le silice et restent près de l'origine (OR), alors que moins de composés polaires, tels que les trois isoflavones près du front de solvant (SF), partition plus facilement dans les solvants (qui sont moins polaires que la silice à moins que l'eau, des acides ou des bases sont incluses) et de migrer plus haut sur la plaque.
Après séparation de l'extrait sur une plaque de CCM, les micro-organismes d'essai peuvent être exposés à tous les composés de la plaque, en accélérant ainsi l'identification des composants actifs de l'extrait 2. Si une culture fongique ou bactérienne est exposé au chromatogramme, la croissance microbienne se produit partout sauf sur les zones où la croissance inhibiteurcomposés y. Zones d'inhibition peuvent ensuite être visualisées en observant le contraste entre la croissance du mycélium et les zones de libre-croissance si les champignons ont été appliquées 3 ou par pulvérisation avec des composés qui changent de couleur lorsqu'ils sont réduits ou hydrolysé par des cellules vivantes 4. Bien que l'utilisation de papier ou couche mince chromatogrammes pour les tests antimicrobiens a été d'abord appliquée aux antibiotiques et fongicides 5 3,6, extraits de plantes sont maintenant souvent masqués pour les composés antimicrobiens avec cette méthode, souvent appelés bioautographie. Les protocoles décrits ici s'appliquent à bioautographie de chromatogrammes en couche mince. TLC est largement utilisé parce qu'il est relativement rapide et peut être effectué sur les différents adsorbants (par exemple, la silice, l'amidon, l'alumine), ainsi que de fournir une bonne résolution et une sensibilité.
Les extraits de plantes peuvent être préparés pour TLC dans de nombreuses façons. Les méthodes courantes comprennent le matériel végétal extraction dans alcdes mélanges tels que l'éthanol à 80% 7,8, éventuellement avec l'addition d'acide ou de base 9 ohol à l'eau. Suite à une extraction dans de tels solvants, qui contiennent un peu d'eau et sont peut-être acide ou basique, les extraits doivent être concentrées de sorte qu'ils peuvent être appliqués à des plaques de CCM dans un volume minimal. La concentration des extraits d'alcool dans l'eau peut être obtenue en divisant l'aide de solvants organiques non miscibles à l'eau 8 ou avec un mélange de tels solvants, tels que l'éther éthylique-acétate d'éthyle (1:1, v / v) 10,11. Métabolites de plantes différentes sont extraits dans différents solvants organiques, en fonction de leur polarité. Pour s'assurer que les acides ou les bases organiques végétaux sont extraits dans des solvants organiques, à ce stade, le pH d'un extrait d'alcool dans l'eau peut être élevé ou abaissé avec un acide ou une base soluble dans l'eau pour convertir les analytes dissociées en leurs formes non dissociée, qui sont ensuite soluble dans les solvants organiques neutres 9. La phase organique peut alors être evaporated sous pression réduite ou sous atmosphère d'azote et on ajuste le volume souhaité pour la CCM. Le pH de l'extrait est peu susceptible d'être létale pour les micro-organismes dans les essais biologiques en raison de la séparation des analytes dans des solvants neutres, petit volume final, et l'évaporation de l'extrait sur la plaque de CCM avant la séparation.
Les champignons et les bactéries sont utilisées comme des micro-organismes d'essai dans bioautographie d'extraits de plantes 2. Les spores de certains champignons tels que Cladosporium cucumerinum, germent sur des plaques de CCM (en dehors des zones avec des composés inhibiteurs) si pulvérisée sur les plaques dans une solution nutritive et on les incube dans un environnement humide pendant plusieurs jours 3. Le mycélium foncé de C. cucumerinum sur les zones non inhibitrice offre un contraste frappant avec les zones franches de la croissance du mycélium. Bien que les bactéries ont été appliquées à une Chromatographie sur couche mince (CCM) des plaques de la même manière 4,12, les bactéries sont également versé sur TLCsurfaces de la plaque de gélose superpositions 13,14. Levure, telle que Candida albicans, peut être appliquée dans les superpositions de gélose ainsi 14. Alternativement, des plaques de CCM peuvent être placés face vers le bas sur une gélose inoculée avec des bactéries ou des levures 10,15 8, un procédé connu sous le nom de contact bioautographie 2.
Nous décrivons une méthode pour le contact bioautographie pour cribler des composés phénoliques antimicrobiens du trèfle rouge (Trifolium pratense cv. Kenland). Le micro-organisme test est Clostridium sticklandii, une bactérie du rumen hyper ammoniac-production (HAB) et obliger anaérobie. Bien que les séparations utilisées ne résolvent pas tous les composants de l'extrait, elles facilitent l'identification des zones d'activité antimicrobienne, réduisant ainsi la piscine de composés antimicrobiens possibles. Le protocole utilise des procédures standard pour la CCM 1. Le protocole décrit également certaines des techniques requises pour la culture obligationsgrille anaérobies pour un tel essai, l'utilisation d'un bio-autographie de contacts 15 et un procédé de visualisation avec un sel de tétrazolium, qui colore les cellules vivantes 2,4.
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Protocol
Une. Préparation de l'extrait de la plante
- Voir Kagan et Flythe 10 pour l'extraction des composés phénoliques de Trifolium pratense cv. Kenland.
- Pour extraire d'autres composés dans d'autres usines, consultez la documentation de l'analyse phytochimique des méthodes d'extraction de plantes ou spécifique-métabolites (beaucoup sont décrits), ou chercher des protocoles tels que ceux de Khurram et al. 7,8 qui isolent de nombreux composés d'un grand gamme de polarités.
2. Préparation de couche mince Plaques
- Nettoyer les plaques de CCM par le développement dans un ou plusieurs solvants polaires neutres, afin de déplacer les contaminants adsorbés hors de la zone de développement.
- Dans une hotte de laboratoire, préparer suffisamment de solvant de nettoyage (par exemple 15 à 100 ml d'acétate d'éthyle-méthanol 2:1, v / v) pour couvrir le fond de la chambre de développement TLC, ainsi que le bord inférieur d'une plaque de CCM lors de consigne à l'intérieur de la chambre.
- Utilisez comverre ment disponible TLC développer chambres (différentes tailles disponibles, avec des couvercles) ou béchers en pyrex recouvert de papier aluminium ou bocaux.
- Utilisez des ciseaux pour couper (flexibles) des plaques de gel de silice en plastique à des créances, qui viennent dans différentes tailles (20 cm x 20 cm et plus petits), pour s'adapter à la chambre de développement disponible en aluminium ou. (Attention: la silice peut provoquer une atteinte des poumons en cas d'inhalation Travailler dans une hotte, et manipuler des plaques de CCM avec des gants pour éviter d'avoir des huiles de la peau sur la silice..)
- Insérez les plaques dans la chambre, avec les sommets appuyé contre les parois de la chambre. Elles ne doivent pas se toucher. Couvrir la chambre et laissez le solvant déplacer la plaque par capillarité.
- Lorsque le solvant a atteint le sommet des plaques, enlever les plaques de la chambre et les disposer dans une position debout dans la hotte jusqu'à évaporation du solvant.
- Vérifiez si des impuretés ont migré vers le haut de la plaque de CCM par la recherche d'une bande jaune sous visiblelumière, ou une bande fluorescente sous rayonnement ultraviolet (UV) (voir le «front d'impureté" ou SI sur la figure 2B). Si la majorité de la plaque a encore une teinte jaunâtre, répétez le processus de nettoyage.
- Après avoir enlevé les plaques CCM de la chambre, jeter le solvant. Laisser le solvant résiduel s'évaporer complètement avant d'utiliser la chambre pour le protocole 2.
- Pour éliminer l'humidité résiduelle qui peut affecter la migration des composés de silice 16, prop les plaques en position verticale dans un four de séchage à 100 ° C (10-15 min pour un 20 cm x 20 cm plaque, et 5 min pour 7 cm x 10 cm plaques ).
- Si un séchage à l'étuve à 100 ° C n'est pas disponible, les plaques de chaleur pour une période de temps plus longue à des températures plus basses (par exemple 40 min à 60 ° C).
- Après que les plaques sont sèches, les laisser refroidir à température ambiante avant de le charger.
3. Préparation de développement Chambers pour Extrait séparation
4. Chargement en cours et le développement de Plaques CCM
- Légèrement marquer l'origine avec un crayon. Si la plaque adsorbant TLC est tendre et fragile, des notes sur les bords. Les composés doivent être au-dessus de la surface du solvant de développement lorsque les plaques sont insérées dans la chambre de TLC.
- Dissoudre les extraits dans suffisamment de solvant organique (en l'occurrence, le methanol) à une solution concentrée à la place d'un troublesuspension.
- Charger les échantillons et les normes que des bandes étroites avec une seringue microlitre ou micropipettes capillaires, laissant un 1 cm frontière sur les côtés de la plaque. Laissez les bandes sécher (attisant la plaque ou le charger dans une hotte aide).
- Si une plus grande concentration de l'échantillon est nécessaire sur une plaque, "overspot» en chargeant des échantillons de nouveau sur les bandes séchées.
- Avec des pinces ou des pinces, la plaque de fixation (s) à l'intérieur de la chambre TLC saturé. Elles ne doivent pas toucher la mèche, car il peut fournir solvant pour les plaques aux points de contact, modifiant ainsi le chemin de la migration de composé. Couvrez et laissez chambre plaques se développent.
5. Préparation des plaques pour les essais biologiques
- Retirer la plaque (s) de réservoir CCM avant le front de solvant atteigne le haut de la plaque, et marquer la hauteur du front de solvant avec un crayon. Laissez plaque sèche dans une hotte.
- Développer des plaques de CCM restant dans la même chambre TLC, qui est geralement utilisable pour une journée entière si gardé fermé. Refaire un mélange de solvants pour chromatographie sur couche mince chambre si la quantité de solvant dans la chambre diminue notablement.
- Après plaques sont sèches, visualiser les bandes à la lumière visible ou UV, et de délimiter les bandes avec un crayon. Une chambre d'observation avec une lampe UV portable est pratique, surtout si la lampe peut détecter des composés à la fois 254 nm (ondes courtes UV) et 365 nm (longueur d'onde UV).
Remarque: À ce stade ou après la prochaine étape, les plaques peuvent être enveloppés dans une pellicule de plastique, recouverts d'une feuille, et conservés à -20 ° C. Durée maximale de conservation dépend de la stabilité de composé. Parce que la silice n'est pas neutre, certains composés peuvent se dégradent tandis que sur la plaque de CCM. - Photographier ou dessiner plaques.
- Utilisez un système de gel photodocumentation si une équipée d'UV-dessus et / ou les lumières visibles est disponible.
- Si aucun système d'photodocumentation commerciale est disponible, plaques de photographie à l'intérieur d'une boîte doublés de papier noir ou tissu, wie Un jeu de caméra sur un trépied et une lumière UV portable bloqué à un support annulaire 17. Lorsque vous photographiez des plaques qui n'ont pas un indicateur fluorescent, utiliser un filtre de la lumière bleue sur la lentille de la caméra pour améliorer l'apparence de la bande 17.
- Pour aider à la caractérisation des bandes, calculer le facteur de rétention (Rf) en mesurant les valeurs de distances parcourues par le composé et le front de solvant, et en divisant la première par la seconde (Figure 2A).
6. Culture bactérienne et dosage
- Préparer et inoculer médias dans des conditions anaérobies. La culture utilisée dans ce cas était Clostridium sticklandii souche SR, qui a été obtenu à partir de la collection de cultures de James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
- Voir Flythe et Kagan 13 et la liste des matériaux pour une description des HAB médias.
- Cultiver la culture à la phase exponentielle ou stationnaire. Utilisez anaérobie techniqu stérilees lorsqu'on travaille avec des micro-organismes anaérobies.
- Inoculer la culture (1% v / v) dans de la gélose en fusion après que la température de la gélose (0,75% p / v) a diminué à moins de 60 ° C. Mélanger délicatement et mettre immédiatement dans une chambre anaérobie (95% de CO 2 -5% H 2 atmosphère HAB médias) à verser.
- Verser dans 15 mm x 100 mm en plastique des boîtes de Petri, et laisser se solidifier.
- Avec des ciseaux, couper la plaque de CCM dans les zones contenant groupe (s) d'intérêt. Lay bandes face vers le bas sur des plaques d'agar-agar, le marquage des bandes sur le support de plaque pour garder une trace de l'orientation originale sur plaque de CCM. Posez une bande TLC utilisé sur une plaque de gélose en tant que témoin.
- Incuber les boîtes de gélose, côté agar en bas, dans la chambre anaérobie (24 h, 39 ° C).
7. Visualisation de testées biologiquement plaques de gélose
- Avec une pince, enlever les bandes à partir de plaques de gélose pendant qu'ils sont dans la chambre anaérobie.
- Ajouter 1% (p / v) tetrazolium rouge, préparée dans de l'eau, goutte à goutte sur les surfaces des plaques de gélose. Laisser la coloration se développer pendant au moins 20 minutes, ou jusqu'à ce que la plaque de commande tourne complètement rouge, avant de retirer de la chambre anaérobie. Les bactéries anaérobies commencent à perdre leur viabilité immédiatement après le retrait de la chambre anaérobie, mais la couleur est stable pendant plus de 24 heures.
- Photographier à la lumière visible.
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Representative Results
Représentant séparations TLC de silice de trèfle rouge (Trifolium pratense cv. Kenland) d'extraits, contenant des composés phénoliques, sont présentés dans la figure 2. Séparation de l'extrait de trèfle rouge dans l'acétate d'éthyle-hexane (9:1, v / v), plus de 8,5 cm, a donné cinq bandes, une incomplètement résolu à partir de l'origine (figure 2A). Cependant, la figure 2B montre que près de deux fois plus de bandes ont été révélées lors d'un autre échantillon d'extrait rouge de trèfle (à partir de la même cultivar, mais grandi dans une parcelle séparée à la même ferme) a été séparé sur une plus grande distance (15 cm au lieu de 8,5 cm) et avec deux développements successifs dans des systèmes de solvants différents. Le chromatogramme de la figure 2B est devenu courant dans l'acétate d'éthyle-hexane (9:1, v / v), puis on laisse sécher et séparé en acétate d'éthyle-méthanol (78:22, v / v). Ces résultats montrent que la taille de la plaque et le choix du système de solvant (ou une série de solvants de l'artystems) peuvent affecter le nombre de composés séparés sur un chromatogramme. Dans ce cas particulier, l'élution et la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) de bandes d'autres séparations CCM des mêmes extraits ont confirmé que les composés restants à ou près de l'origine étaient composés principalement de composés phénoliques (acides phénoliques ou isoflavones) conjugués à des groupements polaires tels que des dérivés d'acides aminés, des sucres, ou de l'acide malique. En revanche, les isoflavones pas conjugués à des groupements polaires migré plus haut sur les plaques de CCM 10.
Les résultats d'un essai biologique de la plaque de CCM montre la figure 2A par la bactérie Clostridium sticklandii, d'une bactérie du rumen hyper-production de l'ammoniac (HAB), sont présentés dans la figure 3. L'ajout d'un 1% (p / v) de solution aqueuse de tétrazolium rouge sur les plaques de gélose après une incubation de 24 heures a donné lieu à une couleur rouge vif lorsque les cellules vivantes ont été colorées. L'incubation de la bande 1 (biochanine A) et une partie de ba2 nd (formononétine) sur gélose ensemencés en bactéries conduit à une zone bien définie d'inhibition (figure 3A). Cependant, l'incubation du reste de la bande 2, en même temps que les bandes 3 et 4, n'a pas inhibé la croissance bactérienne (figure 3B). Ces résultats ont démontré que la biochanine A était inhibitrice de C. croissance sticklandii, mais formononetine était pas.
Figure 2. Silice en couche mince chromatographique (CCM) des séparations d'extrait de Trifolium pratense cv. Kenland, développé dans (A) acétate d'éthyle-hexanes (9:1, v / v), ou (B) le même solvant, suivie par le développement dans l'acétate d'éthyle-méthanol (78:22, v / v). Migré La distance par le solvant entre l'origine (OR) et de front de solvant (SF) est indiqué à côté de l'crochets entre ces deux limites. Dans la figure 2B, le «front d'impureté» (SI, l'emplacement des impuretés déplacé vers le haut de la plaque par le prélavage dans des solvants polaires) est considérée comme une bande sombre près du sommet de la plaque. Les extraits, préparés 180-250 mg feuilles de trèfle rouge lyophilisés et les tiges, ont été dissous dans du methanol, et 10% d'extrait (A) ou 32% (B) ont été chargés sur des plaques de silice. Normes ont été chargés formononetine (f, 7,1 nmol), biochanine A (ba, 7,4 nmol), la génistéine (g, 9,8 nmol), et clovamide (Cl, Figure 2B seulement 8,7 nmol). Bandes ont été encerclés tout vu sous une lampe UV à main à 254 nm (ondes courtes UV) et 365 nm (longueur d'onde UV). Un appareil photo numérique a été utilisé pour photographier la plaque sous UV à ondes courtes. Les chiffres à droite des bandes d'extrait de trèfle dans la figure 2A référer aux zones découpées pour les essais biologiques. Les facteurs de rétention (Rf, travele à distanced par bande / distance parcourue par SF) sont entre parenthèses après les chiffres de la bande de la figure 2A.
Figure 3. Résultats de TLC plaques de tests biologiques (A) bande 1 et la partie supérieure incomplètement résolu de bande 2 de la plaque de CCM de la figure 2A, et (B) 2-4 bandes de la même plaque de CCM. Bandes ont été posées face cachée HAB sur un milieu inoculé avec la bactérie Clostridium sticklandii et incubée en anaérobiose 24 h à 39 ° C. A la fin de cette période d'incubation, les bandes ont été enlevées, et les plaques de gélose ont été colorées avec une solution aqueuse de 1% (p / v) de rouge de tétrazolium et photographié sous une lumière visible.
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Discussion
Ce protocole décrit un procédé simple pour la séparation d'un extrait en sous-ensembles de composés et de dosage de ces sous-ensembles contact par bioautographie. Le procédé est tout à fait similaire à celui utilisé par Chomnawang et al. 15 pour cribler des inhibiteurs de métabolites de plantes à des bactéries responsables de la gonorrhée. Le type de bioautographie employé à l'écran pour les composés de plantes antimicrobiens dépend de nombreux facteurs, y compris la micro-organisme test, la configuration de laboratoire, et les préférences de la personne (s) l'exécution de l'essai biologique. Contactez bioautographie, la méthode utilisée dans cette étude, a été critiqué pour fonction de la capacité d'un composé à diffuser dans les médias inoculés 12. Les zones d'inhibition par rapport aux composés à des concentrations faibles, ou avec peu de capacité de se diffuser dans les médias, peuvent ne pas être détectable si la croissance se produit dans la gélose en dessous du produit de diffusion. En outre, une zone d'inhibition créée par une bande peut se propager au-delà de la première de la bandelimites, ainsi éventuellement masquage des zones créées par des composés inhibiteurs voisins 14. Cependant, le contact bioautographie est une méthode facile à utiliser, et la possibilité d'empiler des boîtes de Pétri minimise la quantité d'espace nécessaire. En outre, la pose des bandes de CCM sur gélose élimine le risque de dissolution de la bande et la diffusion qui peut se produire lorsque une plaque de CCM est recouvert avec de l'agar inoculé ou pulvérisé avec le micro-organisme test.
Obtenir des informations de n'importe quel type de bioautographie ci-dessus dépend des conditions chromatographiques, la concentration de micro-organismes d'essai et les conditions de culture / incubation. Résolution chromatographique de bandes antimicrobiens n'est pas indispensable, mais la sensibilité peut être plus élevé pour un groupe bien décidé 6. Les bandes peuvent être séparées par le développement de plaques plus longues ou à plusieurs systèmes de solvants à une dimension (figure 2B), ou à deux dimensions en faisant tourner une plaque de CCM de 90 degrés avant le développementdans un second 16,19 solvant. Les composés polaires peuvent être difficiles à séparer sur de la silice en utilisant des mélanges sans solvant qui contiennent des acides ou des bases. Ceux-ci peuvent être létales pour le micro-organisme d'essai 12, bien que l'utilisation de petites quantités d'acides a été rapporté 14,15. Systèmes de solvants alternatifs peuvent inclure l'eau ou du méthanol en tant que composants 20,21. Les composés polaires peuvent également être résolus sur différents types de plaques de CCM, tels que des plaques revêtues de C 18 adsorbant ou de la cellulose microcristalline. Cependant, une croissance de 12 ou de sensibilité à l'agent de visualisation 14 peuvent être affectés négativement sur certains de ces adsorbants.
De nombreuses combinaisons différentes de micro-organismes et les médias essai peuvent être utilisés pour bioautographie. Cependant, plusieurs facteurs doivent être considérés lors de la sélection micro-organisme et des médias. Les médias devraient être testée pour déterminer qu'il n'y a pas de composants qui réduisent la tetrazolium sel et de provoquer un changement de couleur non biologique. La gélose doit aussi être assez de lumière dans la couleur de fournir un contraste entre les cellules colorées et non colorées des zones d'inhibition. Un micro-organisme qui ne peut se développer sur la surface de la gélose peut être enlevé en même temps que la bande CCM ou éliminé par lavage au cours de la coloration. En outre, la sélection des micro-organismes / milieu combinaison qui réduit au minimum la production de gaz réduira bulles dans la gélose. Rumen HAB croître dans un milieu exempt d'hydrate de carbone-carbonate tamponné avec un mélange d'acides aminés ou de peptides en tant que substrat de croissance. Les plaques d'agar sont or pâle et transparent. Lorsque C. sticklandii est cultivé dans le milieu, la plupart des produits sont solubles (acides gras volatils, d'ammoniac). Très peu de gaz est produit, ce qui conduit à une plaque de gélose lisse, sans bulles.
Ce bio-essai a un couple d'applications potentielles. La taille de la zone d'inhibition peut être utilisé comme une estimation grossière dela quantité du composé inhibiteur, depuis le rayon de la zone d'inhibition est proportionnelle au logarithme de la quantité du composé entraînant l'inhibition 17,22. Peut-être l'utilisation la plus commune de TLC essais biologiques de la plaque est de réduire la gamme de composés antimicrobiens possibles dans un extrait de plante. Après zones d'inhibition sont identifiés par un essai biologique, les régions correspondantes d'une plaque de TLC en double peuvent être élues avec un solvant, tel que le méthanol ou l'acétate d'éthyle et analysés par HPLC avec détection par spectroscopie ultraviolette pour commencer caractérisation de composés bioactifs 10,14.
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Disclosures
La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans l'article est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n'implique pas une recommandation ou une approbation par l'USDA. Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions le regretté Dr Norm Taylor, Département des plantes et de la science du sol à l'Université du Kentucky, pour nous permettre d'utiliser des échantillons de ses parcelles de trèfle rouge pour cette étude. Ce projet a été financé par le ministère de l'Agriculture des États-Unis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
