Summary
I metodi sono descritti per cromatografia su strato sottile (TLC) separazione di estratti vegetali e contattare bioautografia per identificare i metaboliti antibatterici. I metodi sono applicati alla proiezione del trifoglio composti fenolici che inibiscono iper-ammoniaca batteri che producono (HAB) native del rumine dei bovini.
Abstract
Uno schermo comune per i composti antimicrobici vegetali consiste nel separare estratti vegetali da carta o cromatografia su strato sottile (TLC o PC), esponendo i cromatogrammi di sospensioni microbiche (ad esempio funghi o batteri in brodo o agar), dando il tempo per i microbi di crescere in un ambiente umido, e la visualizzazione zone senza crescita microbica. L'efficacia di questo metodo di screening, noto come bioautografia, dipende sia dalla qualità della separazione cromatografica e la cura con condizioni di coltura microbica. Questo articolo descrive i protocolli standard per TLC e contattare bioautografia con una nuova applicazione di aminoacidi batteri dell'acido fermentazione. L'estratto viene separata su flessibili (alluminio-di appoggio) lastre TLC silice, e le bande sono visualizzati sotto luce ultravioletta (UV). Le zone sono tagliati fuori e incubate a faccia in giù su agar inoculato con il microrganismo test. Bande inibitorie sono visibili con la colorazione della piastra di agars con tetrazolio rosso. Il metodo è applicato alla separazione di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland), composti fenolici e la loro selezione per attività contro il Clostridium sticklandii, un batterio che produce ammoniaca iper (HAB), che è nativo del rumine dei bovini. I metodi TLC applicano a molti tipi di estratti vegetali e altre specie batteriche (aerobici o anaerobici), così come funghi, può essere utilizzato come organismi di prova se le condizioni della coltura vengono modificate per adattarsi alle esigenze di crescita della specie.
Introduction
Saggio di composti antimicrobici nelle piante richiede separare i componenti di un estratto vegetale, esponendo un microrganismo di prova per tali componenti, e determinare se la crescita del microrganismo è inibita da qualsiasi dei composti. Separazioni di carta o cromatografia su strato sottile (TLC o PC) sono convenienti perché molti composti possono essere separati su una superficie planare. La separazione è basata sulla polarità, con alcuni composti vincolante strettamente al adsorbente (cellulosa nel caso di PC, e una varietà di adsorbenti nel caso di TLC) e la migrazione meno di altri 1. Figura 1 fornisce un esempio delle posizioni relative composti fenolici polari e apolari dopo separazione su una piastra TLC silice.
Figura 1. Diagramma che illustra le distribuzioni di composti di diverse polarità dopo la separazione su una silice per cromatografia su strato sottile (TLC) piastra. Composti fenolici di trifoglio rosso (Trifolium pratense L.) vengono utilizzati come esempio. Composti polari, come clovamide, hanno una forte affinità per un adsorbente polare come silice e rimangono vicino all'origine (OR), mentre i composti polari meno, come le tre isoflavoni vicino al fronte del solvente (SF), partizione più facilmente in solventi (che sono meno polare silice meno acqua, acidi o basi sono incluse) e migrare lontano sulla piastra.
Dopo separazione di un estratto su una piastra TLC, microrganismi di prova possono essere esposti a tutti i composti sulla piastra, accelerando così l'identificazione dei componenti attivi di un estratto 2. Se una coltura fungina o batterica è esposto al cromatogramma, crescita microbica avverrà ovunque tranne su aree con incremento-inibitoreComposti y. Zone di inibizione quindi possono essere visualizzate osservando il contrasto tra la crescita del micelio e le zone di libero crescita se i funghi sono stati applicati 3 o spruzzo con composti che cambiano colore quando ridotto o idrolizzato dalle cellule viventi 4. Sebbene l'uso di carta o sottile strato cromatogrammi per saggi antimicrobici è stata applicata in primo luogo agli antibiotici 5 e fungicidi 3,6, estratti di piante sono ora spesso sottoposti a screening per composti antimicrobici con questo metodo, spesso definito come bioautografia. I protocolli descritti nel presente documento si applicano a bioautografia di cromatogrammi a film sottile. TLC è ampiamente utilizzato perché è relativamente rapida e può essere eseguita su diversi adsorbenti (ad esempio silice, amido, allumina), oltre a fornire una buona risoluzione e sensibilità 1.
Estratti vegetali possono essere preparati per TLC in molti modi. I metodi più comuni includono materiale vegetale di estrazione in alcmiscele ohol in acqua come etanolo 80% 7,8, eventualmente con l'aggiunta di acido o di base 9. A seguito un'estrazione in tali solventi, che contengono acqua e sono eventualmente acida o basica, estratti devono essere concentrate in modo che possano essere applicati alle piastre TLC in un volume minimo. La concentrazione di estratti alcol-acqua può essere ottenuto partizionando con solventi organici immiscibili in acqua 8 o con una miscela di tali solventi, quali acetato di etile-etere etilico (1:1 v / v) 10,11. Diversi metaboliti vegetali vengono estratti in solventi organici diversi, a seconda della loro polarità. Per assicurarsi che l'impianto acidi organici o basi vengono estratti in solventi organici, in questa fase, il pH di un estratto alcolico-acqua può essere sollevato o abbassato con un acido solubile in acqua o base per convertire analiti dissociate nelle loro forme nondissociated, che sono poi solubile in solventi organici neutri 9. La fase organica può quindi essere postavaporated sotto pressione ridotta o sotto azoto e regolato il volume desiderato per TLC. Il pH dell'estratto è improbabile che sia letale per i microrganismi di prova biologica dovuti all'isolamento di analiti in solventi neutri, piccolo volume finale, e l'evaporazione dell'estratto sulla piastra TLC prima della separazione.
Entrambi i funghi e batteri sono impiegati come microrganismi prova in bioautografia di estratti vegetali 2. Spore di alcuni funghi, come Cladosporium cucumerinum, germinano su piastre di TLC (a parte le zone con composti inibitori) se spruzzato su piastre in una soluzione nutritiva e incubate in un ambiente umido per diversi giorni 3. Il micelio scuro di C. cucumerinum sulle zone noninhibitory fornisce un netto contrasto con le zone franche di crescita del micelio. Anche se i batteri sono stati applicati per cromatografia su strato sottile (TLC) piastre nello stesso modo 4,12, i batteri si riversano anche su TLCsuperfici delle piastre di agar si sovrappone 13,14. Lieviti, come Candida albicans, può essere applicato in sovrapposizioni agar e 14. In alternativa, le piastre TLC possono essere posizionati a faccia in giù su agar inoculato con batteri o lieviti 10,15 8, un metodo noto come contatto bioautografia 2.
Descriviamo un metodo per contatto bioautografia per schermare per i composti fenolici antimicrobici di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland). Il microrganismo test è Clostridium sticklandii, a-ammoniaca produce iper batterio ruminale (HAB) e obbligano anaerobi. Sebbene le separazioni utilizzati non risolvono tutti i componenti dell'estratto, facilitano l'individuazione delle zone di attività antimicrobica, riducendo così il numero di possibili composti antimicrobici. Il protocollo utilizza procedure standard per TLC 1. Il protocollo descrive anche alcune delle tecniche necessarie per la coltura obblighianaerobi cancello per tale saggio, un ciclo di contatto bioautografia 15 e un metodo di visualizzazione con un sale di tetrazolio, che colora le cellule viventi 2,4.
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Protocol
1. Preparazione di Estratto di piante
- Per l'estrazione di composti fenolici da Trifolium pratense cv vedere Kagan e Flythe 10. Kenland.
- Per estrarre altri composti in altre piante, cercare la letteratura analisi fitochimici per metodi di estrazione-vegetali o specifico metabolita (molti sono descritti), o per cercare protocolli come quelli di Khurram et al. 7,8 che isolano molti composti ad un'ampia gamma di polarità.
2. Preparazione delle piastre di strato sottile
- Piastre TLC Clean di sviluppo in uno o più solventi polari, neutri, in modo da spostare i contaminanti adsorbiti dalla zona di sviluppo.
- In una cappa aspirante, preparare abbastanza solvente (es 15-100 ml di acetato di etile-metanolo 2:1, v / v) per coprire il fondo della camera di sviluppo TLC, così come il bordo inferiore di una piastra TLC quando insieme all'interno della camera.
- Utilizzare commervetro cialmente disponibili TLC sviluppare camere (diverse dimensioni disponibili, con coperchi) o foglio coperto di Pyrex bicchieri o vasi da conserva.
- Usare le forbici per tagliare (flessibili) lastre di gel di silice di plastica-backed, che sono disponibili in varie dimensioni (20 cm x 20 cm e più piccoli), per adattarsi alla camera di sviluppo disponibili in alluminio o. (Attenzione: silice può causare danni ai polmoni se inalato funziona in una cappa aspirante, e di gestire le piastre TLC con i guanti per evitare di ottenere oli per la pelle sulla silice.).
- Inserire le piastre nella camera, con le cime appoggiati contro le pareti della camera. Piatti non devono toccarsi. Coprire la camera e lasciare che il solvente spostare la piastra per azione capillare.
- Quando il solvente ha raggiunto la cima delle piastre, rimuovere le piastre dalla camera e disporre in una posizione eretta all'interno della cappa fino solvente è evaporato.
- Verificare se le impurità sono migrati vicino alla parte superiore della piastra TLC cercando una banda gialla sotto visibileluce, o una banda fluorescenti ai raggi ultravioletti (UV) (vedere "fronte impurità" o IF in Figura 2B). Se la maggioranza della piastra presenta ancora una sfumatura giallastra, ripetere il processo di pulizia.
- Dopo aver rimosso le piastre TLC dalla camera, scartare il solvente. Lasciare solvente residuo evaporare completamente prima di utilizzare la camera di protocollo 2.
- Per rimuovere l'umidità residua che può influenzare la migrazione dei composti su silice 16, prop le piastre in posizione verticale in forno a 100 ° C (10-15 min per 20 cm x 20 cm Piatto, e 5 min per 7 cm x 10 cm piastre ).
- Se un 100 ° C forno di essiccazione non è disponibile, piastre di calore per un periodo di tempo più lungo a temperature più basse (cioè 40 min a 60 ° C).
- Dopo le piastre sono asciutti, lasciarli raffreddare a temperatura ambiente prima del caricamento.
3. Preparazione di Sviluppo Chambers per estratto Separation
4. Caricamento e Sviluppo di piastre TLC
- Leggermente segnare l'origine con la matita. Se la piastra assorbente TLC è morbido e facilmente danneggiati, fare segni ai bordi. Composti dovrebbero essere sopra la superficie del solvente di sviluppo quando piastre vengono inseriti nella camera di TLC.
- Sciogliere estratti in solvente organico sufficiente (in questo caso, metanolo) per avere una soluzione concentrata invece di una torbidasospensione.
- Caricare i campioni e gli standard come bande strette con una siringa microlitro o micropipette capillari, lasciando un bordo di 1 cm sui lati della piastra. Lasciare le bande asciugare (sfogliare la targa o caricarlo in una cappa aspirante aiuta).
- Se è necessaria una maggiore concentrazione di campione su un piatto, "overspot" di caricare i campioni di nuovo sulle bande secchi.
- Con pinze o tenaglie, impostare piatto (s) all'interno della camera di TLC saturo. Piastre non dovrebbero toccare lo stoppino perché può fornire solvente alle piastre nei punti di contatto, modificando così il percorso di migrazione composto. Coprire camera e lasciare le piastre si sviluppano.
5. Preparazione di piatti per Bioassay
- Rimuovere piastra (s) dal serbatoio TLC prima il fronte del solvente raggiunge la parte superiore della piastra, e segnare l'altezza del fronte del solvente con una matita. Lasciate monodisco a secco in cappa.
- Sviluppare i rimanenti piastre TLC nella stessa camera TLC, che è generally utilizzabile per un giorno intero se tenuto chiuso. Rifare miscela solvente per camera TLC se la quantità di solvente nella camera diminuisce notevolmente.
- Dopo le piastre sono a secco, visualizzare le bande sotto la luce visibile o UV, e delineare le bande con una matita. Una camera di osservazione con una lampada UV portatile è conveniente, soprattutto se la lampada può rilevare composti sia a 254 nm (UV ad onde corte) e 365 nm (onda lunga UV).
Nota: A questo punto o dopo la fase successiva, le piastre possono essere avvolte in pellicola trasparente, coperto con un foglio, e conservati a -20 ° C. Periodo massimo di conservazione dipende dalla stabilità composto. Poiché la silice non è neutrale, alcuni composti possono degradare mentre sulla piastra TLC. - Fotografare o disegnare piatti.
- Utilizzare un sistema gel foto documentazione, se uno dotato di UV spese generali e / o le luci visibili è disponibile.
- Se nessun sistema di foto documentazione commerciale è disponibile, piatti fotografia all'interno di una scatola foderata con carta o panno scuro, wi° Un set fotocamera su un treppiede e una luce UV portatile bloccato per un anello di supporto 17. Quando si fotografa piatti che non hanno indicatore fluorescente, utilizzare un filtro luce blu sopra l'obiettivo della fotocamera per migliorare banda aspetto 17.
- Per facilitare bande caratterizzazione, calcolare valori del fattore di ritenzione (R f) per distanze percorse dai composti e fronte del solvente misurazione, e dividendo il primo dal (Figura 2A) quest'ultimo.
6. Batterica cultura e Assay
- Preparare e inoculare i terreni in condizioni anaerobiche. La lingua utilizzata in questo caso è stato Clostridium SR ceppo sticklandii, che è stato ottenuto dalla raccolta cultura di James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
- Vedere Flythe e Kagan 13 e l'elenco dei materiali per una descrizione di HAB media.
- Far crescere la cultura fase esponenziale o stazionaria. Utilizzare sterile anaerobica techniques quando si lavora con microrganismi anaerobici.
- Inoculare la cultura (1% v / v) in agar fuso dopo che la temperatura della agar (0,75% w / v) è diminuita a meno di 60 ° C. Mescolare delicatamente e portare subito in una camera anaerobica (95% di CO 2 -5% H 2 atmosfera per HAB media) a versare.
- Versare in 15 millimetri x 100 millimetri di plastica Petri e lasciare solidificare.
- Con le forbici, tagliare la piastra TLC in zone contenenti band (s) di interesse. Lay bande a faccia in giù su piastre di agar, bande sul supporto targhetta di marcatura per tenere traccia di orientamento originale su piastra TLC. Lay una striscia TLC inutilizzato su una piastra di agar come controllo.
- Incubare le piastre di agar agar, lato verso il basso, nella camera anaerobica (24 hr, 39 ° C).
7. Visualizzazione dei piatti Bioassayed Agar
- Con pinze, eliminare le bande da piastre di agar mentre sono nella camera anaerobica.
- Aggiungere 1% (w / v) terosso trazolium, preparato in acqua, a gocce sulle superfici delle piastre di agar. Lasciare che il sviluppare il colore per almeno 20 minuti, o fino a quando la piastra di controllo diventa completamente rossa, prima di rimuovere dalla camera anaerobica. I batteri anaerobici inizieranno a perdere vitalità subito dopo la rimozione dalla camera anaerobica, ma il colore è stabile per più di 24 ore.
- Fotografare in luce visibile.
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Representative Results
Rappresentante separazioni TLC silice di trifoglio rosso (Trifolium pratense cv. Kenland) estratti, contenenti composti fenolici, sono illustrati nella Figura 2. Separazione di estratto di trifoglio rosso in acetato di etile-esano (9:1, v / v), oltre 8,5 cm provocato cinque bande, una incompleto risolto dall'origine (Figura 2A). Tuttavia, la Figura 2B mostra che circa il doppio delle bande sono stati rivelati quando un altro campione di estratto di trifoglio rosso (dalla stessa cultivar, ma coltivate in terreno separato Allo stesso fattoria) è stato separato su una maggiore distanza (15cm invece di 8.5 cm) e con due successivi sviluppi in diversi sistemi solventi. Il cromatogramma di figura 2B è stato sviluppato in acetato di etile-esano (9:1, v / v), e quindi lasciata asciugare e separati in acetato di etile-metanolo (78:22, v / v). Questi risultati dimostrano che sia formato lastra e la scelta del sistema solvente (o serie di s solventiystems) possono influenzare il numero di composti separati su un cromatogramma. In questo caso particolare, l'eluizione e la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) di bande da altre separazioni TLC degli stessi estratti hanno confermato che i composti rimanenti al o vicino all'origine consisteva principalmente da composti fenolici (acidi fenolici o isoflavoni), coniugati alla frazioni polari come i derivati di amminoacidi, zuccheri, o acido malico. Al contrario, gli isoflavoni non coniugati frazioni polari migrati più in alto le piastre TLC 10.
I risultati di un saggio biologico della piastra TLC mostrato in Figura 2A con Clostridium sticklandii, a-ammoniaca producendo iper batterio ruminale (HAB), sono mostrati in Figura 3. Aggiunta di un 1% (w / v) Soluzione acquosa di tetrazolio rosso per le piastre di agar dopo una incubazione 24 hr determinato un colore rosso vivo quando erano macchiati cellule viventi. L'incubazione di fascia 1 (biocanina A) e parte del ba2 nd (formononetina) sui batteri seminate agar portato in una zona ben definita di inibizione (Figura 3A). Tuttavia, incubazione della restante banda 2, insieme a gruppi 3 e 4, non inibisce la crescita batterica (Figura 3B). Questi risultati dimostrano che biocanina A inibiva la C. la crescita sticklandii, ma formononetina non era.
Figura 2. Silica cromatografia su strato sottile (TLC) le separazioni di estratto di Trifolium pratense cv. Kenland, sviluppato in (A) acetato di etile-esani (9:1, v / v), o (B) che stesso solvente seguita da sviluppo in acetato di etile-metanolo (78:22, v / v). La distanza migrato il solvente tra l'origine (OR) e fronte del solvente (SF) è indicata vicinoStaffe tra questi due limiti. In Figura 2B, il "fronte impurità" (IF, località dei impurità spostato la piastra da prelavaggio in solventi polari) è visto come una banda scura nella parte superiore della piastra. Estratti, preparati 180-250 mg liofilizzati foglie di trifoglio rosso e steli, sono stati sciolti in metanolo, e il 10% di estratto (A) o 32% (B) è stato caricato su piastre di silice. Norme caricati sono stati formononetina (f, 7.1 nmol), biocanina A (ba, 7.4 nmol), genisteina (g, 9,8 nmol), e clovamide (Cl, Figura 2B solo 8,7 nmol). Bands sono stati cerchiati mentre visto sotto una lampada UV portatile a 254 nm (UV ad onde corte) e 365 nm (onda lunga UV). Una fotocamera digitale è stato utilizzato per fotografare la targa in onde corte UV. I numeri a destra del trifoglio bande estratto nella Figura 2A si riferiscono alle zone tagliato per saggi biologici. Coefficienti di conservazione (R f, distanza traveled dalla banda / distanza percorsa da SF) sono tra parentesi dopo i numeri della band in figura 2A.
Figura 3. Risultati delle TLC biosaggi piastra di (A) banda 1 e la parte superiore non completamente risolto di banda 2 dalla piastra TLC di figura 2A, e (B) bande 2-4 dalla stessa piastra TLC. Bande sono state poste a faccia in giù su HAB mezzo inoculato con Clostridium sticklandii e incubato in anaerobiosi 24 ore a 39 ° C. Alla fine di questo periodo di incubazione, le bande sono state rimosse, e le piastre di agar sono state colorate con una soluzione acquosa di 1% (w / v) tetrazolio rosso e fotografato con luce visibile.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo semplice per separare un estratto in sottoinsiemi di composti e saggiando i sottoinsiemi per contatto bioautografia. Il metodo è molto simile a quello utilizzato da Chomnawang et al. 15 per lo screening per i metaboliti vegetali inibitori di batteri che causano la gonorrea. Il tipo di bioautografia impiegato per lo screening composti vegetali antimicrobici dipende da molti fattori, tra cui il microrganismo prova, il setup di laboratorio, e le preferenze della persona (s) eseguire il saggio biologico. Contatto bioautografia, il metodo utilizzato in questo studio, è stato criticato per seconda della capacità di un composto di diffondere in supporti inoculati 12. Le zone di inibizione su composti a basse concentrazioni, o con poca capacità di diffondere in media, non possono essere rilevabili se si verifica la crescita in agar sotto il diffusate. Inoltre, una zona di inibizione creato da una banda può estendersi oltre iniziale della bandconfini, così forse mascherando zone di inibizione creato da composti vicini 14. Tuttavia, il contatto bioautografia è un metodo facile da usare, e la capacità di impilare piastre Petri minimizza la quantità di spazio necessario. Inoltre, recante bande TLC su agar elimina il rischio di banda di dissoluzione e di diffusione che può verificarsi quando una lastra TLC è ricoperto di agar inoculato o spruzzato con il microrganismo test.
Ottenere informazioni da uno qualsiasi dei tipi di bioautografia sopra dipende dalle condizioni cromatografiche, concentrazione di prova microrganismo, e condizioni di coltura / incubazione. Risoluzione cromatografica di bande antimicrobici non è indispensabile, ma la sensibilità può essere maggiore per una band ben risolto-6. Bande possono essere separate da sviluppo su piastre più lunghe o più sistemi di solvente in una dimensione (Figura 2B), o in due dimensioni ruotando una piastra TLC 90 gradi prima sviluppoin un secondo solvente 16,19. Composti polari possono essere difficili da separare su silice senza utilizzare miscele di solventi che contengono acidi o basi. Questi possono essere letale per il microrganismo di prova 12, sebbene l'impiego di piccole quantità di acidi è stata riportata 14,15. Sistemi solventi alternativi possono includere acqua o metanolo come componenti 20,21. Composti polari possono essere risolti su diversi tipi di piastre TLC, come piastre rivestite con C 18 adsorbente o cellulosa microcristallina. Tuttavia, la crescita 12 o sensibilità al agente di visualizzazione 14 mag essere influenzate negativamente su alcuni di questi adsorbenti.
Varie combinazioni di prova microrganismo e media possono essere usate per bioautografia. Tuttavia, diversi fattori devono essere considerati quando si seleziona microrganismo e dei media. Il supporto deve essere testato per determinare che non vi sono componenti che riducono il tetrazolium sale e provocare un cambiamento di colore non biologica. L'agar deve essere sufficientemente colore chiaro per fornire contrasto tra le cellule colorate e zone non colorati di inibizione. Un microrganismo che può crescere solo sulla superficie di agar può essere rimosso con il gruppo TLC o lavato via durante la colorazione. Inoltre, la selezione della combinazione microrganismo / mezzo che riduce al minimo la produzione di gas ridurrà bolle in agar. Rumine HAB crescere in un terreno privo di carboidrati carbonato tamponata con una miscela di amminoacidi o peptidi come substrato di crescita. Le piastre di agar sono in oro chiaro e trasparente. Quando C. sticklandii viene coltivato nel mezzo, la maggior parte dei prodotti sono solubili (acidi grassi volatili, ammoniaca). Molto poco gas viene prodotto, che si traduce in una piastra di agar liscia senza bolle.
Questo saggio biologico ha un paio di potenziali applicazioni. La dimensione della zona di inibizione può essere usato come una stima approssimativa dila quantità del composto inibitorio, poiché il raggio della zona di inibizione è proporzionale al logaritmo della quantità del composto che causa l'inibizione 17,22. Forse l'uso più comune di saggi biologici piastra TLC è quello di restringere la gamma dei possibili composti antimicrobici in un estratto vegetale. Dopo aloni di inibizione sono identificati da un saggio biologico, le corrispondenti regioni su una piastra TLC duplicato possono essere eluite con un solvente, ad esempio metanolo, acetato di etile, e analizzati mediante HPLC con rivelazione spettroscopia ultravioletta per iniziare caratterizzare composti bioattivi 10,14.
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Disclosures
La citazione di marchi o prodotti commerciali in questo articolo è al solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica alcuna raccomandazione o approvazione da parte del USDA. Gli autori dichiarano assenza concorrente interesse finanziario.
Acknowledgments
Ringraziamo il compianto Dr. Norm Taylor, Dipartimento Impianti e Scienza del Suolo presso l'Università del Kentucky, per averci permesso di utilizzare campioni dalle sue trame trifoglio rosso per questo studio. Questo progetto è stato finanziato dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
References
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