Summary
Methoden worden beschreven voor dunne-laag chromatografie (TLC) scheiding van plantenextracten en contact bioautografie antibacteriële metabolieten te identificeren. De methoden worden toegepast op de screening van rode klaver fenolen remmen hyper-ammoniak-producerende bacteriën (HAB) thuishoren in de runder pens.
Abstract
Een gemeenschappelijke scherm plantaardige antimicrobiële verbindingen bestaat uit het scheiden plantaardige extracten van papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC), waardoor de chromatogrammen microbiële suspensies (bijv. schimmels of bacteriën in bouillon of agar), waarbij tijd voor de microben groeien een vochtige omgeving, en visualiseren zones zonder microbiële groei. De doeltreffendheid van deze screening methode bekend als bioautografie, afhankelijk van de kwaliteit van de chromatografische scheiding en de zorgvuldigheid microbiële kweekomstandigheden. Dit artikel beschrijft standaardprotocollen voor TLC en contact bioautografie met een nieuwe toepassing om-zuur gistende bacteriën aminozuren. Het extract wordt afgescheiden in flexibele (aluminium omlijsting) silica TLC-platen en banden gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht. Zones zijn uitgesneden en gedurende de voorkant omlaag op agar geënt met de test micro-organisme. Remmende banden worden gevisualiseerd door kleuring van de agar plaats met tetrazolium rood. De methode wordt toegepast op de scheiding van rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland) fenolen en hun screening op activiteit tegen Clostridium sticklandii, een hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB) die is afkomstig uit de runder pens. De TLC methoden toepassen op vele soorten plantenextracten en andere bacteriesoorten (aëroob of anaëroob), evenals schimmels, kan worden gebruikt als testorganismen als cultuuromstandigheden worden aangepast aan de groeivereisten van de soort passen.
Introduction
Testen op antimicrobiële verbindingen in planten vereist het scheiden van de componenten van een plantenextract, blootstellen test micro-organisme die delen, en het bepalen of groei van het micro-organisme wordt geremd door een van de verbindingen. Scheidingen door papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC) zijn handig omdat veel verbindingen kunnen worden gescheiden op een vlak oppervlak. Scheiding is gebaseerd op polariteit met sommige verbindingen binden stevig aan het adsorptiemiddel (cellulose bij pc, en een verscheidenheid van adsorptiemiddelen bij TLC) en het migreren van minder dan anderen 1. Figuur 1 geeft een voorbeeld van de relatieve posities van polaire en niet-polaire fenolen na scheiding op een silica TLC-plaat.
Figuur 1. Diagram verdelingen van verbindingen met verschillende polariteit na scheiding op een silica dunne-laagchromatografie (TLC) plaat. Fenolverbindingen rode klaver (Trifolium pratense L.) dienen als voorbeeld. Polaire verbindingen, zoals clovamide, een sterke affiniteit voor een polair adsorptiemiddel zoals silica en blijft bij de oorsprong (OR), terwijl minder polaire verbindingen, zoals de drie isoflavonen bij vloeistoffront (SF), verdeling gemakkelijker in de oplosmiddelen (die minder polair dan silica tenzij water, zuren, basen of zijn opgenomen) en migreren verder de plaat.
Na afscheiding van een extract op een TLC-plaat kunnen micro-organismen in worden blootgesteld aan verbindingen op de plaat, waardoor sneller de identificatie van de actieve componenten van een extract 2. Als een schimmel of bacteriële kweek wordt blootgesteld aan het chromatogram zal microbiële groei overal optreden behalve dan gebieden met groei-inhibitory verbindingen. Remmingszones dan kan worden gevisualiseerd door het observeren van het contrast tussen myceliumgroei en de groei gebieden als fungi zijn aangebracht 3 of door besproeien met verbindingen die van kleur veranderen wanneer verminderd of gehydrolyseerd door levende cellen 4. Hoewel het gebruik van papier of dunne-laag chromatogrammen antimicrobiële assays eerst werd op 5 antibiotica en fungiciden 3,6 worden plantenextracten nu regelmatig onderzocht op antimicrobiële samenstellingen met deze werkwijze vaak aangeduid als bioautografie. De hierin beschreven protocollen toepassing bioautografie dunne-laag chromatogrammen. TLC wordt veel gebruikt omdat het relatief snel en kan worden uitgevoerd op verschillende adsorptiemiddelen (bijvoorbeeld silica, zetmeel, aluminiumoxide), alsmede het verschaffen van goede resolutie en gevoeligheid 1.
Plantenextracten kunnen worden voorbereid TLC op vele manieren. Voorkomende methodes zijn extraheren plantmateriaal in alcohol-watermengsel zoals 80% ethanol 7,8, eventueel met toevoeging van zuur of base 9. Na een extractie dergelijke oplosmiddelen, die wat water bevatten en eventueel zure of basische moet extracten worden geconcentreerd zodat ze kunnen worden toegepast op TLC platen in een minimaal volume. De concentratie van alcohol-water extracten worden bereikt door het verdelen van met water mengbare organische oplosmiddelen 8 of een mengsel van dergelijke oplosmiddelen, zoals ethylacetaat-ethylether (1:1, v / v) 10,11. Verschillende plantmetabolieten worden geëxtraheerd in verschillende organische oplosmiddelen, afhankelijk van de polariteit. Om plantaardige organische zuren of basen worden geëxtraheerd in organische oplosmiddelen in dit stadium kan de pH van een alcohol-water extract worden verhoogd of verlaagd met een in water oplosbare zuur of base aan gedissocieerde analyten zetten in hun nondissociated vormen, die vervolgens oplosbaar in neutraal organische oplosmiddelen 9. De organische fase kan dan worden evaporated onder verminderde druk of onder stikstof en op de gewenste volume TLC. De pH van het extract waarschijnlijk dodelijk bioassay microorganismen door de verdeling van analyten in neutrale oplosmiddelen, kleine eindvolume en indampen van het extract op de TLC plaat vóór scheiding zijn.
Zowel schimmels en bacteriën werkzaam zijn als proef micro-organismen in bioautografie van plantenextracten 2. Sporen van sommige schimmels, zoals Cladosporium cucumerinum ontkiemen op TLC-platen (met uitzondering van gebieden met remmende verbindingen) of gesproeid op platen in een voedingsoplossing en geïncubeerd in een vochtige omgeving voor meerdere dagen 3. De donkere mycelium van C. cucumerinum op non-inhibitive zones zorgt voor een scherp contrast met zones vrij van myceliumgroei. Hoewel bacteriën zijn toegepast op dunnelaagchromatografie (TLC) platen op dezelfde wijze 4,12, zijn bacteriën ook uitgegoten over TLCplaat oppervlakken in agar overlays 13,14. Gist zoals Candida albicans, kunnen worden toegepast agar overlays en 14. Als alternatief TLC-platen kan worden gezicht naar beneden geplaatst op agar geënt met bacteriën 10,15 of gist 8, een methode die bekend staat als contact bioautografie 2.
We beschrijven een methode voor contact bioautografie om te screenen op antimicrobiële fenolen uit rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland). De test micro-organisme Clostridium sticklandii, een pens hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB) en obligaat anaërobe. Hoewel de scheidingen die niet alle componenten van het extract lossen, vergemakkelijken ze de identificatie van gebieden van antimicrobiële activiteit, waardoor het verkleinen van de pool van mogelijke antimicrobiële verbindingen. Het protocol maakt gebruik van standaardprocedures voor TLC 1. Het protocol beschrijft ook een aantal van de technieken die nodig zijn voor het kweken obligate anaeroben voor een dergelijke test, een gebruik van contact bioautografie 15 en een visualisatie methode met een tetrazoliumzout, die levende cellen 2,4 vlekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Plant Extract
- Zie Kagan en Flythe 10 voor de extractie van fenolische verbindingen van Trifolium pratense cv. Kenland.
- Om andere verbindingen te extraheren in andere planten, controleer dan de fytochemische analyse literatuur voor planten-of metaboliet-specifieke extractie methoden (velen zijn beschreven), of kijk naar protocollen zoals die van Khurram et al.. 7,8 die veel verbindingen te isoleren met een brede waaier van polariteiten.
2. Bereiding van dunne-laagplaten
- Schoon TLC platen meer door in een of meer polair, neutraal oplosmiddel, teneinde geadsorbeerde verontreinigingen weg van de zone van ontwikkeling bewegen.
- In een zuurkast bereiden genoeg gebruikte oplosmiddel (bijv. 15-100 ml ethylacetaat-methanol 02:01, v / v) aan de onderzijde van de TLC ontwikkelkamer, en de onderrand van een TLC-plaat als set dekken binnen de kamer.
- Gebruik commerverkrijgbare glazen TLC ontwikkelen van camera's (verschillende maten verkrijgbaar, met een deksel) of-folie bedekt Pyrex bekers of weckpotten.
- Gebruik een schaar om aluminium-of kunststof-backed (flexibele) silicagel platen, die zijn er in verschillende maten (20 cm x 20 cm en kleiner), de beschikbare ontwikkelkamer pasvorm. (Let op: silica kan longschade veroorzaken bij inademing Werk in een zuurkast, en handvat TLC platen met handschoenen om te voorkomen dat de huid olie op het silica..)
- Plaats de platen in de kamer, met de toppen leunend tegen de wanden. De platen moeten elkaar niet raken. Bedek de kamer en laat het oplosmiddel hoger op de plaat door capillaire werking.
- Als oplosmiddel de bovenkant van de platen heeft bereikt, verwijderen platen uit kamer en schik in een staande positie in de zuurkast tot oplosmiddel verdampt is.
- Controleer of onzuiverheden in de buurt van de bovenkant van de TLC-plaat zijn gemigreerd op zoek naar een gele band onder zichtbaarlicht, of een fluorescerende band onder ultraviolet (UV) licht (zie de "onzuiverheid front" of als in figuur 2B). Als de meerderheid van de plaat heeft nog steeds een gelige tint, herhaal het reinigingsproces.
- Na het verwijderen van TLC-platen uit de kamer, gooi het oplosmiddel. Laat restoplosmiddel volledig verdampt voordat u de kamer voor protocol 2.
- Om restvocht die invloed migratie van verbindingen op silica 16 verwijderen prop de platen rechtop in een droogoven bij 100 ° C (10-15 min bij 20 cm x 20 cm plaat en 5 min bij 7 cm x 10 cm platen ).
- Bij 100 ° C droogoven niet beschikbaar, warmte platen gedurende langere tijd bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld 40 minuten bij 60 ° C).
- Nadat de platen droog, laat ze afkoelen tot kamertemperatuur voordat het laden.
3. Voorbereiding van de ontwikkeling van Chambers voor Extract scheiding
4. Laden en Ontwikkeling van TLC platen
- Lichtjes markeren de oorsprong met potlood. Als de TLC-plaat adsorbens is zacht en gemakkelijk beschadigd raken, maken merken randen. Verbindingen moet boven het oppervlak van de ontwikkelvloeistof als platen in de TLC kamer worden geplaatst.
- Los uittreksels voldoende organisch oplosmiddel (in casu methanol) om een geconcentreerde oplossing in plaats van een troebele hebbensuspensie.
- Load monsters en standaarden als smalle banden met een microliter injectiespuit of capillaire micropipetten, waardoor een 1 cm rand aan de zijkanten van de plaat. Laat de banden om te drogen (waaieren de plaat of u het in een zuurkast helpt).
- Als een grotere concentratie van het monster op een bord, "overspot" is nodig door het laden monsters weer op de droge banden.
- Met een pincet of tang, de gemonteerde plaat (s) in de verzadigde TLC kamer. De platen moeten niet de lont aan, aangezien hij op contactpunten oplosmiddel kan leveren aan de platen, waardoor het pad van verbinding migratie veranderen. Bedek kamer en laat platen te ontwikkelen.
5. Voorbereiding van de plaatjes voor Bioassay
- Verwijder de plaat (s) van TLC tank voordat het oplosmiddel voor de bovenkant van de plaat is gekomen, en markeer de hoogte van het oplosmiddel voorzijde met een potlood. Laat plaat droog in zuurkast.
- Ontwikkel resterende TLC platen in dezelfde TLC kamer die is generally bruikbaar voor een hele dag als gesloten gehouden. Remake oplosmiddelenmengsel voor TLC kamer als de hoeveelheid oplosmiddel in de kamer daalt met name.
- Na platen zijn droog, visualiseren banden onder zichtbaar of UV-licht, en af te bakenen banden met potlood. Een weergave kamer met een draagbare UV-lamp is geschikt, vooral wanneer de lamp verbindingen detecteren zowel 254 nm (korte golf UV) en 365 nm (lange-golf UV).
NB: Op dit punt of na de volgende stap kunt platen worden verpakt in plastic folie, bedekt met een folie, en opgeslagen bij -20 ° C. Maximale opslagcapaciteit is afhankelijk van samengestelde stabiliteit. Omdat silica is niet neutraal, kunnen sommige verbindingen terwijl degraderen op de TLC-plaat. - Fotograferen of tekenen platen.
- Gebruik een gel photodocumentation systeem als een uitgerust met overhead UV en / of zichtbaar licht beschikbaar is.
- Als er geen commerciële photodocumentation systeem beschikbaar is, foto platen binnenkant van een doos bekleed met donker papier of doek, wiTh Een camera op een statief en een draagbare UV-licht vastgeklemd zit op een ring staan 17. Bij het fotograferen van platen die geen fluorescentie-indicator hebben, gebruik dan een blauw licht filter over de lens van de camera om band uiterlijk 17 te verbeteren.
- Om te helpen bij het karakteriseren van bands, berekenen retentiefactor (Rf) waarden door het meten van afstanden afleggen verbinding en oplosmiddel voor, en het verdelen van de eerstgenoemde aan de laatstgenoemde (Figuur 2A).
6. Bacteriële Cultuur en Assay
- Bereiden en te enten media onder anaërobe omstandigheden. De cultuur die in dit geval was Clostridium sticklandii stam SR, die werd verkregen uit de kweek collectie van James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
- Zie Flythe en Kagan 13 en de lijst met materialen voor een beschrijving van HAB media.
- Groeien de cultuur tot exponentiële of stationaire fase. Gebruik steriele anaërobe techniques bij het werken met anaërobe micro-organismen.
- Injecteer de (1% v / v) in gesmolten agar nadat de temperatuur van de agar (0,75% w / v) is gedaald tot minder dan 60 ° C. Meng voorzichtig en onmiddellijk brengen in een anaerobe kamer (95% CO 2 -5% H 2 atmosfeer voor HAB media) te gieten.
- Giet het mengsel in 15 mm x 100 mm kunststof petrischaaltjes, en laat stollen.
- Knip met een schaar de TLC-plaat in zones met band (s) van belang. Leg bands gezicht naar beneden op agar-platen, het markeren van banden op de plaat steun voor het bijhouden van de oorspronkelijke oriëntatie op TLC plaat te houden. Leg een ongebruikte TLC strook op een agar plaat als controle.
- Incubeer agarplaten, agar naar beneden, in de anaërobe kamer (24 uur, 39 ° C).
7. Visualisatie van een bioassay Agar Plates
- Met een pincet, verwijder bands uit agar-platen, terwijl ze in de anaërobe kamer.
- Voeg 1% (w / v) tetrazolium rood, bereid in water, druppelsgewijs op de oppervlakken van de agarplaten. Laat de kleur ontwikkelen gedurende ten minste 20 minuten, of totdat de controle-plaat wordt helemaal rood, voordat u bij de anaërobe kamer. De anaërobe bacteriën beginnen levensvatbaarheid verliezen onmiddellijk na verwijdering uit de anaërobe kamer, maar de kleur is stabiel gedurende meer dan 24 uur.
- Fotograferen onder zichtbaar licht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vertegenwoordiger silica TLC scheidingen van rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland) extracten, het bevat fenolische verbindingen, zijn weergegeven in figuur 2. Scheiding van rode klaver extract in ethylacetaat-hexaan (9:1, v / v), meer dan 8,5 cm, resulteerde in vijf banden, een onvolledig gescheiden van de oorsprong (Figuur 2A). Echter, Figuur 2B toont aan dat ongeveer tweemaal zoveel banden werden onthuld wanneer een ander monster van rode klaver extract (uit dezelfde cultivar, maar gekweekt in een aparte kavel op dezelfde boerderij) werd gescheiden op een grotere afstand (15 cm in plaats van 8,5 cm) en twee opeenvolgende ontwikkelingen in verschillende oplosmiddelsystemen. Het chromatogram van Figuur 2B werd ontwikkeld in ethylacetaat-hexaan (9:1, v / v), en vervolgens drogen en scheiden in ethylacetaat-methanol (78:22, v / v). Deze resultaten tonen aan dat zowel plaatformaat en gekozen oplosmiddel systeem (of een reeks oplosmiddelen enystems) kan het aantal verbindingen gescheiden op een chromatogram beïnvloeden. In dit geval, elutie en hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) van banden van andere TLC scheidingen van dezelfde extracten bevestigd dat de verbindingen nog op of nabij de oorsprong bestond hoofdzakelijk uit fenolische verbindingen (fenolische zuren of isoflavonen) geconjugeerd polaire resten zoals aminozuurderivaten, suikers of appelzuur. In tegenstelling, isoflavonen niet geconjugeerd aan polaire groepen gemigreerd verder de TLC-platen 10.
De resultaten van de bioassay van de TLC-plaat is getoond in figuur 2A met Clostridium sticklandii een pens hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB), worden getoond in Figuur 3. Het toevoegen van een 1% (w / v) waterige oplossing van tetrazolium rood naar de agar platen na 24 uur incubatie resulteerde in een heldere rode kleur wanneer levende cellen gekleurd. Incubatie van band 1 (biochanine A) en een deel van de band 2 (formononetine) op bacteriën geplaatste agar resulteerde in een welbepaalde zone van inhibitie (figuur 3A). Incubatie van de rest van band 2, samen met banden 3 en 4, niet bacteriële groei (figuur 3B) remmen. Deze resultaten toonden aan dat biochanine A was remmend C. sticklandii groei, maar formononetine was niet.
Figuur 2. Silica dunne-laag chromatografie (TLC) scheidingen van een extract van Trifolium pratense cv. Kenland, ontwikkeld in (A) ethylacetaat-hexanen (9:1, v / v) of (B) hetzelfde oplosmiddel, gevolgd door ontwikkeling in ethylacetaat-methanol (78:22, v / v). De afstand gemigreerd het oplosmiddel tussen de oorsprong (OR) en oplosmiddel voor (SF) wordt aangegeven bij debeugels tussen deze twee grenzen. In figuur 2B, de "onzuiverheid front" (IF, locatie van de onzuiverheden hoger op de plaat van voorwas polaire oplosmiddelen) wordt gezien als een donkere band aan de bovenkant van de plaat. Extracten bereid 180-250 mg gevriesdroogde rode klaver bladeren en stengels werden opgelost in methanol en werd 10% extract (A) of 32% (B) op silicaplaten geladen. Normen geladen werden formononetine (f, 7,1 nmol), biochanine A (ba, 7,4 nmol), genisteïne (g, 9,8 nmol), en clovamide (Cl, Figuur 2B alleen, 8,7 nmol). Banden werden omcirkeld terwijl bekeken onder een handbediende UV-lamp bij 254 nm (korte golf UV) en 365 nm (lange-golf UV). Een digitale camera werd gebruikt om de plaat fotograferen onder korte golf UV. De getallen rechts van de klaver extract bands in figuur 2A verwijzen naar de zones geknipt voor bioassays. Retentie factoren (Rf, afstand traveled door band / afstand die SF) zijn tussen haakjes achter band nummers in figuur 2A.
Figuur 3. Resultaten van TLC plaat bioassays van (A) band 1 en het onvolledig gescheiden bovenste deel van de band 2 van de TLC-plaat van figuur 2A, en (B) bands 2-4 van dezelfde TLC-plaat. Bands werden gelegd gezicht naar beneden op HAB medium geïnoculeerd met Clostridium sticklandii anaëroob geïncubeerd en 24 uur bij 39 ° C. Aan het einde van deze incubatieperiode werden de banden verwijderd en de agar platen werden gekleurd met een waterige oplossing van 1% (w / v) tetrazolium rood en gefotografeerd onder zichtbaar licht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het scheiden van een extract in deelverzamelingen van verbindingen en het testen van de subsets door contact bioautografie. De methode is vrij gelijkaardig aan degene die door Chomnawang et al.. 15 voor het screenen op plantenmetabolieten remmende to-gonorroe-veroorzakende bacteriën. Het type bioautografie gebruikt om het scherm voor antimicrobiële plantaardige stoffen hangt af van vele factoren, waaronder de test micro-organisme, het laboratorium setup, en de voorkeuren van de persoon (s) uitvoeren van de bioassay. Contact bioautografie de werkwijze die in deze studie, is bekritiseerd afhankelijk van het vermogen van een verbinding om diffunderen geënte medium 12. Remmingszones dan verbindingen bij lage concentraties, of met weinig vermogen te diffunderen media niet detecteerbaar als de groei optreedt in de agar onder de diffusate. Ook kan een zone van remming gemaakt door een band verspreid buiten de eerste van de bandgrenzen, wellicht dus ook maskeren remmende zones gecreëerd door naburige verbindingen 14. Echter, contact bioautografie is een eenvoudige methode te gebruiken, en de mogelijkheid om petrischalen stapelen minimaliseert de hoeveelheid ruimte nodig. Bovendien, tot TLC banden op agar elimineert het risico van band ontbinding en verspreiden die kan optreden wanneer een TLC-plaat bedekt met geïnoculeerde agar of besproeid met de te onderzoeken micro-organisme.
Informatie verkrijgen uit een van de bovengenoemde soorten bioautografie afhankelijk van de chromatografische omstandigheden testen organisme concentratie en cultuur / incubatieomstandigheden. Chromatografische resolutie van antimicrobiële bands is niet onmisbaar, maar de gevoeligheid kan groter zijn voor een goed opgelost band 6. Banden kunnen worden gescheiden door ontwikkeling op langere platen of meerdere oplosmiddelsystemen in een dimensie (figuur 2B), of in twee dimensies door aan een TLC-plaat 90 graden voor ontwikkelingin een tweede oplosmiddel 16,19. Polaire verbindingen kunnen moeilijk te scheiden op silicagel zonder oplosmiddelmengsels die zuren of basen bevatten. Deze kunnen dodelijk voor de proef 12 micro-organisme, hoewel het gebruik van kleine hoeveelheden zuren gerapporteerd 14,15. Alternatief oplosmiddel systemen kan water of methanol bevatten als componenten 20,21. Polaire verbindingen kunnen worden opgelost verschillende TLC-platen, zoals platen bekleed met C 18 adsorbens of microkristallijne cellulose. Echter, kan de groei 12 of gevoeligheid voor de visualisatie middel 14 negatief beïnvloed op sommige van deze adsorbentia.
Vele verschillende combinaties van testen organisme en media kunnen worden gebruikt voor bioautografie. Toch moeten verscheidene factoren worden overwogen bij het selecteren van micro-organismen en media. De media moeten worden getest om te bepalen dat er geen onderdelen die het tet verminderenrazolium zout en leiden tot een niet-biologische kleurverandering. De agar moet ook licht genoeg in kleur om het contrast tussen de gekleurde cellen en ongekleurde remmingszones bieden. Een micro-organisme die alleen groeien op het oppervlak van de agar kan met TLC band worden verwijderd of weggewassen tijdens kleuring. Daarnaast zal de selectie van micro-organisme / medium combinatie die gasproductie minimaliseert belletjes te verminderen in de agar. Pens HAB groeien in een carbonaat gebufferde, koolhydraat-vrij medium met een mengsel van aminozuren of peptiden als groeisubstraat. De agar platen zijn licht goud en transparant. Wanneer C. sticklandii wordt gekweekt in het medium, de meeste producten zijn oplosbaar (vluchtige vetzuren, ammoniak). Zeer weinig gas ontstaat, waardoor een soepele agarplaat zonder luchtbellen.
Dit bioassay heeft een paar mogelijke toepassingen. De grootte van de zone van remming kan worden gebruikt als een ruwe schatting vanhet bedrag van de remmende verbinding, aangezien de straal van de remmende zone evenredig met de logaritme van de hoeveelheid van de verbinding waardoor de inhibitie 17,22. Misschien is de meest voorkomende gebruik van TLC-plaat bioassays is om het bereik van mogelijke antimicrobiële verbindingen beperken in een plantenextract. Na remmingszones worden geïdentificeerd door een bioassay kunnen de overeenkomstige gebieden van een duplicaat TLC-plaat worden geëlueerd met een oplosmiddel, zoals methanol of ethylacetaat, en met HPLC geanalyseerd met ultraviolet spectroscopie detectie beginnen karakteriseren bioactieve stoffen 10,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in het artikel is uitsluitend ten behoeve van het verstrekken van specifieke informatie en impliceert niet aanbeveling of goedkeuring door de USDA. De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.
Acknowledgments
Wij danken wijlen Dr Norm Taylor, Dept Plant and Soil Science aan de Universiteit van Kentucky, voor het mogelijk maken om de monsters van zijn rode klaver percelen voor deze studie. Dit project werd gefinancierd door het Amerikaanse ministerie van Landbouw.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
