Summary
Metoder beskrivs för tunnskiktskromatografisk (TLC) separation av växtextrakt och kontakt bioautografi att identifiera antibakteriella metaboliter. Metoderna tillämpas på screening av rödklöver fenolföreningar som hämmar hyper ammoniakproducerande bakterier (HAB) hemma i nötkreatur våmmen.
Abstract
En gemensam skärm för växtantimikrobiella föreningar består av separerande växtextrakt av papper eller tunn-skiktskromatografi (PC eller TLC), utsätta kromatogrammen till mikrobiala suspensioner (t.ex. svampar eller bakterier i buljong eller agar), vilket ger tid för mikroberna att växa i en fuktig miljö, och visualisera zoner utan mikrobiell tillväxt. Effekten av denna screeningmetod, kallad bioautografi, beror på både kvaliteten på den kromatografiska separationen och den omsorg med mikrobiella odlingsbetingelser. Detta dokument beskriver standardprotokoll för TLC och kontakt bioautografi med en ny ansökan till aminosyra-jäsande bakterier. Extraktet separeras på flexibla (aluminium-backed) kiseldioxid-TLC-plattor, och banden visualiserades under ultraviolett (UV) ljus. Zoner skärs ut och odlades sidan nedåt på agar inokuleras med testmikroorganismen. Hämmande band visualiseras genom färgning agarplattans med tetrazolium rött. Metoden tillämpas på separation av rödklöver (Trifolium pratense cv. Kenland) fenolföreningar och deras screening för aktivitet mot Clostridium sticklandii, en hyperammoniakproducerande bakterie (HAB) som hör hemma i nötkreatur våmmen. TLC-metoder som tillämpas på många typer av växtextrakt och andra bakteriearter (aeroba eller anaeroba), liksom svampar, kan användas som testorganismer om odlingsbetingelserna modifieras för att passa tillväxtkrav arten.
Introduction
Testmetoder för antimikrobiella föreningar i växter kräver separation av komponenterna i ett växtextrakt, utsätta en testmikroorganism till dessa komponenter, och bestämning av huruvida mikroorganismen tillväxt inhiberas av någon av föreningarna. Separationer av papper eller tunnskiktskromatografi (PC eller TLC) är praktiskt eftersom många föreningar kan separeras på en plan yta. Separation bygger på polaritet, med vissa föreningar binder hårt till adsorbenten (cellulosa vid datorn, samt en mängd olika adsorbenter i fallet med TLC) och migrerar mindre än andra 1. Figur 1 visar ett exempel på de relativa positionerna för polära och opolära fenolföreningar efter separation på en kvarts TLC-platta.
Figur 1. Diagram som visar fördelningarna av föreningar med olika polariteter efter separation på en kiseldioxid tunnskiktskromatografisk (TLC)-platta. Fenolföreningar av rödklöver (Trifolium pratense L.) används som ett exempel. Polära föreningar, såsom clovamide, har en stark affinitet för en polär adsorbent som kiseldioxid och förbli nära origo (OR), medan mindre polära föreningar, såsom de tre isoflavoner nära lösningsmedelsfronten (SF), partition lättare i lösningsmedlen (som är mindre polära än kisel om inte vatten, syror eller baser ingår) och vandrar längre upp plattan.
Efter separation av ett extrakt på en TLC-platta, kan testmikroorganismer utsättas för alla föreningar på plattan, vilket leder till snabbare identifiering av de aktiva komponenterna i ett extrakt 2. Om en svamp-eller bakterieodling utsätts för kromatogrammet kommer mikrobiell tillväxt inträffa överallt utom över områden med tillväxt-inhibitory föreningar. Zoner med inhibition då kan visualiseras genom att observera kontrasten mellan myceltillväxt och tillväxtfria områden om svampar har tillämpats 3 eller genom sprayning med föreningarna som ändrar färg när de reduceras eller hydrolyseras av levande celler 4. Även om användningen av papper eller tunnskikts kromatogram för antimikrobiella analyser var först på antibiotika 5 och svampmedel 3,6, är växtextrakt nu ofta screenas för antimikrobiella föreningar med denna metod, som ofta kallas bioautografi. De protokoll som beskrivs här gäller för bioautografi av tunnskikts kromatogram. TLC används ofta eftersom det är relativt snabb och kan utföras på olika adsorptionsmedel (t.ex. kiseldioxid, stärkelse, aluminiumoxid), samt att ge god upplösning och känslighet 1.
Växtextrakt kan förberedas för TLC på många sätt. Vanliga metoder är utvinna växtmaterial i alcohol-vattenblandningar, såsom 80% etanol 7,8, eventuellt med tillsats av syra eller bas 9. Efter en extraktion i sådana lösningsmedel, som innehåller lite vatten och som är eventuellt sur eller basisk, måste extrakten koncentreras, så att de kan tillämpas på TLC-plattor i en minimal volym. Koncentrationen av alkohol-vattenextrakt kan åstadkommas genom uppdelning av med vatten oblandbara organiska lösningsmedel 8 eller med en blandning av sådana lösningsmedel, såsom etylacetat-etyleter (1:01, vol / vol) 10,11. Olika växtmetaboliter utvinns i olika organiska lösningsmedel, beroende på deras polaritet. För att säkerställa att anläggningen organiska syror eller baser utvinns i organiska lösningsmedel i detta skede, kan pH-värdet av en alkohol-vattenextrakt höjas eller sänkas med en vattenlöslig syra eller bas för att omvandla dissocierade analyter i sina nondissociated former, som sedan löslig i neutralt organiska lösningsmedel 9. Den organiska fasen kan sedan evaporated under reducerat tryck eller under kväve och justerades till den önskade volymen för TLC. PH-värdet i extraktet är osannolikt att vara dödliga för bioassay mikroorganismer på grund av uppdelningen av analyter i neutrala lösningsmedel, liten slutlig volym, och avdunstning av extraktet på TLC-plattan före separationen.
Både svampar och bakterier används som test mikroorganismer i bioautografi av växtextrakt 2. Sporer av vissa svampar, t.ex. Cladosporium cucumerinum, gro på TLC-plattor (med undantag av områden med inhibitoriska föreningar) om sprayas på plattorna i en näringslösning och inkuberades i en fuktig miljö under flera dagar 3. Den mörka mycel av C. cucumerinum på noninhibitory zoner ger en skarp kontrast till zoner fria från myceltillväxt. Även om bakterier har använts för tunnskiktskromatografi (TLC)-plattor på samma sätt 4,12, är bakterier också hälls över TLCplåtytor i agar överdrar 13,14. Jäst, såsom Candida albicans, kan appliceras i agar-övertäckningar samt 14. Alternativt kan TLC-plattor placeras med framsidan nedåt på agar ympas med bakterier 10,15 eller jäst 8, en metod som kallas kontakt bioautografi 2.
Vi beskriver en metod för kontakt bioautografi att screena för antimikrobiella fenolföreningar från rödklöver (Trifolium pratense cv. Kenland). Testet mikroorganism är Clostridium sticklandii, en ruminal hyper ammoniakproducerande bakterien (HAB) och obligat anaerob. Även om separationer som används inte löser alla komponenter i extraktet, de underlättar identifiering av zoner av antimikrobiell aktivitet, vilket minskar den poolen av möjliga antimikrobiella föreningar. Protokollet använder standardprocedurer för TLC 1. Protokollet beskriver också några av de tekniker som krävs för odling skylgate anaerober för en sådan analys, en användning av kontakt bioautografi 15 och en visualiseringsmetod med ett tetrazoliumsalt, som färgar levande celler 2,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av växtextrakt
- Se Kagan och Flythe 10 för utvinning av fenolföreningar från Trifolium pratense cv. Kenland.
- För att utvinna andra föreningar i andra växter, kontrollera växtkemiska analyslitteraturen för växt-eller metabolit specifik extraktionsmetoder (många är beskrivna) eller leta efter protokoll som de i Khurram et al. 7,8 som isolerar många föreningar med ett brett olika polariteter.
2. Beredning av tunnskiktsplattor
- Clean TLC-plattor genom att utveckla i en eller flera polära, neutrala lösningsmedel, för att flytta adsorberade föroreningar bort från zonen av utvecklingen.
- I ett dragskåp bereda tillräckligt rengöringslösningsmedel (t ex 15 till 100 ml etylacetat-metanol 02:01, v / v) för att täcka botten av TLC framkallningskammaren, såväl som den nedre kanten på en TLC-platta när uppsättning inne i kammaren.
- Använd kommersiellellt tillgängliga glas TLC utveckla kammare (olika format, med lock) eller folietäckta Pyrex bägare eller konserveringsglas.
- Använd en sax för att klippa av aluminium-eller plastfodrade (flexibla) kiselgelplattor, som finns i olika storlekar (20 cm x 20 cm och mindre), för att passa den tillgängliga framkallningskammaren. (Varning: kisel kan ge lungskador vid inandning arbeta i ett dragskåp och hantera TLC-plattor med handskar för att undvika att få hudfett på kiseldioxid..)
- Sätt plattorna in i kammaren, med toppar som lutar mot kammarens väggar. Plattorna får inte röra varandra. Täck kammaren och låta lösnings flytta upp plattan genom kapillärverkan.
- När lösningsmedlet har nått toppen av plattorna, avlägsna plattorna från kammaren och arrangera i en stående position i dragskåp tills lösningsmedlet avdunstat.
- Kontrollera om föroreningar har migrerat nära toppen av TLC-plattan genom att leta efter ett gult band under synligtljus, eller en fluorescerande band under ultraviolett (UV) ljus (se "orenhet front" eller IF i figur 2B). Om majoriteten av plattan fortfarande har en gulaktig nyans, upprepa rengöringen.
- Efter att ha avlägsnat TLC-plattor från kammaren, kassera lösningsmedel. Låt kvarvarande lösningsmedel avdunsta helt innan du använder kammaren för protokoll 2.
- För att ta bort kvarvarande fukt som kan påverka migreringen av föreningar på kiseldioxid 16, prop plattorna upprätt i en torkugn vid 100 ° C (10 till 15 min för en 20 cm X 20 cm platta, och 5 min för 7 cm x 10 cm plattor ).
- Om en 100 ° C torkugn inte är tillgängligt, värmeplattor för en längre tid vid lägre temperaturer (dvs. 40 minuter vid 60 ° C).
- Efter det att plattorna är torra, låt dem svalna till rumstemperatur före laddning.
3. Beredning av Utveckla Chambers för Extract Separation
4. Lastning och utveckling av TLC-plattor
- Lätt märka ursprunget med blyerts. Om TLC-plattan adsorbent är mjuk och skadas lätt, gör markeringar på kanterna. Föreningar bör vara över ytan av framkallningslösning när plattorna in i TLC-kammaren.
- Lös upp extrakten i tillräckligt med organiskt lösningsmedel (i detta fall, metanol) för att ha en koncentrerad lösning i stället för en grumligsuspension.
- Last prover och standarder som smala band med en mikroliter spruta eller kapillär mikropipetter, som lämnar en 1 cm kant på sidorna av plattan. Låt banden torka (fläktade plattan eller läsa in den i ett dragskåp hjälper).
- Om det krävs en större koncentration av prov på en tallrik, "overspot" av proverna igen på de torkade banden.
- Med pincett eller tång, satt skylt (ar) inne i mättade TLC kammare. Plattorna får inte röra veken, eftersom det kan ge lösningsmedel till plattorna vid kontaktpunkterna, alltså ändra flödet på förening migration. Täck kammaren och låta plattorna utvecklas.
5. Beredning av plattorna för Bioassay
- Ta bort plattan (s) från TLC tank innan lösningens front når toppen av plattan, och markera höjden på lösningsmedelsfronten med en blyertspenna. Låt plattan torka i dragskåp.
- Utveckla eventuella kvarvarande TLC-plattor i samma TLC-kammare, som är GEnerally användbart för en hel dag om de hålls stängda. Remake lösningsmedelsblandning för TLC kammare om mängden lösningsmedel i kammaren minskar särskilt.
- När plattorna är torra, visualisera banden i synligt eller UV-ljus, och beskriva banden med en penna. En avläsningskammare med en portabel UV-lampa är praktiskt, särskilt om lampan kan detektera föreningar på både 254 nm (kortvågigt UV) och 365 nm (kortvågigt UV).
Anmärkning: Vid denna punkt eller efter nästa steg, kan plattorna vara inslagna i plastfolie, täckt med folie och lagrades vid -20 ° C. Maximal lagringstid beroende på förening stabilitet. Eftersom kisel är inte neutral, kan vissa föreningar försämra samtidigt på TLC-plattan. - Fotografera eller rita plattor.
- Använd en gel photodocumentation systemet om man utrustad med overhead UV och / eller synligt ljus är tillgänglig.
- Om ingen kommersiell photodocumentation systemet finns, fotografera plattor inne i en låda fodrad med mörkt papper eller tyg, with en kamera inställd på ett stativ och en bärbar UV-ljus fäst vid en ring står 17. När du fotograferar plattor som inte har någon fluorescerande indikator, använd en blå ljusfilter över kameralinsen för att förbättra band utseende 17.
- För att hjälpa till att karakterisera banden, beräkna reduktionsfaktorn (Rf)-värden genom att mäta avstånd som föreningen och lösningsmedelsfronten, och dividera den förra med den senare (Figur 2A).
6. Bakteriell kultur och analys
- Förbered och ympa medier under anaeroba förhållanden. Kulturen som används i det här fallet var Clostridium sticklandii stam SR, som erhölls från kulturen samling av James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
- Se Flythe och Kagan 13 och listan material för en beskrivning av HAB medier.
- Odla kulturen till exponentiella eller stationära fasen. Använd steril anaerob techniques vid arbete med anaeroba mikroorganismer.
- Inokulera kultur (1% volym / volym) i smält agar efter temperaturen på agar (0,75% vikt / volym) har minskat till mindre än 60 ° C. Blanda försiktigt och omedelbart sätta i en anaerob kammare (95% CO2 -5% H2 atmosfär för HAB media) att hälla.
- Häll i 15 mm x 100 mm plast petriskålar och låt stelna.
- Med sax, klippa TLC-plattan i zoner som innehåller band (er) av intresse. Lägg band sidan nedåt på agarplattor, märkband på plattan uppbackning för att hålla reda på originalriktning på TLC-platta. Lay en oanvänd TLC remsan på en agarplatta som kontroll.
- Inkubera agarplattor, agar sidan nedåt, i den anaeroba kammaren (24 tim, 39 ° C).
7. Visualisering av bioanalyserades agarplattor
- Med pincett, ta bort band från agarplattor medan de är i den anaeroba kammaren.
- Lägg 1% (vikt / volym) tetrazolium rött, framställas i vatten, droppvis på ytorna av agarplattorna. Låt färgen utvecklas i åtminstone 20 minuter, eller tills styrplattan vänder helt röd, innan du tar bort från den anaeroba kammaren. De anaeroba bakterier kommer att börja tappa lönsamheten omedelbart efter avlägsnande från den anaeroba kammaren, men färgen är stabil i mer än 24 timmar.
- Fotografi enligt synligt ljus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa silika TLC-separationer av rödklöver (Trifolium pratense cv. Kenland) extrakt, som innehåller fenolföreningar, visas i figur 2. Separation av rödklöver extrakt i etylacetat-hexan (9:1, v / v), mer än 8,5 cm, resulterade i fem band, ett ofullständigt löst från ursprunget (Figur 2A). Emellertid visar figur 2B att ungefär dubbelt så många band uppenbarades när ett annat prov av rödklöver extrakt (från samma sort, men odlas i en separat tomt vid samma gård) separerades på ett längre avstånd (15 cm i stället för 8,5 cm) och med två på varandra följande utvecklingar i olika lösningsmedelssystem. Kromatogrammet i fig 2B utvecklades först i etylacetat-hexan (9:1, v / v), och därefter torka och separerades i etylacetat-metanol (78:22, vol / vol). Dessa resultat visar att både plåtstorlek och val av lösningsmedelssystem (eller en serie av lösningsmedel erystems) kan påverka antal föreningar separerades på ett kromatogram. I det här fallet, eluering och högpresterande vätskekromatografi (HPLC) av band från andra TLC separationer av samma extrakt bekräftade att föreningarna kvar vid eller nära ursprunget bestod främst av fenolföreningar (fenolsyror eller isoflavoner) konjugerade till polära delar såsom aminosyraderivat, socker eller äppelsyra. Däremot isoflavoner inte konjugerade till polära delar migrerade längre upp TLC-plattorna 10.
Resultaten av en bioanalys av TLC-plattan som visas i figur 2A med Clostridium sticklandii, en ruminal hyper ammoniakproducerande bakterien (HAB), visas i Figur 3. Lägga till en 1% (vikt / volym) vattenhaltig lösning av tetrazolium-rött till agarplattorna efter en 24 h inkubation resulterade i en klarröd färg när levande celler färgades. Inkubation av band 1 (biokanin A) och en del av band 2 (formononetin) på bakterier seeded agar resulterade i en väl definierad zon av inhibition (figur 3A). Emellertid inkubation av den återstående delen av bandet 2, tillsammans med band 3 och 4, inte hämmade bakterietillväxt (Figur 3B). Dessa resultat visade att biokanin A var hämmande för C. sticklandii tillväxt, men formononetin var inte.
Figur 2. Silica tunnskiktskromatografisk (TLC) separationer av extrakt av Trifolium pratense cv. Kenland, som utvecklats i (A) etylacetat-hexan (9:1, v / v), eller (B) att samma lösningsmedel följt av utveckling i etylacetat-metanol (78:22, v / v). Avståndet migrerat genom lösningsmedlet mellan origo (OR) och lösningsmedelsfronten (SF) indikeras närafästen mellan dessa två gränser. I figur 2B är det "orenhet front" (IF, placering av de orenheter som förflyttas upp plattan genom förtvättning i polära lösningsmedel) ses som ett mörkt band vid överkanten av plattan. Extrakt, framställda från 180 till 250 mg frystorkade rödklöver blad och stjälkar, löstes i metanol, och 10% av extraktet (A) eller 32% (B) satsades på kiseldioxidplattor. Standarder laddade var formononetin (f, 7,1 nmol), biokanin A (ba, 7,4 nmol), genistein (g, 9,8 nmol), och clovamide (Cl, figur 2B endast 8,7 nmol). Band inringat medan den visas med en handhållen UV-lampa vid 254 nm (kortvågigt UV) och 365 nm (kortvågigt UV). En digital kamera användes för att fotografera plattan under kortvågigt UV. Siffrorna till höger om klöverextrakt banden i figur 2A hänvisar till zonerna skära ut för biologiska testsystem. Reduktionsfaktorer (Rf, avstånd traveled med band / sträcka som SF) anges inom parentes efter bandnummer i figur 2A.
Figur 3. Resultat av TLC-plattan bioanalyser av (A)-bandet 1 och den ofullständigt löst övre delen av bandet 2 från TLC-plattan i fig 2A, och (B) band 2-4 från samma TLC-platta. Bands lades sidan nedåt på HAB inokulerats med Clostridium sticklandii och inkuberas anaerobt 24 tim vid 39 ° C. Vid slutet av denna inkubationsperiod ades banden avlägsnades och agarplattorna färgades med en vattenlösning av 1% (vikt / volym) tetrazolium röd och fotograferades under synligt ljus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en enkel metod för att separera ett extrakt i undergrupper av föreningar och analysera dessa underuppsättningar genom kontakt bioautografi. Metoden är ganska likt som användes av Chomnawang et al. 15 för att screena för växtmetaboliter hämmande för gonorré bakterier. Den typ av bioautografi används till skärmen för antimikrobiella ämnen från växter beror på många faktorer, bland annat testmikroorganismen, laboratoriet setup, och preferenser för den person (er) som utför bioassay. Kontakta bioautografi, den metod som används i denna studie, har kritiserats för att, beroende på förmågan hos en förening att diffundera in ympade medier 12. Hämningszoner över föreningar vid låga koncentrationer, eller med liten förmåga att diffundera in media, kanske inte upptäckas om tillväxten sker i agar nedanför diffusat. Dessutom kan en zon av hämning som skapas av ett band utbredning utanför bandets initialagränser, vilket möjligen maskera inhibitorzonerna skapats av grannföreningar 14. Dock är kontakt bioautografi en enkel metod att använda, och förmågan att stapla Petri plattor minimerar mängden utrymme som behövs. Dessutom om TLC band på agar eliminerar risken för bandet upplösning och spridning, som kan inträffa när en TLC-platta överdras med ympade agar eller sprayas med testmikroorganismen.
Att få information från någon av ovanstående typer av bioautografi beror på de kromatografiska förhållanden, prov mikroorganism koncentration och kultur / inkubationsbetingelser. Kromatografisk upplösning av antimikrobiella band inte är nödvändig, men känsligheten kan vara större för en väl löst band 6. Band kan separeras genom utveckling på längre plåtar eller i flera lösningsmedelssystem i en dimension (figur 2B), eller i två dimensioner genom att vrida en TLC-platta 90 grader före utvecklingi ett andra lösningsmedel 16,19. Polära föreningar kan vara svårt att skilja på kiseldioxid utan att använda lösningsmedelsblandningar, som innehåller syror eller baser. Dessa kan vara dödliga för testmikroorganism 12, även om användningen av små mängder av syror har rapporterats 14,15. Alternativa lösningsmedelssystem kan innehålla vatten eller metanol som komponenter 20,21. Polära föreningar kan även lösas på olika typer av TLC-plattor, såsom plattor belagda med C-18 adsorbent eller mikrokristallin cellulosa. Dock kan tillväxten 12 eller känslighet för visualisering medlet 14 påverkas negativt på en del av dessa adsorbenter.
Många olika kombinationer av prov mikroorganism och medier kan användas för bioautografi. Dock måste flera faktorer beaktas vid val mikroorganism och media. Medierna bör testas för att fastställa att det inte finns några komponenter som minskar tetrazolium salt och orsakar en icke-biologisk färgförändring. Ägarn bör också vara tillräckligt lätt i färgen för att åstadkomma kontrast mellan de färgade cellerna och ofärgade hämningszoner. En mikroorganism som endast kan växa på ytan av agar kan avlägsnas tillsammans med TLC-band eller tvättas bort under färgningen. Dessutom kommer valet av mikroorganismen / medel kombination som minimerar gasproduktionen minskar bubblor i agar. Rumen HAB växa i en karbonat-buffrad, kolhydratfritt medium med en blandning av aminosyror eller peptider såsom tillväxtsubstrat. Agarplattorna är ljus guld och transparent. När C. sticklandii odlas i mediet, de flesta av de produkter som är lösliga (flyktiga fettsyror, ammoniak). Mycket lite gas produceras, som resulterar i en slät agarplatta utan några bubblor.
Denna bioassay har ett par av potentiella tillämpningar. Storleken på inhibitionszonen kan användas som en grov uppskattning avmängden av den inhiberande föreningen, eftersom radien för den hämmande zonen är proportionell mot logaritmen för den mängd av föreningen som orsakar inhibering 17,22. Den kanske vanligaste användningen av TLC-plattan bioassays är att begränsa de möjliga antimikrobiella föreningar i ett växtextrakt. Efter inhibitorzonerna identifieras genom en bioanalys, kan motsvarande regioner på en dubblett TLC-plattan elueras med ett lösningsmedel, såsom metanol eller etylacetat, och analyserades med HPLC med UV-spektroskopi detektering för att börja karakterisera bioaktiva föreningar 10,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Omnämnandet av firmanamn eller kommersiella produkter i artikeln är endast i syfte att ge specifik information och innebär inte någon rekommendation av USDA. Författarna förklarar ingen konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar den sena Dr Norm Taylor, Dept Plant and Soil Science vid University of Kentucky, för att tillåta oss att använda prover från hans rödklöver tomter för denna studie. Projektet har finansierats av Förenta staternas Department of Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm. Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background. Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Adsorbents other than silica may be needed. Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used. |
| Sharp, heavy-duty scissors | any sewing supply company | similar to Fiskars 175800-1002 | For cutting TLC plates. A paper cutter with a sharp blade can be used as well. Do not inhale silica dust. |
| Drying oven at 100 °C (mechanical convection) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC chamber | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative sources: Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 cm x 10 cm). Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors). |
| 50 µl Syringe with flat needle tip | Hamilton | 80965 | For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µl. Alternative sources are equivalent. |
| Micropipettes | Drummond | 2-000-001 | For loading small amounts of standards or samples. Alternative sources: VWR. Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch. |
| Filter paper (#1 grade) | Whatman | 1001 917 | Serves as a chamber wick. Other grades of filter paper are OK. This size can be trimmed for the chambers holding 20 cm x 20 cm plates. |
| Beaker tongs | Fisher Scientific | 15-186 | For putting plates in and out of a large TLC chamber. Alternate sources: VWR |
| Flat-edge forceps | Fisher Scientific | 10-275 | For putting plates in and out of a small chamber. Alternate sources: VWR |
| Small portable UV lamp with 4 W or 6 W bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here. Alternate sources: Spectronics Corporation. |
| Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp | Kodak | Gel Logic 200 | Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com). See protocol for homemade alternative. |
| Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl | Coy | 7150000 | This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay. A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium D-Pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoic Acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoic acid | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamine | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Iron sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinc sulfate · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganese chloride · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cobalt chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nickel chloride · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodium molybdate · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pancreatic digest of casein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodium carbonate · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesium sulfate · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calcium chloride · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cysteine HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodium chloride | Thermo Fisher | BP358 | |
References
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
- Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
- Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
- Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
- Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
- Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
- Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
- Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
- Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
- Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
- Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
- Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
- Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
- Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
- Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
- Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
- Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
- Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
- Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).
