Summary
Heterolog uttrykk og rensing av cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) er betydelige utfordringer og begrensende faktorer i utviklingen av medisinsk behandling for cystisk fibrose. Denne protokollen beskriver to fremgangsmåter for isolering av milligram mengder av CFTR egnet for funksjonelle og strukturelle studier.
Abstract
Defekter i cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) protein forårsaker cystisk fibrose (CF), en autosomal recessiv sykdom som i dag begrenser den gjennomsnittlige levealder for lider å <40 år. Utviklingen av nye stoffet molekyler å gjenopprette aktiviteten til CFTR er et viktig mål i behandlingen CF, og isolering av funksjonelt aktive CFTR er et nyttig skritt mot å oppnå dette målet.
Vi beskriver to fremgangsmåter for rensing av CFTR fra et eukaryot heterologt ekspresjonssystem, S. cerevisiae. Som prokaryote systemer, S. cerevisiae kan raskt vokst i laboratoriet til lave kostnader, men kan også trafikk og posttranslationally modifisere store membran proteiner. Valget av vaskemidler for solubilisering og rensing er et kritisk trinn i rensingen av en hvilken som helst membran-protein. Etter å ha undersøkt for løseligheten av CFTR i flere vaskemidler, er det valgt to contrasting vaskemidler for anvendelse ved rensing som gjør at det endelige CFTR forberedelse til å være tilpasset til de etterfølgende planlagte eksperimenter.
I denne fremgangsmåten, gir vi sammenligning av rensingen av CFTR i dodecyl-β-D-maltoside (DDM) og 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (LPG-14). Protein ble renset i DDM ved denne metode viser ATPase-aktivitet i funksjonelle analyser. Protein ble renset i LPG-14 ser med høy renhet og utbytte, kan anvendes for å studere post-translasjonelle modifikasjoner, og kan brukes til konstruksjonsmetoder som for eksempel små vinkelrøntgenspredning og elektronmikroskopi. Men det viser betydelig lavere ATPase aktivitet.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er den vanligste genetiske lidelse i Europa og Nord-Amerika med en forekomst på ca 1 i 2500 levendefødte. CF oppstår når mutasjoner i cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) protein forårsake tap av dens funksjon ved plasmamembranen av epitelceller en. Den mest alvorlige konsekvensen av denne defekten er irreversibel lungeskade, som forkorter forventet levealder for lider å <40 år 2,3.
CFTR er en ATP-bindende kassett (ABC) transporter som har utviklet seg til å bli en ionekanal 1,4. Til tross for sin ganske forandret funksjon i plasma membran av celler, har den beholdt betydelige sekvens homologi med andre ABC transportører. Forbløffende nok, de spesialiserte deler av CFTR (dvs. regulerings regionen og dens N-og C-termini) dele ingen signifikant sekvenslikhet med andre metazoan ABC transportører, dermed er det ingen ledetråder til the opprinnelsen av disse sekvensene i CFTR. På basis av dens primære struktur skjer CFTR klassifisert som en C-familiemedlem på ABC-transportør-familien, men det er ikke noe bevis for en gjenværende funksjonell kopling til dette sub-familien. Det har vært noen rapporter om glutation transport aktivitet for CFTR 5-7, noe som ville være i samsvar med de rollene som andre C-familiemedlemmer 8,9, selv om andre rapporter tyder på at redusert glutation kan hemme CFTR ATPase aktivitet, snarere enn å vise det substrat-indusert stimulering som preger ABC transportører 10. Måling av ion ledningsevne er tilstrekkelig følsom til å tillate kanal aktivitet av enkelt CFTR-molekyler som skal studeres og en CFTR kanalegenskaper har vært overvåket som en funksjon av tid, temperatur, konsentrasjon ATP, membranpotensial og fosforylering tilstand, så vel som i nærvær av en mengde små molekyl-inhibitorer, potentiators og modifiseringsmidler. Dissestudier har også lagt betydelig til vår kunnskap om hvordan ABC transportører fungere. Ikke desto mindre, har ekspresjonen av CFTR i betydelige mengder og dets påfølgende rensing vist seg å være en særlig utfordring og suksess har vært begrenset til noen få laboratorier 10-13.
Behovet for å utvikle mer effektive legemidler er pressing, men denne prosess har blitt hindret av mangel på renset CFTR for screening av små molekyler. Løse CFTR uttrykk og rensing problemet ville muliggjøre høy gjennomstrømming narkotika screening sikte på å korrigere den primære defekten i CF og vil også åpne opp en rute for høyoppløselige strukturelle studier for å informere rasjonell drug design. Dessuten, selv relativt enkle biokjemiske egenskaper av proteinet, slik som funksjonell oligomere tilstand, interagerende proteiner og ATPase-aktivitet forbli dårlig karakterisert. Vi har tidligere rapportert en protokoll for storskala uttrykk for GFP-og Hans-merket murine CFTRi S. cerevisiae 14 og nå videre beskrive protokoller for rensing av CFTR. Vi har brukt disse metodene for å rense fem orthologues av CFTR, og presentere data for rensing av kylling CFTR som et eksempel. Valget av vaskemidler for solubilisering og rensing er et kritisk trinn i rensingen av en hvilken som helst membran-protein. Etter å ha undersøkt for løseligheten av CFTR i flere vaskemidler, er det valgt to kontrasterende vaskemidler for anvendelse ved rensing. Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) er et ikke-ionisk vaskemiddel som har blitt brukt i stor utstrekning for både strukturelle og funksjonelle studier av membranproteiner 15-21. Den ioniske vaskemiddel 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (LPG-14) er svært effektiv i oppløseliggjøring av CFTR, og har tidligere vært benyttet i rensingen av funksjonelle membranproteiner 10, 22,23, inkludert rensing av CFTR fra S. cerevisiae 24. </ P>
Protocol
En. Utarbeidelse av buffere
- For å gjøre 100x lager av proteasehemmer (PI) cocktail oppløse 96 mg AEBSF, 3,5 mg kymostatin, 10 mg E64, 16,5 mg leupeptin, 16,5 mg pepstatin, 348 mg PMSF, og 4 mg Bestatin i 20 ml DMSO. Gjør en ml porsjoner og oppbevar ved -20 ° C. For å gjøre en 100x lager av benzamidin, oppløse 720 mg i 20 ml ultrarent vann (DDH 2 O) og oppbevar i en ml deler ved -20 ° C. Denne mengde er tilstrekkelig for en rensing. I alle buffere, er PI og benzamidin aksjer brukt ved en 1:100 fortynning.
- Forbered 'mPIB' (0,3 M Tris pH 8, 0,3 M sukrose, 2 mM DTT) og "CFTR" (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) glycerol, 1 mM DTT) buffere og kulden til 4 ° C . Før bruk, legge 1:100 av protease inhibitor cocktail og 1:100 benzamidin i henhold til volumet av mPIB brukt til cellepelleten suspenderes (f.eks bruke 3,5 ml PI og 3,5 ml benzamidin i et totalvolum på 350 ml mPIB).
- Forbered solubilization buffere. Lyso-fosfatidyl-glycerol-14 (LPG) solubilisering buffer (50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, proteaseinhibitorer (PI) og 4% (w / v) LPG) og dodecyl maltoside (DDM) oppløselighet buffer (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) glycerol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, proteaseinhibitorer, 4% (w / v) DDM). Buffer kan sonikert i et sonicator-bad (35 V, 40 kHz) for å hjelpe til med spredning av vaskemiddelet, men unngå virvling av blandingen, fordi dette skaper bobler. Chill til 4 ° C før bruk.
- CFTR rensing buffer for LPG rensing er 50 mM Tris, 10% (v / v) glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) LPG-14 og proteaseinhibitorer. Forbered 350 ml av denne buffer og 150 ml av den samme buffer pluss 1 M imidazol. Juster pH i begge buffere til åtte.
- Bufferen for rensing i DDM består av 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) glycerol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) DDM. Forbered 350 ml av denne buffer og 150 ml av den samme buffer pluss 1 M imidazole. Juster pH i begge buffere til åtte.
- For gelpermeasjonskromatografi (GPC) buffer inneholdende LPG, klar 50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) glycerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,05% (w / v) LPG-14. For GPC ved hjelp av DDM forberede en buffer av 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) glycerol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w / v) DDM. Alle buffere og DDH 2 O brukes på GPC kolonnen skal bli filtrert (0,2 um filter) og avgasset før bruk.
- SDS-PAGE-prøvebuffer (2x arbeidskonsentrasjon): 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 5% (v / v) glyserol, 5 mM EDTA, 0,02% (w / v) bromfenol blå. Gjør 700 ul delprøver og oppbevar ved -20 ° C. Før bruk tilsettes 200 pl av 20% (w / v) natriumdodecylsulfat (SDS) og 100 pl av ferskt 0,5 M DTT. Inkuber i minst 10 minutter med prøven ved romtemperatur før lasting på gel. Ikke varm; dette vil denaturere GFP og kan føre CFTR å aggregere.
- For å gjøre lipid aksjer for tilberedning, oppløse en 4:01 (w / w) blanding av E. coli lipider end (2:1 v / v) kolesterol i kloroform og metanol, og tørr i et hetteglass i henhold N 2 gass i 2 timer for å danne en lipid film. Til GPC-buffer (uten NaCl) til en lipid-konsentrasjon på 40 mg / ml og bruk gjentas virvling og sonikering (35 W, 40 kHz) for å klargjøre oppløsningen.
- For ATPase assay, forberede 100x bestander av ATPase-inhibitorer ved oppløsning SCH28080 til 1 mM i DMSO, NaSCN til 1 M i DDH 2 O og oligomycin til 2,5 mM i 100% (v / v) etanol. Oppbevares i alikvoter ved -20 ° C. Lag 100 ml ATPase-buffer med 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NH4Cl, 5 mM MgSO 4, og 0,02% (w / v) NaN 3. Det kan lagres ved romtemperatur og brukt i flere analyser. Forbered en 5 mM ATP lager umiddelbart før bruk og holde på is. (NB Bruk Na 2-ATP til å hindre overdreven bakgrunnssignal fra fosfat i analysen). Klargjør SDS stop-løsning (12% (w / v) SDS i DDH 2 O).
- For Chifflet deteksjon forberede buffer A (3% (w/ V) askorbat, 0,5% (vekt / volum) ammonium-molybdat, 0,5 M HCl) rett før bruk, og buffer B (2% (vekt / volum) natriumcitrat, 2% (w / v) natrium-meta-arsenitt, 2% (v / v) eddiksyre).
2. Isolering av gjær Mikrosomer
- S. cerevisiae uttrykker kylling CFTR dyrkes som beskrevet i O'Ryan et al. (2012) 14. Oppbevar materiale fra en 20 l fermentering i to alikvoter ved -80 ° C i opptil 6 måneder.
- Tine en delmengde av celler raskt og resuspender i 3 ml kjølt mPIB per gram av celler.
- Bryt-celler i en kulemølle ved å bruke glasskuler med diameter 425 til 600 mikrometer. Bruk fem 1 min perioder av celleoppbrytning adskilt med en min hvileperioder. (De hvileperioder er viktig for å sikre at cellene ikke er oppvarmet i avbrudd.)
- Overvåk celleoppbrytning ved sentrifugering av en 1 ml prøve av cellelysat fra kulemølle. Sentrifuger (12 000 xg, 4 ° C, 5 min) i en benk topp centrifuge. Fortynn supernatanten til 1:50 med mPIB i en kyvette og måle A 380. Dersom A 380> 0,1, eller har sluttet å øke til tross for flere gjentatte perle-juling sykluser, fortsette til neste trinn. Hvis ikke, gjenta 02.03 til 02.04.
- Sentrifuger den totale cellelysat (12.000 x g, 4 ° C, 20 min). Ta vare på supernatanten. Kast pellet (inneholder ubrutte celler og mitokondrier), men hvis det er noen tvil om effektiviteten av celle brudd (se 2.4), deretter beholde pellet også.
- Sentrifuger supernatanten fra det tidligere trinn (200 000 x g, 4 ° C, 1,5 timer). Kast supernatanten og resuspender pelleterte mikrosomale membraner i CFTR-buffer. Dersom mikrosomer er beregnet for rensing ved hjelp av DDM, supplere CFTR buffer med 1 M NaCl.
- Gjenta sentrifugeringen av det resuspenderte membran fraksjon (100000 x g, 4 ° C, 1 time) og kast supernatant.
- Suspender pelleterte mikrosomer iet minimum volum av CFTR-buffer (endelig volum 5-15 ml, total mikrosomale protein 70-200 mg). En Bradford-analysen kan anvendes for å bestemme den totale konsentrasjon av mikrosomale protein 25. I tillegg fluorescensemisjonen spektrum av membraner skal måles (eksitasjon = 485 nm, emisjon = 500 til 600 nm), og bør ha en distinkt GFP fluorescens-topp (maksimum ved 512 nm). CFTR kan spesifikt påvises på en SDS-PAGE gel, skannet i GFP fluorescens betingelser (figur 1).
- Flash-fryse resuspenderte mikrosomer ved stuper inn i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C, eller fortsette til trinn tre.
Tre. Solubilization av Mikrosomer
- Hvis frosset, tine mikrosomer umiddelbart før bruk i et vannbad innstilt på 10 ° C.
- For oppløseliggjøring av membraner, fortynnes mikrosomer med et like stort volum av det relevante solubilisering buffer (trinn 1.3) til å gi en sluttkonsentrasjon på vaskemiddel2% (vekt / volum) og et mikrosomalt protein-konsentrasjon 5 mg / ml. Inkuber denne blanding i 1 time ved 4 ° C med omrøring (tube rotator). Beholde 200 mL for analyse.
- Sentrifuger blandingen (100 000 x g, 4 ° C, 45 min). Fjern supernatanten inneholdende det oppløste membranproteiner, passerer den gjennom et 0,45 um sprøytefilter og oppbevares på is. Måle fluorescensen av supernatanten (som i trinn 2.8).
- Resuspender uløselige fraksjonen i 1% (w / v) SDS-løsning til et volum som tilsvarer den oppløselige fraksjon. Måle fluorescens i denne fraksjonen og beholde en alikvot av 50 ul for SDS-PAGE-analyse.
4. Nikkel-affinitet Rensing av CFTR
- Link to 5 ml nikkel sepharosekolonner i serien. Vask med 2 kolonnevolumer (CV) 20% (v / v) etanol, etterfulgt av 2 CV DDH 2 O, og deretter vaskes kolonnen med 2 CV for solubilisering buffer (trinn 1,4 til 1,5), inneholdende 1 M imidazol. Gjenta med 2 CV for solubilization buffer mangler imidazol.
- Legg imidazol til en endelig konsentrasjon på 5 mM for det oppløste materialet (trinn 2.8) og manuelt laste materiale inn i en kolonne eller i en prøvesløyfe ved bruk av en automatisert væskekromatografi-enheten.
- Legg den oppløste materialet på kolonnen ved en strømningshastighet på 0,5 ml / min, og vask med 2 CV imidazol-mangler buffer ved samme strømningshastighet for å fjerne ubundet materiale. Samle fraksjoner i 50 ml Falcon-rør.
- For det første vaske, bruker 3 CV for rensing buffer med 40 mM imidazol ved en strømningshastighet på 1 ml / min. Samle 2 ml fraksjoner.
- For det andre vask, bruker tre CV for rensing buffer med 100 mM imidazol. Samle 2 ml fraksjoner.
- Elute CFTR fra HisTrap kolonne med tre CV for rensing buffer med 400 mM imidazol. Samle 2 ml fraksjoner.
- Monitor fluorescens i Eluert fraksjoner (trinn 2,8).
- Beholde alikvoter av toppfraksjonene for SDS-PAGE-analyse. Flash fryse rester peak fraction prøver og oppbevar ved -80 ° C, eller fortsette til neste rensetrinn.
5. Gelpermeasjonskromatografi (GPC) Rensing av CFTR
- Ekvilibrer kolonnen (Superose 6 10/300 GL) med 1,2 CV DDH 2 O, etterfulgt av 1,2 CV GPC buffer.
- Under trinn 5.1, konsentrere de Ni-affinitets-rensede fraksjoner med høyest GFP fluorescens ved hjelp av en 100 000 MWCO sentrifuge filter ved 4 ° C. Hvis rensende i DDM, unngå konsentrasjon av prøven over et protein konsentrasjon på 0,3 mg / ml protein da dette vil føre til betydelig prøvetap. Fjern retentatet fra konsentratoren og sentrifuger ved 100 000 x g i 30 min ved 4 ° C for å pelletere store partikler.
- Injiser denne prøven på kolonnen og elueres med en isokratisk gradient på 1,2 CV GPC buffer. Samle 0,5 ml fraksjoner.
- Mål GFP fluorescens som i avsnitt 2.8 for å identifisere de fraksjoner som inneholder CFTR. Beholde et lite volum (f.eks </ Em> 50 ul) av hver for analyse ved SDS-PAGE.
- Fryse-fraksjoner i flytende nitrogen og lagres ved -80 ° C.
6. Tilberedning av CFTR
- Legg lipider (trinn 1.8) til det rensede CFTR på lipid-til-protein-forhold 100:1 (vekt / vekt) og inkuber ved 4 ° C i 1 time. På samme måte sette opp en lipid-bare styring, ved å erstatte det rensede protein med samme volum av GPC buffer.
- Fjern vaskemiddel fra protein / lipid-blandingen ved bruk av hydrofobe adsorpsjonsmiddel-perler. Vask adsorbentmate perler i 5 CV DDH 2 O, 5 CV 70% (v / v) etanol, 5 CV DDH 2 O, og 5 CV GPC buffer mangler vaskemiddel. Tilsett 200 mg vaskede adsorberende perler per ml av renset protein, og inkuber ved 4 ° C over natten med forsiktig omrøring.
- Samle tilberedning prøven fra adsorpsjonsmidlet perler inn i et nytt rør ved hjelp av en tynn-ended pipettespissen.
7. Måling av ATPase aktivitet
- Bestem frekvensen av CFTR-spesifikk ATPase-aktivitet ved hjelp av en modifisert Chifflet assay 26,27 i en 96-brønn plate-format. Med natriumfosfat-stamløsning (0,65 mM) forberede 0-20 nmol fosfat i et sluttvolum på 50 pl som standarder. Bruke en 1:1 blanding av CFTR-buffer og ATPase-buffer for å fortynne fosfat lager.
- Inkuber både rekonstituerte CFTR og tomme liposomer med 1:100 (v / v) ATPase-hemmere (Trinn 1.9) på is i 10 min. Bruk minst 5 ug rekonstituert CFTR.
- Legg ATP (trinn 1.9) til en sluttkonsentrasjon på 2 mM og inkuberes ved 25 ° C i 1 time. Stopp reaksjonen ved å tilsette 40 ul av 10% (w / v) SDS (trinn 1.9) til hver brønn (med standardene).
- Tilsett 100 pl buffer A (trinn 1.10) og inkuberes i 10 min. Tilsett 100 pl buffer B (1,10) til hver brønn og mål absorbansen ved en bølgelengde på 800 nm i en 96-brønners plate-kompatibel UV / Vis spektrofotometer.
- Konverter absorbans ved 800 nm i en mengde av frigjort fosfat ved hjelp avfosfat standarder. Beregn hastighet på ATP-hydrolyse etter at bakgrunnen er trukket fra signalet (liposom-bare brønner).
- For ikke-rekonstituert CFTR følge den samme protokollen med CFTR buffer for bakgrunnen avlesninger.
Representative Results
Den protokoll som er beskrevet ovenfor, er et effektivt middel for å isolere CFTR-anriket mikrosomer, med nesten fullstendig gjenvinning av CFTR i løpet av cellebrudd og klargjøring av rå-mikrosomer (figur 1). Andre celle brudd metoder kan også anvendes effektivt. Vi har benyttet en French trykkcelle og andre high-pressure/cavitation heter (også i kombinasjon med innvirkning mot en rubin target) med lik effektivitet. For enkelhets og lav opprinnelige kostnaden for utstyret, finner vi perlen-juling metoden best.
Ved hjelp av LPG til å oppløseliggjøre og rense CFTR ga 80 ug protein / l kultur på> 90% renhet (fig. 2). Det høye utbyttet var på grunn av effektiv oppløsning av CFTR av LPG (sammenlign figur 2b, baner 2 og 4). I tillegg er effektiv og sterk binding til kolonnen resulterte i et minimalt tap av CFTR i den ubundne fraksjon, og fraværet av CFTR i vaskefraksjonene (figur 2, felt 3, 5, og6). Det eluerte protein hadde en renhet på> 90%, beregnet av Coomassie-fargede SDS-PAGE-geler og ved hjelp av densitometry av CFTR og forurensninger band. Gelpermeasjonskromatografi (GPC) atskilt LPG-renset CFTR fra lav-molekylvekt forurensninger (figur 4, nedre panel).
Protokollen for CFTR-rensing ved hjelp av DDM gir renhet på ca 60% og et utbytte på omtrent 50 pg / l (figur 3). Elektronmikroskopi (EM) for negativt farget fraksjoner fra GPC eluerte ved omtrent 10 ml (figur 4) viste at DDM-renset CFTR inneholder aggregater av 20 til 30 nm i diameter, så vel som mindre partikler på 10 nm diameter (data ikke vist). Det er mulig at de små aggregater kan reversibelt assosierer og dissosierer som ultrafiltrering med en MDA cut-off filter mislyktes i å fjerne de EM-påviselige aggregater. LPG-renset materialet ikke adsorberes til en glød-utladet rutenett, dermed ble studert av cryo-EM av ufargede fraksjoner. Dette visteen meget homogen partikkel-populasjon i en relativt liten størrelse (6-8 nm i diameter, data ikke vist).
Til slutt ble ATPase-aktivitet av de rensede proteiner målt (figur 5). Som et medlem av ABC-protein-familien, har CFTR to nukleotid-bindende domener (NBDs) som kan binde og / eller hydrolyse av ATP. Dataene indikerer at det rensede protein var ikke i stand til å hydrolysere ATP i LPG-oppløseliggjort tilstand, og viste svake ATPase-aktivitet i nærvær av DDM (figur 5, ufylte søyler). Etter tilsetningen av lipider, og fjerning av detergent, ATPase-aktivitet var 4 ganger høyere for prøver som var blitt renset i DDM (13 nmol ATP / min / mg protein). Tilsetningen av fett og fjerning av LPG på lignende måte gjenopprettet aktiviteten til CFTR som var blitt isolert ved hjelp av LPG, men med en endelig lavere hastighet (1,5 nmol ATP / min / mg protein) enn DDM-renset og rekonstituert materiale.
Figur 1. Overvåkings nivåer av kylling CFTR i cellelysat (CL), supernatanter (S) og pellet (P) i løpet av forskjellige sentrifugeringsfremgangsmåten som brukes for micro isolering og vasking. SDS-PAGE-geler ble visualisert ved hjelp av in-gel fluorescensen av GFP tag. Supernatanten etter cellebrudd og sentrifugering ved 14 000 xg inneholder praktisk talt all CFTR (inkludert nedbrytningsprodukter). Ultrasentrifugering ved 200.000 xg sedimenter hele den fulle lengde CFTR later noen fragmenter i supernatanten. Ultrasentrifugering ved 100.000 xg i salt vasket mikrosomer pellets nesten hele CFTR med fjerning av noen ytterligere fragmenter.
Figur 2. Rensing av kylling CFTR i LPG ved immobilisert metallion affinitets-kromatografi. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie farging (øvre panel) og fluorescens-deteksjon av GFP tag (nedre panel). Spor: (1)-mikro. (2) LPG-oppløseliggjøres mikrosomer. (3) Ubundet materiale. (4) Uløselig materiale. (5) og (6) 40 og 100 mM imidazol vasker. (7) Material eluert med 400 mM imidazol.
Fig. 3. Rensing av kylling CFTR i DDM ved immobilisert metallion affinitets-kromatografi. Fraksjoner ble analysert ved SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie farging. Den venstre panel viser fraksjoner før eluering. Flere påfølgende elueringsfraksjonene vises i høyre panel med CFTR idicated av pilen. Senere fraksjoner anriket med en 40 kDa kontaminant, som har blitt identifisert ved massespektrometri som ribosomalt protein L3.
Fig. 4. Rensing av kylling CFTR ved gelpermeasjonskromatografi. CFTR renset ved hjelp av Ni-affinitetskromatografi ble konsentrert og påført på en GPC-kolonnen. Elueringsprofilen for CFTR (øvre panel) ble renset i buffer inneholdende LPG-14 (heltrukket linje), eller DDM (stiplet linje) er overlappet. SDS-PAGE (nedre panel) avslørte at CFTR elueres mellom 8 og 11 ml.
Figur 5. ATPase activity av renset kylling CFTR fraksjoner. Protein renset i DDM-eller LPG ble målt ved å bruke en modifisert Chifflet assay 26 i nærvær av en cocktail av ATPase-inhibitorer for å eliminere eventuell bakgrunns ATPase-aktivitet fra F-, P-og V-type ATPaser (ufylte barer ). Frekvensen av ATP hydrolyse ble også målt etter fjerning vaskemiddel og lipid tillegg (fylt barer). Plottet viser gjennomsnittet og standardavvik (n = 3). Forskjeller mellom gjennomsnittsverdiene for ATPase aktivitet i nærvær og fravær av lipid, og forskjellen mellom aktivitet i DDM og LPG er vesentlige for p <0,05.
Discussion
Vi har tidligere beskrevet en fremgangsmåte for overekspresjon av murine CFTR 14.. Etter offentliggjøringen av at protokollen, har vi uttrykt og renset flere forskjellige orthologs av CFTR bruker samme system. Alle orthologs testet så langt renset godt i LPG vaskemiddel, mens DDM rensing viste mer variasjon på tvers av ulike orthologs (data ikke vist). Denne fleksibiliteten illustrerer styrken av gjær-metoden: det er mulig å screene mange konstruksjoner med relative hurtighet for å velge en for et bestemt formål.
Vasking gjær mikrosomer med buffer inneholdende 1 M NaCl før solubilisering med DDM resulterer i en renere micro fremstilling og reduserer forurensninger på senere stadier. Dette trinnet er unødvendig i LPG-protokoll som den endelige CFTR prøven er> 90% ren, uten at micro vask. Videre rensing i DDM krever flere endringer til buffere for solubilization ennd rensing, nemlig tilsetningen av ekstra glycerol og salt. Sammen utgjør disse tilsetninger betydelig økt binding av DDM-løseliggjort protein til kolonnen.
Den DDM rensing metodikk har rom for forbedring, spesielt for fjerning av en 40 kDa stor forurensning som, bedømt ved massespektrometri, er på grunn av gjær ribosomal-underenheten L3, som synes å ha en iboende affinitet for nikkel harpiks. Det finnes ingen åpenbar polyHis sekvens i L3 protein, men undersøkelse av sin 3D struktur når bundet til ribosomet (PDB = 1FFK) viser at den brettede L3 subenhet har et potensial polyHis klynge. At dette båndet er mindre problematisk i LPG-rensede materiale kan være på grunn av det hardere LPG vaskemiddel.
Selv om rensing i DDM ser ut til å være dårligere enn den i LPG, kan mildere vaskemidler som DDM være mer forenlig med funksjonelle og strukturelle analyser, og har allerede blitt brukt i flere røntgen crystallfisk metode studier av membran proteiner 15-21. Videre viser våre resultater indikerte at bruk av LPG fører til tap av ATPase-funksjonen i CFTR relativt til rensing i DDM. Derfor vil vi anbefale LPG-baserte rensing protokoll for generering av CFTR der renhet er viktig, for eksempel i anvendelser slik som karakterisering av posttranslasjonelle modifiseringer, eller i produksjon av antistoffer, LPG-basert protokoll vil velges . På den annen side i anvendelser hvor aktiviteten og fullt opprinnelige tilstand av proteinet er avgjørende, ville man foreslår derfor DDM-basert protokoll som et bedre alternativ.
For å konkludere, beskriver denne protokollen en reproduserbar metode for isolering av CFTR i zwitterionisk vaskemiddel LPG-14 eller ikke-ionisk detergent DDM. Som sådan er det indikerer et større spekter av rensebetingelser for CFTR enn tidligere har blitt rapportert 10-13. I tillegg milligram mengder av renset CFTR kan blioppnås ved hjelp av disse fremgangsmåter når det kombineres med et høyt volum gjærvekst-system slik som en 20 l fermentor og en høy kapasitet for cellehøstesystem som for eksempel en 6 L lav hastighet sentrifugerotor. Den oppnådde CFTR har en spaltbar GFP signal som tillater enkel overvåking av proteinet i en rekke biokjemiske og biofysiske assays.
Reagenset beskrevet i dette manuskriptet (kylling CFTR holdig plasmid eller frosne gjærceller) kan fås gjennom Cystisk fibrose Foundation (USA).
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre motstridende interesser med hensyn til dette arbeidet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av den amerikanske Cystisk fibrose Foundation (CFF) gjennom sin CFTR 3D Structure Consortium. TR ble finansiert av en britisk CF Trust studieplass, og NC ved en britisk BBSRC studieplass. Vi erkjenner våre kolleger i CFF CFTR 3D struktur konsortium for deres hjelp og råd, og for utformingen av kodonoptimalisert kylling CFTR sekvens og rense tags.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| 100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 | |
| 2 ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 | |
| 50 ml sterile Falcon tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| Gel imaging system | BioRad | 170-808 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| E. coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Fisher | 65017 | |
| HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 | |
| Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| SCH28080 | Sigma-Aldrich | S4443 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 | |
| Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 | |
| Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 | |
| Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 | |
| Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |
References
- Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel. Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).
- Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003. EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).
- O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D.
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245, 1059-1065 (1989).
- Kariya, C., et al. A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).
- Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung. Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).
- Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates. Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).
- Cole, S. P., et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science. 258, 1650-1654 (1992).
- Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters. Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).
- Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).
- O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. , (2012).
- Oldham, M. L., Chen, J. Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).
- Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter. Science. 315, 373-377 (2007).
- Dawson, R. J. P., Locher, K. P. Structure of a bacterial multidrug ABC transporter. Nature. 443, 180-185 (2006).
- Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter. Science. 321, 246-250 (2008).
- Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).
- Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation. Science. 321, 250-253 (2008).
- Aller, S. G., et al. Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding. Science. 323, 1718-1722 (2009).
- Koehler, J., et al. Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids. Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).
- Tian, C., et al. Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome. Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases. Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).
- Rothnie, A., et al. The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence. Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).
