Summary
Vi præsenterer i denne artikel en ny strækning platform, der kan anvendes til at undersøge en enkelt celle-responser til komplekse anisotrope biaksial mekanisk deformation og kvantificere de mekaniske egenskaber af biologisk væv.
Abstract
Værktøjer, der tillader anvendelse af mekaniske kræfter til celler og væv, eller der kan kvantificere de mekaniske egenskaber af biologisk væv har bidraget markant til forståelsen af grundlæggende mechanobiology. Disse teknikker er blevet flittigt brugt til at demonstrere, hvordan opståen og udvikling af forskellige sygdomme er kraftigt påvirket af mekaniske signaler. Denne artikel præsenterer en multi-funktionel biaksial stretching (BAXS) platform, der kan enten mekanisk stimulere enkelte celler eller kvantificere den mekaniske stivhed af væv. Den BAXS platformen består af fire svingspole motorer, der kan styres uafhængigt af hinanden. Enkelte celler kan dyrkes på et fleksibelt substrat, der kan knyttes til motorerne tillader en at eksponere cellerne for komplekse, dynamiske og rumligt varierende stamme felter. Omvendt, ved at inkorporere en kraft vejecelle, kan man også måle de mekaniske egenskaber af primære væv, som de er udsat for deformationscykler.I begge tilfælde skal en ordentlig sæt klemmer være konstrueret og monteret på BAXS platform motorer med henblik på at fast holde det fleksible substrat eller væv af interesse. Den BAXS platformen kan monteres på et inverteret mikroskop til at udføre samtidig transmitteret lys og / eller fluorescensimagografi at undersøge strukturelle eller biokemiske respons af prøven under stretching eksperimenter. Denne artikel indeholder eksperimentelle detaljer af designet og brugen af BAXS platform og præsenterer resultater for enkelt celle og hele væv studier. Den BAXS platform blev anvendt til at måle deformationen af kerner i en enkelt mus myoblastceller reaktion på substratet belastning og til at måle stivheden af isolerede muse-aorta. Den BAXS platform er et alsidigt værktøj, der kan kombineres med forskellige optiske microscopies for at give nye mechanobiological indsigt i de sub-cellulære, cellulære og hele vævsniveauer.
Introduction
Den mekaniske mikromiljø spiller en vigtig rolle i mange celle funktioner såsom proliferation, migration og differentiering, som har en dybtgående indvirkning på udviklingen og homeostase af væv og også i sygdomme 1-6. Gennem årene har et væld af eksperimentelle værktøjer blevet brugt til mekanisk at stimulere celler eller væv og måle mekaniske egenskaber af biologisk væv med målet om at øge vores forståelse af grundlæggende mechanobiology og studere opståen og udvikling af sygdomme 6-17. Dog skal man ofte bygger på flere forskellige eksperimentelle enheder for at nå målene for en bestemt undersøgelse. Denne artikel præsenterer en enkelt, multi-funktionelle, biaksial stretching (BAXS) platform, der giver mulighed for studier, der undersøger den rolle, mekaniske egenskaber og mekaniske kræfter spille i biologi på sub-cellulære til hele væv længdeskalaer. Den BAXS platformen ikke kun giver mulighed for quantification af de mekaniske egenskaber af isolerede væv, men også letter evnen til at anvende enkle, komplekse og dynamiske stamme felter levende celler for at forstå deres svar på strækning der sker in vivo. Den BAXS platformen også opretholder kapacitet til at udføre levende celle mikroskopi under mekanisk prøvning og forstyrrelser på celler og væv.
Den BAXS platform er en specialbygget apparat, der kan bruges til at undersøge effekten af substrat deformation på celleniveau og udføre belastningstest på biologiske væv (figur 1a). En aluminium varmelegeme blev fremstillet til at rumme en standard 10 cm petriskål og opretholde nogen fysiologiske opløsninger ved 37 ° C med en temperaturregulator og Kapton varmeapparater (Figur 1B). Denne BAXS platform kan integreres på en omvendt fase kontrast og / eller fluorescens mikroskop og giver mulighed for samtidig billeddannelse (figur 1C).Kort fortalt BAXS platform består af fire lineære svingspole motorer, hvoraf de bevægelige dele er monteret på miniature lineær bevægelse kuglelejer orienteret langs to vinkelrette akser (figur 1D). En lineær positionering trin er monteret på hver af de fire motorer til at tillade lodret bevægelse af klemmemekanismen, der skal anvendes (fig. 1E). Positionen af hver motor overvåges af en optisk encoder med en opløsning på 500 nm (figur 1F). Alle fire motorer styres selvstændigt med en motion controller, der anvender optisk encoderfeedback at udføre motion kommandoer (Figur 1G). En LabVIEW interface giver fuld kontrol over størrelsen forskydning, hastighed og acceleration af hver motor for at frembringe helt tilpasselig, statisk og dynamisk, deformation af celler eller vævsprøver.
Den teknik, der anvendes til at fremkalde en deformation i celler opnås ved blot allowing celler til fast holde sig til en fleksibel og gennemsigtig substrat og derefter strække dette substrat ved hjælp af de fire motorer i BAXS platformen. Den BAXS platform giver mulighed for montering af enhver specialdesignede sæt klemmer til at fastgøre underlaget på spolen motorer. Til dette formål har vi udviklet et sæt af klemmer, som en fleksibel og transparent substrat, lavet af polydimethylsiloxan (PDMS), kan fastgøres (figur 2A-C og figur 3). Da klemmerne vil blive udsat for fysiologiske opløsninger blev alle dele fremstillet af rustfrit stål for at muliggøre sterilisering. Disse klemmer er blevet omhyggeligt designet til at bringe underlaget så tæt som muligt til mikroskopet til formål at forbedre billedkvaliteten samtidig minimere stress på substratet under strækning (figur 2D).
Det samme BAXS platformen kan også anvendes til at kvantificere stivheden af små vævsprøver ved hjælp af et passende sæt af klemmer med tilpasTED understøtter de vævsprøver og en vejecelle til at overvåge kræfter. Kan tages flere tilgange til at montere et væv til BAXS platform motorer; i dette tilfælde rustfrit stål insekt minutiens pins kan tilslutte gennem åbningen af vaskulære væv med henblik på at udføre trækforsøg (4A-B). Alternativt, for tykke væv uden en naturlig åbning, væv kanter kan enten holdes på plads med klemmer knyttet til svingspolen motorer eller limet til små glasplader med biologisk lim og knyttet til motorer med klemmerne. For at udføre trækprøver en miniature vejecelle er påkrævet, og let kan inkorporeres onto BAXS platform motorer og anvendes til at måle den kraft, der virker på vævet under en strækning cyklus (figur 4C). Som BAXS platformen består af fire motorer, indførelse af en anden vejecelle gør det muligt at udføre trækprøvning langs to ortogonale retninger. Denne evne gør det muligt at quantify den mekaniske stivhed af et enkelt væv langs to vinkelrette retninger i det samme eksperiment.
Vigtigere er det, i alle konfigurationer, cellerne eller vævsprøverne af interesse altid holdes i en temperatur-kontrolleret bad, der er tilgængeligt for brugeren. Denne evne gør det muligt for indførelse af farmakologiske midler under prøven strækning med henblik på at undersøge den tidsmæssige respons af prøven. Derudover, da den optiske akse i den omvendte mikroskop forbliver uhindret, alle former for mikroskopi er stadig til rådighed for brugeren. Endelig, som alle fire motorer af BAXS platformen er uafhængige, er det muligt at anvende meget konfigurerbar stamme felter til prøven af interesse. In vivo celler og væv er udsat for komplekse og anisotropisk strækning der kan være mere passende efterlignede i denne platform i modsætning til traditionel enaksede stretching platform 7,13,15,18,19. Desuden de fysiske karakteristikaaf stammen felt kan ændres på flue under et forsøg. Disse evner tillader brugeren at undersøge celle-og vævsniveau svar på en lang række yderst kompliceret, anisotrop tidsmæssigt og rumligt varierende stamme felter. Denne artikel beskriver de fordele og begrænsninger af BAXS platformen samt dens design, drift principper, og de eksperimentelle oplysninger om enkelt celle og hele væv eksperimenter.
Fig. 1. Oversigt over BAXS platformen. A) Øverste visning af BAXS platformen viser fire svingspole motorer. B) detaljeret billede af petriskålen varmelegeme anvendes til at opretholde celler og væv ved 37 ° C. C) Platformen kan monteres på et inverteret mikroskop til at udføre levende cell imaging under stretching eksperimenter.D) detaljeret billede af svingspolemotor; den bevægelige del af platformen. E), detaljeret billede af den lineære positionering scenen så den lodrette forskydning af opspændingssystemet. F) detaljeret billede af den optiske encoder, der giver real-time position motoren til motion controller. G) detaljeret billede af bevægelses-controlleren viser de fire optiske encoderindgange og magt udgange til de fire svingspole motorer.
Figur 2.. Fastspændingssystem for celle strækker eksperimenter. AB) Billeder der viser detaljerne i de klemmer bruges til at fastgøre PDMS substrat til svingspolen motorer til at strække. C) Underlaget er viklet rundt om cylindriske del af klemmen med sin forankring features sidder i rillen på toppen. Derefter underlaget er sikret ved hjælp af stilleskruerne, der skubber underlaget / forankring elementer i det øverste rille. D) Illustration af BAXS platform med klemmerne holder underlaget på plads. Det indsatte viser en detaljeret afbildning af substratet med celler knyttet til den sidder lige over et dækglas og mikroskop mål.
Figur 3.. Bill af materialer af membranen og dens fastspændingssystem. Tegninger, der viser dimensionerne af de vigtigste dele integreret i biaksial platform til at udføre celle stretching eksperimenter.
Figur 4.. Exrigelig af et fastspændingssystem for stivhed vurdering af små kaliber fartøjer. AB) detaljerede billeder af spændeenhedens anvendes til at fremkalde deformation i en 1 mm diameter mus aorta. Rustfri stifter blev omhyggeligt formet i åbne trekanter for at tillade skibet at glide på begge ben. C) Illustration af BAXS platform med klemmerne holde skibet og en vejecelle fastgjort mellem den faste motor og venstre klemme. Det indsatte viser en detaljeret top-fartøjet monteret på ben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Mekanisk deformation af enkeltceller
- Fremstilling af en PDMS Underlag med indlejret fluorescerende perler
Forud for fremstilling af substratet, er fluorescerende mikrosfærer i vandopløsning resuspenderet i isopropanol for at forbedre perle blanding i PDMS på grund af dens hydrofobe natur.- Pipetter 500 pi fluorescerende mikrosfærer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 16.200 xg i 10 min.
- Supernatanten fjernes, og tilsættes 500 ul isopropanol følges med 5 min af vortex. Sæt hætteglasset til side natten i mørke for at give nogen store partikler aggregater til sediment.
- Den næste morgen, fjern forsigtigt supernatanten til et rent mikrocentrifugerør hætteglas. Denne kugle opløsning kan anvendes til at fremstille mere end 5 substrater. BEMÆRK: perleopløsningen vil fortsætte med at bundfælde for de næste 3 dage. Vær omhyggelig med at undgå opblandes pellet.
- Hæld 0,5 g af hærdningsmidlet billedemed PDMS kit i et 1,5 ml mikrocentrifuge hætteglasset ved en videnskabelig balance. Ved successive trin, tilsættes i alt 90 pi perler (på seks 15 tilføjelser pi) hvirvelbehandling i 1 minut mellem hver tilsætning. Braklægning.
- 10 g PDMS afvejes og blandes i mindst 12 min med 0,5 g af hærdningsmidlet suppleret med fluorescerende perler.
- Fabrikere en SU-8 2050 korsformede støbeform under anvendelse af standard fotolitografiske teknikker efter producentens anvisninger. Den anvendte støbeform har en højde på 320 um og et areal på 13,4 cm2 (figur 3). Formen kan indeholde 428 pi eller 440 mg PDMS.
- Hæld 400 mg PDMS med perler i korsformede støbeform ved anvendelse af en overførselspipette, og hærde i 2 timer ved 80 ° C. Efter hærdning skrælle substratet fra formen (figur 5A). Substratet kan holdes i en petriskål ved stuetemperatur i 2 uger uden at vise betydelige ændringer i dets mekaniske egenskaber. Hæld dråber af PDMS (hærder: PDMS med et forhold på 1:20) i en petriskål med en endelig størrelse på cirka 4 mm i diameter, og helbrede dem på hovedet i 2 timer ved 80 ° C (fig. 5B). Disse ankring funktioner kan holdes i en petriskål i ugevis. BEMÆRK: Bevar fadet på hovedet for at forhindre fald fra udfladning under hærdeprocessen.
- Air-plasma nydelse (30 sek ved 30 W) underlaget og 8 forankring funktioner. Binde funktionerne på hver ende af substratet i en afstand på 4 mm fra den firkantede led til stede på substratet (figur 5C).
- Montering membran på Klemmer
- Wrap hver ende af underlaget omkring den rillede cylindriske del af klemmerne og fastgør det på plads med de 2 stilleskruer fra toppen (figur 2B og Tal 5D-E).
- Skru de 4 klemmer på klemmeholderen og hæld PDMS (forholdet 1:20) ved hjælp af en engangs tverførselsplacering pipette ved grænsefladen mellem underlaget og den rillede cylindriske del af klemmerne. Spred uhærdede PDMS omkring rillede cylindriske del ved hjælp af en 1,5 mm unbrakonøgle.
- Hæld PDMS (01:20) i rillerne indtil den er helt fyldt ved kapillærvirkning og helbrede samlingen ved 80 ° C i 2 timer (figur 5F).
- Seeding Celler på membranen
- Air-plasma nydelse (30 sek ved 30 W) hele forsamlingen til at sterilisere og functionalize underlaget for at tillade kollagen belægning.
- Funktionalisere område af substratet, hvor celler vil blive podet med 1 ml 0,02 M eddikesyre suppleret med 16 ug / ml rotte-hale collagen ved stuetemperatur i 1 time. Den ønskede endelige kollagendensitet er 5 ug / cm 2.
- Skyl substratet 3x med phosphatbuffer og lad det tørre ved stuetemperatur i mindst 10 min.
- Tilsæt 40 ul dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin indeholdende 2.000 celler i den centrale del af substratet for at dække et område på 1 cm2 (celledensitet: 20 celler / mm 2). Celletæthed kan ændres i henhold til eksperimentelle krav.
- Sæt hele samlingen i en standard cellekultur inkubator med underlaget opad med dråbe dyrkningsmedium indeholdende celler på det. BEMÆRK: Montagen skal opbevares sammen med underlaget opad i mindst 3 timer for at tillade celler til fast vedhæfte det. For at forhindre fordampning, er 30 pi varm dyrkningsmedium tilsat til dråben på substratet hver 45 min til 3 timer.
- Efter 3 timer, flip hele konstruktionen i en petriskål fyldes med frisk dyrkningsmedium at nedsænke substratet og inkuberes natten over for at tillade celler at proliferere.
- Den næste dag, forberede HEPES-pufret saltopløsning (HBSS; 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5,3 mM KCI, 0,8 mM MgSO4, 1,8 mM CaCl2, og 11,1 mM dextrose). PH justeres til 7,4. BEMÆRK: HBSS opløsning skal fremstilles dagligt og holdt ved 37 ° C i løbet af forsøgene. Denne fysiologisk opløsning anvendes til at opretholde cellerne på mikroskopbordet ved at efterligne den normale væv / blod-miljø.
- Monter set-up på omvendt fasekontrast eller fluorescerende mikroskop Monter clamp-substrat samling på BAXS platform og motorer. Fyld petriskålen inde petriskålen varmer med HEPES-buffer (figur 2D).
2.. Stivhed Måling finkalibret Fartøjer
- Forberedelse
- Krebs fysiologisk opløsning: Forbered en opløsning af 118,1 mM NaCl, 11,1 mM D-glucose, 25 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4 og 2,5 mM CaCl2. Justér pH til 7,4 og ilte løsning med carbogen medicinsk gas (95% O 2/5% CO 2) i 30 min. BEMÆRK: Krebs solutiom der skal fremstilles hver dag og holdt ved 37 ° C i løbet af forsøgene. Denne fysiologisk opløsning anvendes til at opretholde væv live ved at efterligne den normale væv / blod-miljø.
- Saml instrumentering til dissektion og mekanisk vurdering af aorta skibe: kirurgiske sakse, bøjede pincet, mikro-saks, kirurgisk dissektionsmikroskop, 50 ml polypropylen centrifugerør, og 10 ml serologiske pipetter. Den kirurgiske og eksperimentere procedure kræver ikke sterile forhold. Monter klemmerne af BAXS platformen sammen med vejecelle forhånd.
- Tissue Isolering og Dissection
Alle eksperimentelle procedurer, der involverer forsøgsdyr skal godkendes af Animal Care og brug Udvalg af brugernes institution, der er i overensstemmelse med Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i brugernes land.- Udfør mus eutanasi med indånding af 99% CO 2 (7 psi)i en plexiglas kammer (figur 6A).
- Åbent mus maven og skære thorax aorta til at bløde musen.
- Fjern mellemgulvet, thorax bur og lungelapperne (figur 6B). BEMÆRK: For at minimere risikoen for at beskadige vævet, holde hjertet knyttet til aorta og undgå at røre ved skibet direkte, men manipulere det ved hjælp af hjerte.
- Tag hjertet, aortaroden og thorax aorta ved forsigtigt at skære mellem fartøjet og rygsøjlen. BEMÆRK: Fremkald ikke nogen forlængelse i fartøjet under excision at holde den indre struktur af vævet intakt (figur 6C).
- Umiddelbart fordybe og holde hjertet og aorta i Krebs-opløsning.
- Klip og omhyggeligt vaske aorta i Krebs løsning til at fjerne eventuelle blodpropper. Fjern bindevæv ved hjælp af mikro-saks, pincet og kirurgisk dissektionsmikroskop (Figur 6D-E). BEMÆRK: Opbevar al længde skibet og bruge AORtic rod at bestemme fartøjets orientering.
- Vessel Dimension Bestemmelse og montering
For at bestemme stivheden af fartøjet, er lastet fartøj dimensioner påkrævet, og kan bestemmes med et kalibreret mikroskop.- Skær en aorta ring på omkring 2 mm i længden og præcist at måle dets længde ved hjælp af et kalibreret mikroskop indstilling (figur 6F-G). Put dette segment til side i Krebs-opløsning.
- Skær anden aortaringen så lille som muligt mellem hver af de 2 mm segmenter (figur 6F). Put denne lille segment på et mikroskop objektglas med lumen opad og måle vægtykkelsen ved hjælp af en kalibreret mikroskop indstilling (fig. 6H).
- Fyld petriskålen på BAXS platform med Krebs-opløsning og indsæt 2 mm aorta ring segment på trækker stifter (indsat i figur 4C).
GE = "altid"> 
Figur 5. PDMS substrat fremstilling og montage. A) Efter hærdning substratet omhyggeligt afskrælles SU-8 2050 skimmel og lægge i en petriskål. B) Forankring træk lavet af PDMS og hjælpe med substratet på klemmer. C) Substrat med at forankre funktioner klar til montage. D) Substratet er monteret på de 4 klemmer, som derefter monteres på klemmeholderen (se indsat). E) detaljeret billede af substratet monteret på fire klemmer. F ) Procedure for at hælde PDMS i rillen nedenunder underlaget. Pilen viser PDMS langsomt fylde rillen af kapillære kræfter.
454fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 6.. Fremstilling og isolering af thorax aorta. A) Forberedelse kirurgiske instrumenter og den aflivet mus. B) Gennem en langsgående abdominal incision, er brystkassen og lunge lobs fjernet. C) Den aorta fjernes omhyggeligt ved hjælp af hjertet til at manipulere vævet. D) Hjertet og aorta er sat i Krebs fysiologisk opløsning. Aorta renses ved at fjerne alle bindevæv. E) detaljeret billede, der viser hjerte og aorta. F) Aorta segmentet anvendes til stivhed vurdering sammen med små segmenter, der anvendes til tykkelsesmåling. GH) Den præcise længde (G) og tykkelse (H) for hvert fartøj segmenter vurderes ved hjælp af en omvendt mikroskop og en analyse program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cell Udstrækning
Den BAXS platform blev anvendt til at undersøge den mekaniske reaktion af kernen i enkelte mus myoblastceller (C2C12) udsættes for et substrat deformation på 25%. Myoblastceller findes i muskelvæv og er konstant udsat for mekanisk strækning og kompression in vivo. Formen og mekaniske egenskaber af cellekernen har vist sig at spille en vigtig rolle i reguleringen af genekspression og transkriptionel aktivitet 20,21 og også i en række udviklingsmæssige defekter og sygdomme, såsom Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPs) Emery -Dreifuss muskelsvind (EDMD), dilateret kardiomyopati, tidlig aldring og kræft 22-25. Derfor forstå, hvordan styrker fra den eksterne mekaniske mikromiljø påvirke struktur og funktion af kernen er af ekstrem interesse. Den BAXS platformen blev brugt til at undersøge overførsel af kraft fra mi croenvironment til kernen ved at strække substratet parallelt med dens større eller mindre akse. Figurerne 7A-F illustrerer mulighederne i platformen til at inducere en deformation i substratet langs to ortogonale retninger. Desuden kan BAXS platform fremkalde komplekse stamme felter i underlaget i tillæg til standard énakset af equi-biaxial strain felter. Figur 7G-H illustrerer den fleksibilitet, som uafhængig kontrol af stammen område langs to ortogonale retninger, hvilket giver os mulighed for enten at producere en standard (komprimerende) eller ren (ikke trykstyrke) enaksede spændingsfelt. Den BAXS platformen er i stand til at fremstille et rent uniaksial spændingsfelt ved let at trække substratet i retning vinkelret på den primære strækning retning (figur 7G) for at kompensere for komprimering til stede i substratet langs denne retning i en standard uniaksial strækning (figur 7H ).
ntent "fo: keep-together.within-side =" altid ">
Figur 7.. Forskydningsstyret deformation relationer fra at udføre standard og ren enaksede stretching. AB) fluorescerende perler er valgt manuelt på det første billede i videoen og spores fra en ramme til den anden, indtil det maksimale strækning er nået langs den vandrette (C) og lodrette (D) retninger. En MATLAB script automatisk beregner komponenterne i den grønne stamme tensor for hver ramme og producerer en kalibreringskurve af stammen i forbindelse med motor deplacementer 27.. EF) De blå og røde linjer svarer til den del af den grønne stamme tensor langs den vandrette og lodrette retninger hhv. G) Stretching det samme substrat ved 4 mm langs x-aksen og let strækker sig langsy-aksen med 1,5 mm (fremhævet med rødt) producerer en ren uniaksial felt uden trykstyrke deformation i underlaget. H) Stretching substratet langs x-aksen med 3,5 mm frembringer en deformation på 25% og en trykstyrke deformation af 7%, når enderne af substratet langs den lodrette akse er fast (fremhævet med rødt).
Med evnen til at udføre live-cell mikroskopi billeddannelse under strækning blev kerner farves med et live-cell fluorescerende farvestof, som binder til DNA (Hoechst 33342). Generelt C2C12 celler besidder elliptiske kerner med en større og mindre akse. Først blev identificeret celler, hvor større eller mindre nukleare akser er orienteret parallelt med den vandrette strækning retning. På dette tidspunkt blev celler strakt med 25% langs hver ortogonal strækker akse, mens erhverve billeder af den udeformerede og deformerede kerne mellem hver strækker cykler (figur 8A-I). På denne måde kunne vi vurdere deformerbarhed af kernenlangs dens større og mindre akse under en præcist styret substrat deformation. Ovuscule, en ImageJ plugin, blev brugt til at bestemme længden af de større og mindre nukleare akser. Disse længder blev registreret under den deformerede tilstand, og da kernen blev sekventielt strakt langs dens større og mindre akser (figur 8G-I). For at beregne deformation af kernen langs dens mindre og større akser, blev den relative ændring i længde langs hver akse i den strakte og udeformerede tilstande beregnes:
hvor ε er deformation, L 1 er den deformerede længde og L 0 er den udeformerede længde.
Deformerbarheden af kernen i C2C12 udviser en mekanisk anisotropi da det viser en signifikant højere deformerbarhed langs dens lilleakse (6,3 ± 1,1%) i forhold til sin hovedakse (3,077; 0,6%) (figur 8J). Derudover undersøgte vi også den rolle actin og mikrotubuli cytoskeleton i reguleringen nukleare deformerbarhed. Dette blev opnået ved depolymerisering af actinfilamenter eller mikrotubuli selektivt ved hjælp af cytochalasin-D og nocodazol, hhv. Depolymerisering af actinfilamenter eller mikrotubuli blev fundet at fremkalde et tab af anisotrope deformerbarhed af kernen (Figur 8J). Disse resultater understøtter resultaterne at cytoskeletale komponenter sender styrker til kernen fra underlaget og er også afgørende for at bevare den naturlige mekaniske opførsel af kernen under deformation 25.
Figur 8.. Stretching protokol og nuklear deformerbarhed. AC) Skematisk illustration af stre tching protokol en enkelt celle med dens kerne orienteret vandret. Fasekontrast billeder (DF) og epi-fluorescerende billeder (GI) i en celle farves med DNA-specifikke fluorescerende farvestof. Dette billede sekvens illustrerer en typisk celle strækker forsøg, hvor den samme celle udsættes for ortogonale deformation felter. Skalapanelerne er 25 um. J) C2C12 viser anisotropisk nukleare deformabilitet med lilleaksen deformerer væsentligt mere end den store akse. I actin-eller mikrotubuli berøvet celler (cyt-d og nocodazol, henholdsvis), denne anisotropi forsvinder. I alle forhold, nucleus deformationer er signifikant forskellig fra nul under et substrat deformation på 25%. ** P-værdi <0,01, parret t-test. † † p-værdi <0,01, † † † p-værdi <0,001, en-sample t-test.
Vessel Stivhed Assessment
t "> For nylig, vores gruppe undersøgte effekten af kroniske overekspression af Heat Shock Protein-27 (Hsp27 o / e) på dannelsen af aorta plaques i en åreforkalkning-tilbøjelige musemodel (apoE - / -). 26. Vi viste, at Hsp27 fungerer som en atheroprotective protein, der reducerer plak lipid-og makrofag overflod og øger intimale glatte muskelceller og kollagen indhold (figur 9A-B). at bestemme virkningen af denne histologiske remodeling på fartøjets mekaniske egenskaber blev BAXS anvendte platform at måle aorta stivhed.9C viser en typisk spændings-deformationskurve fra trækstyrke strækning af en aorta ring. For at kvantificere stivhed, blev den inkrementelle modul beregnet ud fra stress-strain kurver ved en deformation på 30%. Stivheden er hældningen af tangenten til kurven. Ved at indføre en vejecelle på en af de BAXS platform motorer, den samtidige erhvervelse af displacement og kraft data er mulig. Forskydningen-kraft kurver blev omdannet til stress-strain kurver baseret på udeformerede dimensioner af hver aorta ring. Stress og belastning beregnes ved hjælp af følgende formler:
hvor ε er deformation, L 1 er den deformerede længde, L 0 er den udeformerede længde, s er stress, F er den kraft, og et 0 er den udeformerede område af vævet under belastning. I det specifikke tilfælde af en aorta ring, den udeformerede (A 0) er to gange tykkelsen af ringen gange længden af segmentet.
Hver prøve blev deformeret cyklisk med en maksimal deformation på 40% ved en forskydning på 50 um / s for 12 cyklusser med de første 11 cyklusser tillader konditionering af vævet og last en til dataopsamling. Vi fandt, at stivheden af aorta segmenter af apoE - / - Hsp27 o / e mus (62,8 ± 3,0 kPa) blev signifikant forøget med 41% i forhold til apoE - / - kontrol musemodel (44,4 ± 3,8 kPa) (figur 9D) .
Taget sammen mekanisk vurdering kombineret med skibet og plak histologi viste, at over-ekspression af Hsp27 er kendetegnet ved øget fartøjets stivhed og kollagen / glat indhold muskelceller. Disse resultater antyder, at Hsp27 potentielt kan øge stabiliteten af atherosklerotiske læsioner og dermed mindske risikoen for plaqueruptur.
Figur 9. Virkning af Hsp27 overekspression på skib stivhed. Vi viste, at Hsp27 ændret den histologiske komposition af ateroskleroselæsioner ved at øge intima glatte muskelceller (A: anti-α-SMA) og kollagen indhold (B: PicroSirius rød plet) C) Typisk stress-strain kurve fås fra strække en aorta fartøj, hvor stivheden er opgjort til 30.. % af stamme. . Stivheden er hældningen af tangenten (rød linje) til kurve D) Kronisk overekspression af Hsp27 øger fartøjer stivhed i sammenligning af kontrol apoE - / - mus model (D). Skalapanelerne i (A) og (B) er begge 40 um og 400 um i mellemværker. L = lumen, I = intima, stiplede linjer skildrer medierne. * P-værdi <0,05, envejs ANOVA. *** P-værdi <0,001, envejs ANOVA. Figur tilpasset fra arbejde Cuerrier et al 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den BAXS platform præsenteres her letter talrige eksperimenter i studiet af mechanobiology, fra undersøgelser af enkelte celler til hele væv. Hertil kommer, at platformen er meget fleksibel og konfigurerbar, giver mulighed for en lang række mekaniske stimulation eksperimenter og multiaksial trækprøvning. Platformen giver også mulighed for vedligeholdelse af celler og væv i fysiologiske betingelser, og giver mulighed for samtidig mikroskopi under stretching eksperimenter. De to eksperimenter, der er beskrevet i de foregående afsnit påvise alsidigheden af BAXS platform ved brug af en passende sæt monteringsbeslag. En modulær og kan tilpasses prøve monteringssystem, optisk adgang og mulighed for at tilføje ekstra sensorer (for eksempel en vejecelle), åbner mange muligheder for andre typer af eksperimenter, der skal udføres.
Protokollen er præsenteret ovenfor indeholder mange vigtige skridt, der skal udføres endequately for at frembringe de bedste resultater. Inden i cellen strækker protokol montering PDMS substrat klemmerne kræver delikat og præcis manipulation. PDMS Underlaget skal være godt centreret i forhold til de fire klemmer for at undgå uønskede laterale bevægelser af substratet under strækning. Sådanne laterale bevægelser kan gøre sporing af cellerne vanskeligt i stretching eksperimenter. Det er også afgørende at overvåge fordampning af dråben dyrkningsmedium under cellepodning når substratet vender opad i inkubatoren. Afhængig af, hvor ofte kuvøsen døren åbnes under processen, kan fordampningshastigheden ændre sig. Inden i beholderen strækker protokol er den mest kritiske trin er måling af dimensionerne af prøven, der skal testes. Disse dimensioner skal være så nøjagtige som muligt, da de er involveret i beregningen af væv stivhed og har derfor en direkte indvirkning på resultaterne. Når den samme person udføre fartøj dimension målinger vil medvirke til at begrænse variationen mellem prøverne.
Fremstillingen af klemmerne bruges til at trække på PDMS underlaget under celle strækker eksperimenter involverede flere udviklingsprojekter cyklusser. Den første version af klemmerne ikke har en forankring rille placeret i bunden af de cylindriske dele (Figur 2B). Uden denne rille substratet gled langs den cylindriske del, inducerer en betydelig variation i substrat deformation over tid. Med tilstedeværelsen af rillen og tilsætning af hærdede PDMS (figur 5F), substratet ikke længere glider. Denne forsøgsopstilling frembringer en konstant deformation i substratet over tid. For væv strækker eksperimenter vælge den rigtige vejecelle er også meget vigtig. Vejecellen bruges her har en lav belastning (op til 150 g), der er passende for de testede her prøver. Den meget følsom belastningscelle kræves for foranstalturing trækkræfter på små prøver besad et relativt lavt signal-støj (S / N) forhold. For at forbedre S / N ratio og dermed forbedre opløsning blev vejecellen elektrisk isoleret fra svingspolemotor og metaldele ved hjælp af plastik skruer og afstandsstykker. På denne måde en høj signal / støjforhold med en opløsning på 0,03 g blev opnået. For blødere prøver, er brugen af et nedre område vejecelle anbefales for at opretholde en høj opløsning.
I øjeblikket er den store begrænsning af BAXS platform er evnen til at udføre langvarig strækker forsøg på grund af fordampning af HBSS buffer over tid. Fordampning øger koncentrationen af opløst stof, der potentielt kan have en effekt på celler. Med den nuværende udformning af BAXS platformen, er det vanskeligt at få et eksperiment, vil mekanisk stimulere celler eller væv i løbet af dage, som bufferen, hvor celler og væv nedsænkes skal være tillægs teret med væske over tid. I den aktuelle indstilling, fordampningen er omkring 0,9 ml / t fra en indledende volumen på 25 ml HBSS bufferopløsning. Den aktuelle indstilling er ideel til korte eksperimenter. For at udføre pålidelig celler og væv strække eksperimenter over længere perioder, er to tilføjelser foreslået: 1) Et fluidic system til opretholdelse af buffer volumen, og 2) tilføjelse af en kommerciel eller hjemme bygget inkubator kammer omslutter hele systemet for at opretholde konstant fugtighed og temperatur og giver en 5% / 95% CO 2 / luft-atmosfære. Hvad angår muligheden for at strække karvæv, opsætningen beskrevet ovenfor tilladt os at måle stivheden af små kaliber fartøjer. Det er vigtigt at anvende stifter med en passende diameter til at sikre, at de ikke vil deformeres under strækning, men er lille nok til at passe ind i karhulrummet. Ikke at tage denne detalje i betragtning kunne introducere unøjagtighed i den målte deformation af vævet.
ve_content ">In vivo er væv-embedded celler udsættes for mekaniske kræfter og belastninger, der varierer både rumligt og tidsligt, men endnu vigtigere er de ofte multiaksiale. Et godt eksempel er den mekaniske opførsel af vaskulaturen vægge som reaktion på hæmodynamiske kræfter. Kombinationen af lokale hæmodynamiske kræfter 28-30 med anisotrope egenskaber af vaskulære væv 13,14,16,27 resultere i en kompleks mekanisk mikromiljø, som udsætter endotel og vaskulære glatte muskelceller til komplekse multi-aksiale og cyklisk stamme felter. Selvom eksisterende celle strækker eksperimenter i høj grad har bidraget til den grundlæggende forståelse af mechanotransduction og mechanobiology, har de traditionelt har påberåbt sig idealiserede enaksede eller Equi-biaxial strain felter, der ikke gengiver komplekse in vivo strain felter 8-10,19,29,31-34 . Den BAXS platform giver mulighed for anisotropisk biaksial celle strækker med samtidig levende cell mikroskopi. Evnen til at styre deformationen af substratet langs to ortogonale retninger tillader os at have fuld kontrol over spændingsfelt. Dette muliggør fremstilling af komplekse strain felter foruden enkle enaksede og equi biaksialt strain felter. Desuden platformen giver os mulighed for dynamisk at ændre retningen af stammen område inden for samme strækning eksperiment.
Muligheden for at integrere en modulær og brugerdefinerede spændesystem åbner mulighed for mange applikationer i celle mechanobiology og væv mekanik ved hjælp af en enkelt stretching platform. For eksempel med ordentlige spændesystemer 13,27, kan denne platform udføre plane enaksede og biaksial trækprøvning af biologiske væv. På denne måde kan de mekaniske egenskaber af alle væv, skåret i en rektangulær eller kvadratisk form, kan kvantificeres langs to ortogonale akser i et enkelt eksperiment. Desuden udfører histologiske ennalyses efter mekanisk stimulering kan afsløre stræk-inducerede strukturelle ændringer i væv. Torsion er også en meget vigtig form for mekanisk belastning for muskelvæv og ledbånd 35. Denne platform har potentiale til at designe et fastspændingssystem, som kan fremkalde en rotation omkring den strækning akse for at frembringe en kombinatoriske mekanisk belastning involverer vridning og spændinger. Det er også muligt at vurdere større kaliber skibe med passende monteringstappe. Studere cellulære reaktioner efter mekanisk deformation er også under intens efterforskning. Den BAXS platform tilbyder en unik funktion for at ændre retning og kompleksiteten af stammen område inden for samme eksperiment foruden giver mulighed for samtidig billeddannelse. Vigtigere er det, multimodale former for mikroskopi er stadig muligt, da platformen ikke interfererer med den optiske akse i mikroskopet. Dette er en vigtig funktion, da de strukturelle og biokemiske levende celle respons på mekanisk deformation kan måles. Tilsammen den BAXS platform design har flere vigtige funktioner, der letter dens anvendelse til enkelt celle og hele væv eksperimenter. Ved anvendelse af et modulært fastspændingssystem og tilsætning af op til fire mulige vejeceller kan BAXS platform anvendes til en lang række eksperimenter. Denne artikel viser oplysninger om to eksempler på eksperimenter; dog modularitet og fleksibilitet i systemet kan desuden udnyttes til at undersøge mange forskellige aspekter af mechanobiology på sub-cellulære, cellulære og hele væv længdeskalaer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
DT blev understøttet af en postdoc studentship fra Le Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) og en MITACS Elevate Strategisk Fellowship. CMC blev understøttet af en postdoc studentship fra le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) og Ernest og Margaret Ford kardiologi begavet forskning stipendium fra University of Ottawa Heart Institute. EOB blev støttet af driftstilskud MOP80204 fra den canadiske Institute for Health Research (CIHR) og T6335 fra hjertet og slagtilfælde Foundation of Ontario. CIHR og Medtronic tilsammen danner EOB med en peer-reviewed Research Chair (URC # 57093). AEP er finansieret af naturvidenskab og Engineering Research Council (NSERC) Discovery Grant, et Supplement NSERC Discovery Accelerator og taknemmelig støtte fra Canada Research Stole (CRC) program og en tidlig Researcher Award fra provinsen Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
| FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
| Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
| Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
| Linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| Optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S - 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
| Motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
| Load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0.20 mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
| Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
| Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V |
| 1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
| DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
| Trypsin 0.05% | Hyclone | SH30236.02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |
References
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
- Ingber, D. E.
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
- Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
- Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
- Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
- Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
- Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
- Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
- Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
- Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
- Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
- Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
- Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
- Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
- Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
- Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
- Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
- Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
- Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
- Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. , (2013).
- Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
- Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
- Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
- Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
- Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
- Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
- Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
- Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
- Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
- Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).
