Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vier-dimensionale (4D) lichte afdruk is gebruikt om het gedrag van kleine structuren te bestuderen binnen motorische zenuwuiteinden van de dunne transversus abdominis van de kousenband slang. Ruwe data omvat time-lapse sequenties van 3D z-stacks. Elke stapel bevat 4-20 beelden die met epifluorescentie optiek bij focale vliegtuigen gescheiden door 400-1,500 nm. Stappen in de overname van het beeld stacks, zoals aanpassing van de focus, schakelen van excitatiegolflengten, en de werking van de digitale camera, zijn geautomatiseerde zo veel mogelijk op de foto te maximaliseren en minimaliseren van weefselschade door blootstelling aan licht. Na verwerving wordt een reeks afbeeldingsstapels deconvolved ruimtelijke resolutie te verbeteren, omgezet in het gewenste 3D-formaat, en gebruikt om een 4D "film" die geschikt is voor verschillende computergestuurde analyse, afhankelijk van de gevraagde experimentele gegevens. Een toepassing is studie van het dynamisch gedrag van twee klassen van endosomes gevonden in zenuwuiteinden-macroendosomes (MES)en zure endosomen (AE) die afmetingen (200-800 nm voor beide) op of nabij de diffractie limiet. Toegang tot de 3D-informatie op elk tijdstip biedt een aantal voordelen ten opzichte van conventionele time-lapse imaging. In het bijzonder kunnen de grootte en de snelheid van beweging van structuren gekwantificeerd tijd zonder verlies van scherpstelling. Voorbeelden van gegevens van 4D beeldvorming blijkt dat ME's benaderen de plasmamembraan en verdwijnen, wat suggereert dat ze in plaats van zijn exocytosed gewoon verticaal verplaatsen uit de buurt van een enkel vlak van focus. Ook geopenbaard is putatieve fusie van MES en AEs door visualisatie van overlap tussen de twee kleurstof bevattende structuren gezien in elk drie orthogonale projecties.
Inleiding
Time-lapse beeldvorming van levend weefsel biedt visuele toegang tot dynamische structuur-functie relaties die niet kunnen worden gewaardeerd in vaste of leven voorbereidingen afgebeeld op een enkel punt in de tijd. Vaak echter het nadeel van toegang tot temporele informatie een afname van optische resolutie. Hoge numerieke apertuur olie-immersie doelstellingen zijn onpraktisch in levend weefsel vanwege hun smalle bandbreedte van focus, waardoor het water onderdompeling of droog doelstellingen als de enige alternatieven. Bovendien kan de verhoogde resolutie geboden door confocale optica niet worden gebruikt in bepaalde levende preparaten vanwege fototoxiciteit van de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Vlekken op de voorbereiding met Supravital Kleurstoffen
- Voor de kousenbandslang dissectie protocol zie Stewart et al.. 5 en Teng et al.. 6 Reptilian weefsel overblijft fysiologische voor langere tijd, en met minder bacteriële besmetting, bij bewaring bij lage temperaturen (zie hieronder). Zoogdierweefsel wordt gewoonlijk gehandhaafd bij kamertemperatuur of hoger.
- Voor lysosomale vitale kleurstof vlekken, los de kleurstof in koude reptielen Ringers-oplossing 1:5000 (0,2 uM). Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Was enkele malen met koud Ringers. Beeld zo snel mogelijk.
- Voor FM1-43 kleuring m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De getoonde gegevens zijn van slang neuromusculaire terminals (zie lage en hoge uitzicht vergroting in figuur 3, de endocytische kleurstof (FM1-43) opname creëert een waas die elk bouton vult) en, in het bijzonder, macroendosomes (MES) en zure endosomes (AE) binnen deze terminals 5. ME's zijn gemaakt door bulk endocytose tijdens neurale activiteit 10 en hun aantal daalt exponentieel met de tijd na de activiteiten heeft gestaakt 6. Gebruik van 4D live-imaging was om t.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische aspect van 4D beeldvorming is beheer van de duur en intensiteit van blootstelling aan licht. Fotobleken vermindert het signaal-ruisverhouding en kan problematisch of niet, afhankelijk van verschillende factoren, waaronder keuze van fluoroforen zijn. Niet-specifieke schade aan levend weefsel (fototoxiciteit) is gerelateerd aan fotobleken, en kan soms worden geïdentificeerd met fluorescerende probes daartoe ingerichte 2,12 of door onderzoek van de morfologie helderveld met geschikte optica, z.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health Grant NS-024572 (RSW).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| SGC5 | Biotium, Hayward, CA | 70057 | Finale conc: 10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen, Carlsbad, CA | F35335 | Finale conc: 7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen, Carlsbad, CA | L7528 | Finale conc: 0,2 mM |
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2,5 mM | ||
| CaCl2 | 3,6 mM | ||
| MgSO4 | 1,8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1,0 mM | ||
| HEPES | 5,0 mM | ||
| High KCl Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3,6 mM | ||
| MgSO4 | 1,8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1,0 mM | ||
| HEPES | 5,0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2,5 mM | ||
| CaCl2 | 3,6 mM | ||
| MgSO4 | 1,8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1,0 mM | ||
| HEPES | 5,0 mM | ||
| Sucrose | 0,5 M (17,1 g/50 ml) | ||
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss, Thornwood, NY | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm | Carl Zeiss, Thornwood, NY | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter Instruments, Novato, CA | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter Instruments, Novato, CA | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments, Tonawanda, NY | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics, Tucson, AZ | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software | |||
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO | Deconvolutie; Drift correctie; 3D en 4D data presentatie | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane, South Windsor, CT | Drift correctie; 3D en 4D data presentatie | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe, San Jose, CA | Drift correctie | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Meerdere plugins beschikbaar; Stereo paar constructie | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss, Thornwood, NY | Stereo paar constructie | www.zeiss.com |
Referenties
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).
- Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
