Summary
Pinças magnéticas, uma poderosa molécula única técnica de manipulação, pode ser adaptado para as medições diretas da torção (usando uma configuração chamada livremente em órbita pinças magnéticas) e torque (usando uma configuração chamada pinças de torque magnético) em macromoléculas biológicas. Orientações para a realização de tais medidas são dadas, incluindo aplicações para o estudo do DNA e filamentos nucleo-proteínas associadas.
Abstract
Técnicas de molécula única tornam possível investigar o comportamento de moléculas biológicas individuais em solução em tempo real. Essas técnicas incluem chamadas abordagens de espectroscopia de força, como a microscopia de força atômica, pinças ópticas, fluxo de alongamento e pinças magnéticas. Entre estas abordagens, pinças magnéticos distinguiram-se pela sua capacidade para aplicar o torque, mantendo uma força de estiramento constante. Aqui, está ilustrada como um exemplo pinças magnéticos configuração experimental "convencional" pode, por meio de uma modificação simples na sua configuração de campo para minimizar a magnitude do campo transversal, ser adaptados para medir o grau de torção de uma molécula biológica. A configuração resultante é denominado a pinça magnética livremente em órbita. Além disso, mostra-se como uma nova modificação da configuração do campo pode produzir um campo transversal, com uma grandeza intermédia entre a do & #8220; "pinças magnéticos convencionais e as pinças magnéticos livremente em órbita, o que torna possível medir directamente o binário armazenado em uma molécula biológica. Esta configuração é chamada a pinça de torque magnéticos. O vídeo que explica em pormenor a forma como a conversão de pinças magnéticos convencionais em livremente em órbita da pinça magnéticos e uma pinça de binário magnético pode ser realizada, e demonstra a utilização destas técnicas. Estas adaptações manter todos os pontos fortes de uma pinça magnéticos convencionais, expandindo a versatilidade deste instrumento poderoso.
Introduction
Em anos recentes, as técnicas de molécula única provaram a sua ampla aplicabilidade no estudo de proteínas do motor processive e outras enzimas, obtendo-se uma visão sobre a sua cinética e o mecanoquímica subjacente. No âmbito da espectroscopia de força, contribuições importantes têm sido feitas por microscopia de força atómica fluxo de alongamento, e pinças ópticas e magnéticas. As pinças ópticas e magnéticas (MT) têm notadamente conseguiu combinar uma grande flexibilidade em termos de manipulação molecular, com alta resolução espacial e resolução temporal. Aqui, vamos nos concentrar no MT, que pode aplicar ambas as forças de alongamento e torques de moléculas biológicas amarrados entre uma superfície e contas superparamagnéticos 1-3.
Pinças magnéticos (MT, Figura 1a) é uma técnica muito versátil uma única molécula que tem sido usado para controlar as propriedades mecânicas de ácidos nucleicos, bem como as suas interacções com proteínas. MT tem muitos forças, incluindo simplicidade global e robustez da implementação experimental, aplicação fácil de torque, operação natural e calibração simples no modo de força constante 4, extensão para medições de 5, 6 paralela e ausência de aquecimento da amostra e fotoenvelhecimento. Comparado a outros molécula única se aproxima, MT fornecem uma maneira de realizar medições de força de dependência em forças tão baixas quanto ≈ 10 fN e têm a capacidade de controlar diretamente o grau de supercoiling. Enquanto MT predominantemente têm sido utilizados como uma ferramenta experimental para investigar processos biológicos que envolvem ácidos nucleicos 7, 8, eles também encontraram aplicação em estudos de propriedades mecânicas de proteínas 9-13 ou células 10, 14-17. Inúmeras referências úteis estão disponíveis que descrevem como construir e executar um MT 4, 18-20.
However, MT convencional não acompanhar o movimento de rotação directa, e, ao mesmo tempo que se aplicam torque, eles não medir o binário directamente. Além disso, eles restringir a rotação livre do tirante de ácido nucleico. Aqui, apresentamos duas prorrogações de pinças ímã. As primeira, denominada livremente em órbita pinças magnéticos (FOMT, Figura 1b) 21, permite que as medições de flutuações ângulo de equilíbrio e alterações na torção de moléculas de ácidos nucleicos cativos, sem restringir o movimento de rotação em torno do eixo do tirante. O segundo, designado por pinças de torque magnéticos (MTT, Figura 1C), o qual tem a capacidade de aplicar directamente e medir as forças e binários de biomoléculas individuais 22-27.
No seguinte protocolo, presumimos que o leitor tem em seu / sua disposição um instrumento de MT "convencional". Nós nos referimos o leitor para a discussão de referências sobre como construir e executar um MT configurar, bem como considerações que devem ser levados em consideração na seleção de esferas magnéticas, ímãs, e rotinas de rastreamento. Além disso, as seções 1 e 2 do Protocolo Texto descrever como nós normalmente preparar e incubar uma amostra de DNA para uso no MT, bem como as medidas preliminares que podem ser executadas em um único DNA no MT convencional. Pontos 3 e 4 do Protocolo de Texto ilustrar como um instrumento MT pode ser facilmente adaptado e utilizado para medições FoMT e MTT.
Protocol
1. Preparação e incubação de uma amostra de DNA
- Preparar construções de ADN que estão ligados ao duplex extremidades (tipicamente empregam ≈ 600 pb de ADN de fragmentos de PCR) que são funcionalizados com múltiplos grupos de biotina e digoxigenina, respectivamente 18. Para começar, um comprimento de corda de DNA> 1 um, por exemplo, um 7,9 kpb correspondendo a um comprimento estirado de ~ 2,7 mM como empregue aqui, é recomendado para a facilidade de utilização; em particular, utilizando um comprimento de ADN que é semelhante a ou menor do que o raio da esfera é problemático devido à geometria do anexo no MTT e FOMT. Veja a discussão para uma descrição de como o comprimento do DNA influencia resposta temporal no domínio angular.
- Monte as células de fluxo para experiências única molécula. Para as células de fluxo, utilizar duas lamelas de microscópio de vidro separadas por uma dupla camada de Parafilm espaçador. A lamela de microscópio de topo deveria ter dois furos para o fluido de entrada e saídas para a célula. É convenienteusar um jateamento para fazer os furos. A lamela inferior é revestido com nitrocelulose (0,1% p / v em acetato de amilo). Colocar os espaçadores Parafilm no lado revestido com nitrocelulose as lâminas inferiores e fechar o topo com lâminas de topo limpa.
- Vedar as células de fluxo. Usando pinças físicas, colocar a célula de fluxo montada sobre uma placa de aquecimento configurado para 80-100 ° C durante ~ 1 min. Preste atenção que a célula de fluxo é bem fechados, que o Parafilm não fechar os buracos que se conectam à in-e de saída, e que as lâminas de vidro são bem alinhados.
Nota: Para assegurar uma boa vedação, recomenda-se a acidente vascular cerebral as bolhas na Parafilm usando um grande cotonete. A célula de fluxo pode, em seguida, ser montado sobre o instrumento pinças magnéticos. - Prepare buffers. Preparar tampão de amarração de TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), e NaCl 200 mM). Alternativamente, pode-se utilizar o tampão PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, tampão fosfato 10 mM, pH 7,4) suplementado wom 100 ug / ml de BSA, 0,1% Tween e azida de sódio 5 mM (PBS +) como tampão de amarrar. Volumes 2-3 celulares Lavar tampão TE tethering para a célula de fluxo.
- Incubar 0,5 ou 1,5 mM de raio esferas de látex não-magnéticos na célula de fluxo de ~ 30 min. Estes grânulos irá agir como pérolas de referência durante as medições de pinças magnéticos que permitem minimizar o efeito do desvio entre o suporte de amostra e objectivo (isto é, a célula de fluxo). Lave contas não magnéticas acopladas por lavagem com 2-3 volumes de células de tampão TE tethering.
- Funcionalizar a superfície inferior da célula de fluxo por incubação com 100 ug / mL de anti-digoxigenina em PBS durante pelo menos 1 hora (de preferência mais comprido; incubação pode ser realizada durante a noite), para proporcionar para fixação do ADN. Lavar com 2-3 volumes de células de tampão TE amarrar. Finalmente incubar a célula de fluxo com 2 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) em tampão de amarrar TE durante 30 minutos para a passivação da superfície.
- Tomar uma aliquota de2 ml contas MyOne superparamagnéticos revestidas de estreptavidina (ver Discussão e Tabela de Materiais) e diluir com 10 ml de tampão TE tethering. Lavar duas vezes com 10 ml de tampão TE amarrar utilizando um concentrador de partículas magnético, e ressuspender em 10 ml de tampão TE amarrar. Anexar ~ 1 ml de as moléculas de ADN (cerca de 1 ng) a estas pérolas por incubação em tampão de amarrar TE durante 30 minutos.
- Dilui-se a solução do grânulos superparamagnéticas ADN-tethered dez vezes pela adição de 90 ml de tampão TE amarrar. Finalmente, injecta-se a solução para dentro da célula de fluxo e incubar durante ~ 1 hora para permitir a ligação do ADN à superfície anti-revestidos com digoxigenina. Lava-se a célula de fluxo exaustivamente com tampão TE amarrar. Após a incubação, as construções de DNA do tirante, lavar extensivamente com tampão experimental (este pode ser de tampão TE amarração) para remover todos os grânulos não-ligados.
- Para as medições, que utilizam um protocolo de seguimento angular que requer grânulos marcador fiducial ligados às esferas magnéticas
2. Mensurações em DNA Molécula Única nas pinças magnéticos convencionais
- Usando um marcador convencional (ver discussão) com configuração de campo apropriada (Figura 1a) e tanto de translação e de rotação de controle da posição do íman, procurar moléculas de ADN rotacionalmente constrangidos na célula de fluxo. Ao puxar forças de ≥ 1 pN (consultar referências 4, 19, 20, 28, 29 a respeito de calibração em vigor pinças magnéticas), contas amarrados podem ser facilmente distinguidos dos miçangas coladas à superfície da lâmina inferior por seus diferentes alturas no foco . Se uma molécula de ADN é rotacionalmente constrangidos pode ser avaliada por introdução de 20-30 vezs dos ímãs em uma força de ≈ 0,25 PN: aqui, o comprimento corrente deve diminuir por 0,4-0,5 mM.
Nota: Para executar pinças magnéticos experiências, processamento de imagem é usado para determinar o x, y, z e posição dos grânulos de DNA com amarras. Software Labview personalizado para essa finalidade está disponível a partir dos autores, mediante solicitação.- Verificar que o cordão é presa por uma única corda de ADN. Isto pode ser feito comparando o comportamento sob voltas positivos e negativos em forças de> 1 pN (Figura 2a). Neste regime de força, a presença de múltiplos amarras DNA dará origem a uma diminuição de aproximadamente simétrica na extensão mediante a introdução de voltas positivos e negativos, ao passo que as amarras individuais de DNA dará origem a uma resposta assimétrica.
- Pesquisa para grânulos apropriado fixo preso à superfície inferior na proximidade do tirante de interesse que pode servir como pérolas de referência.
- Calibra-se o comprimento da tele ADN, l. A posição da superfície da célula de fluxo pode ser determinada colocando o talão presa em contacto com a superfície (por exemplo, através da rotação do íman por ~ 60 voltas com uma força inferior a 0,2 pN). Medidas de posição vertical do cordão amarrado no que diz respeito a esta superfície, em seguida, informar sobre valor absoluto de l.
Nota: Para minimizar os efeitos posteriores da deriva, é aconselhável realizar medições de l em relação à posição de um talão de referência afixada à superfície. - Gravar uma curva de rotação (isto é, uma medida da extensão de DNA como uma função do número de espiras), a uma força de alongamento de ≈ 0,25 pN (Figura 2a).
- Determinar o número de voltas em que a extensão é máxima, como este corresponde ao estado em que a molécula de DNA é a torções relaxado. Para fazer isso, é útil para ajustar a curva de rotação localmente com uma parabólica ou uma função de Gauss para determinar o centro positina. Definir este ponto como "zero voltas".
Nota: A rotina de escrita sob encomenda para essa finalidade está disponível a partir dos autores, mediante solicitação.
- Determinar o número de voltas em que a extensão é máxima, como este corresponde ao estado em que a molécula de DNA é a torções relaxado. Para fazer isso, é útil para ajustar a curva de rotação localmente com uma parabólica ou uma função de Gauss para determinar o centro positina. Definir este ponto como "zero voltas".
- Por uma série de ~ 20 posições ímã, determinar a extensão média da molécula de torção-relaxado (ou seja, "zero voltas", veja o passo 2.4.1) a partir do z-trace.
- Para cada ponto de medição, no passo 2.5, determinar com precisão a força de alongamento das flutuações do x ou y, posição 20, 28, 29, ou, desde que a magnetização da pérola é bem conhecida, usando o conhecimento do gradiente de campo local 4. Determinação da força de estiramento contra os resultados médios de extensão em uma curva de força-extensão (Figura 2b).
- Coloque os dados de força de extensão resultantes da equação cadeia worm-like usando a aproximação polinomial por Bouchiat et al 30.
Nota: Quanto menor o raio do anel resultando na configuração MT convencional, o mais de perto a molécula de ADN fica presa mais perto do "polo sul" do cordão magnético. Quando se muda para a configuração FOMT, uma tal molécula de ADN irá ser amarrado de perto para o "equador" da esfera magnética, o que permite o acompanhamento fiável do ângulo de rotação do plano (x, y) da posição (ver discussão).
3. Medidas de torção DNA Usando a pinça magnética livremente em órbita
- Substituir manualmente os imans quadrados das pinças magnéticos convencionais por um íman cilíndrico que é usado para FOMT (Figura 1b). Esta operação deverá ser realizada de tal maneira que o tirante de ADN seleccionado permanece dentro do campo de visão.
- Alinhamento grosseiro pode ser realizada dentro de 15 min para o caso dos grânulos MYONE com amarras 7,9 kbp, e completa-se quando a medição dos (x, y) excursões resulta na observação de movimento circular (Figura 3b, centro).
Nota: alinhamento Grosso é normalmente suficiente para observar as mudanças na torção ocasionados pela proteína de ligação de DNAs únicos amarrados na configuração FOMT 21, 31 (resultados representativos, Figura 5), apesar do fato de o histograma bidimensional que acompanha pode não ter suas contas absolutamente uniformemente distribuídas ao longo do anel circular (Figura 3c).
Nota: Um script MATLAB para traçar as flutuações em um histograma ou termograma como na Figura 4 está disponível com os autores, mediante solicitação.
Nota: alinhamento fino pode ser realizado dentro de 45 min para o caso de contas MyOne com 7,9 kbp amarras, e em prazos reduzidos para contas menores e amarras mais curtos são empregados (ver Discussão).
Nota: alinhamento fino é normalmente necessária para realizar medições da rigidez de torção de ADN nu ou revestido de proteína (resultados representativos, Figura 4).
4. Medidas de DNA Torque Usando a pinça de torque magnéticos
- Substituir manualmente o ímã cilíndrico que é usado para FOMT por um ímã cilíndrico, mais um ímã lado (permanente) para o MTT (Figura 1c). Esta operação deverá ser realizada de tal maneira que o tirante de ADN seleccionado permanece dentro do campo de visão.
- A maneira mais simples de alcançar este objetivo é adicionar manualmente o ímã lado a sua localização adequada, o que pode ser feito dentro de 1 min. Nenhuma outra realinhamento é necessário.
Nota: Uma alternativa para um íman lateral é a utilizaçãode electromagnéticos 32.
- A maneira mais simples de alcançar este objetivo é adicionar manualmente o ímã lado a sua localização adequada, o que pode ser feito dentro de 1 min. Nenhuma outra realinhamento é necessário.
- Se necessário para análise, calibrar a força de uma maneira análoga à TA, utilizando tanto x do talão ou flutuações ou y, desde que a magnetização da pérola é bem conhecida, usando o conhecimento do gradiente de campo local 21.
- Rastrear as oscilações angulares em função do θ tempo (t), usando o protocolo de acompanhamento baseado fiducial 23 ou, como mostrado no vídeo acompanhante, o protocolo de acompanhamento angular monitorada a (x, y) da posição (ver discussão). No primeiro caso, gravar imagens completas do cordão como uma função do tempo para o processamento de imagem subsequente. Neste último caso, é suficiente para gravar (x, y) as flutuações do talão nesta etapa.
Nota: Um script MATLAB para determinar θ (t) a partir de imagens completas de o talão como uma função de tempo no protocolo de acompanhamento baseado fiducial é umvailable dos autores, mediante solicitação.- Tal como descrito na discussão, para o protocolo de acompanhamento angular monitorada a (x, y) da posição também é aconselhável para gravar um traço do tempo, onde os magnetos estão lentamente (tipicamente a 0,1 Hz) rodado por várias voltas. Isso permitirá um para converter com precisão as coordenadas cartesianas (x, y) em coordenadas polares (r, θ) usando as equações 3-5 da discussão.
Nota: Um script MATLAB para script de acompanhamento angular com base no monitoramento da (x, y)-position está disponível a partir dos autores, mediante solicitação.
Nota: O tempo de medição depende principalmente da resolução torque desejado. Um argumento detalhado é dado em Lipfert et al 24. Para grânulos MYONE e 8 amarras ADN kbp, medindo para 30-100 seg deve ser suficiente para dar uma resolução de torque no intervalo de ~ 1 pN · nm.
- Tal como descrito na discussão, para o protocolo de acompanhamento angular monitorada a (x, y) da posição também é aconselhável para gravar um traço do tempo, onde os magnetos estão lentamente (tipicamente a 0,1 Hz) rodado por várias voltas. Isso permitirá um para converter com precisão as coordenadas cartesianas (x, y) em coordenadas polares (r, θ) usando as equações 3-5 da discussão.
- Determinar a rigidez torcional da armadilha de the variância das oscilações angulares (σ θ 2, em radianos) usando:
k θ = k B T / σ θ 2 (1)
Nota: típicos rigidezes armadilha rotacional obtidos no MTT estão no intervalo de 10-1000 nm pN · / rad, menor do que para uma pinça magnéticos convencionais. - Além disso, registre o z-position do cordão e usar isso para determinar o comprimento corda l (ver também os passos de 2,4-2,7).
- Rodar N vira e novamente gravar θ (t) e L (t).
Nota: A redução da rigidez armadilha de rotação do MTT em comparação com TA torna-o adequado para medições de uma única molécula de binário, mas implica que o binário máximo que pode ser exercida seja reduzida. Isto implica que o MTT pode não ser capaz de compensar binários elevados arrasto causadas por rotação rápida. Cuidados devem ser tomados para não exceder a velocidade máxima; typically girar a taxas próximas a 0,1 Hz. - Determinar o binário acumulado no tirante de ácido nucleico após N espiras usando:
Γ = - k θ <θ N - θ 0> (2)
Onde <...> indica a média e θ 0 e θ N são o ângulo a zero curvas (que corresponde a um grupo de ancoragem à torção relaxado, cf. Passo 2.3 e N espiras, respectivamente. - Repita os passos 4.5 e 4.6, se necessário, a fim de determinar totalmente resposta de torque de uma molécula em uma única corrida de medição (resultados representativos, Figura 6).
Representative Results
Os resultados representativos do MT (Figura 1-A) são mostrados na Figura 2. Figura 2a mostra curvas de extensão de rotação para um DNA 7,9 kb feita em F = 0,25, 0,5, e 2,0 pN. A resposta de um ADN para a rotação deve ser simétrica com as menores forças 0,25 (PN), com a extensão do ADN diminuir como resultado da formação de supercoils plectonemic positivos ou negativos. Conhecimento qualitativo desta resposta é útil quando, inicialmente, à procura de uma corda DNA rotacional restrita (passo 2.1). Observe que a inspecção adicional do tirante é necessária para verificar se ele é composto por uma única molécula de DNA: aqui, a resposta assimétrica de um único ADN para rotação em forças superiores a 0,5 pN ajuda a distingui-lo a partir de vários DNAs (passo 2.1.1). Uma vez que isto tenha sido verificada, retorna-se para a resposta de rotação em 0,25 pN, a fim de determinar o número exacto de voltas íman na qual o ADN de itorção é descontraído, onde se toma uma curva força-extensão, que deve se parecer com a Figura 2 b. Para esta medição particular, um ajuste dos dados para o modelo de cadeia de worm-like (linha contínua) produziu uma cozinha equipada contorno comprimento L C = 2,71 mM e dobra comprimento persistência L P = 45 nm. Para dsDNA, os valores situaram do comprimento persistência deve situar-se na gama de 40-55 nm, dependendo das condições do tampão 33, e o comprimento do contorno ajustado deve ser estreita (tipicamente menos de 10%) para o valor esperado para a construção de DNA que é usado nas medições, utilizando a relação de G ADN = 0,34 nm / pb · número de pares de bases.
A Figura 3 mostra os procedimentos e resultados de alinhamento no FOMT (Figura 1b). As iniciais (x, y) excursões gravados na etapa 3.2 pode ser comparado com o ponto de vista global de flutuações como função of a posição íman transversal mostrada na Figura 3A, que mostra um padrão de "turbilhão" que pode ser usado para guiar o deslocamento relativo posterior entre o íman e talão de ADN-tethered realizada na FOMT. Quando o alinhamento grosseiros subsequente está completa, o talão (x, y)-flutuações traçar uma trajectória circular, como também é mostrado pelo traço negro na Figura 3b. Neste ponto, o torque dos magnetos sobre o eixo z é reduzida ao ponto em que as flutuações térmicas suficiente para rodar o grânulo em torno do seu ponto de fixação. O círculo de raio R do anel circular resultante (círculo montado é mostrado em vermelho) representa a distância radial entre o ponto de fixação do DNA e do centro do cordão (Figura 1b). Como mostrado na Figura 3c, no entanto, um histograma dos dados apresentados na Figura 3b mostra que o alinhamento grosseiros não garante uma cobertura uniformede todas as posições possíveis ao longo do anel circular. Mesmo que as flutuações térmicas são suficientes para explorar todos ângulo rotações no círculo, continua a haver uma barreira de energia de pequeno (da ordem do térmica B energia k T) para uma rotação livre.
Quando o alinhamento mais fino é realizada na FOMT (passo 3.4), o instrumento pode ser utilizado para determinar o módulo de torção de ADN (Figura 4). Em primeiro lugar, o alinhamento fino da amostra é utilizado para obter um movimento circular (Figura 4a), cujo histograma bidimensional deve mostrar uma cobertura uniforme (Figura 4b). O traço correspondente q tempo (t) de flutuações angulares (obtidas a partir da conversão da (x, y)-posições, ver abaixo) mostra nenhuma periodicidade correspondente a 360 ˚ (Figura 4c) e revela grandes passeios correspondentes a várias voltas completas (figura 4d). O panorama energético implicavaé harmônica em uma faixa de> 1.000 ˚ (Figura 4e). O desvio padrão das flutuações é σ θ = 223 °, o que corresponde a uma armadilha rigidez angular do k θ = k B T / σ θ 2 = 0,27 pN · nm / rad, o qual por sua vez, dá uma estimativa do comprimento efectivo persistência de torção de ADN igual a C = G C / σ θ 2 ~ 76 nm (G C = 1,150 nm para o ADN de 3,4 kpb utilizado nesta medição) na força medida.
Um exemplo de como FOMT pode ser utilizado para medir a alteração na torção induzido na molécula de DNA amarrados por meio da ligação das proteínas de 31, 34 é mostrado na Figura 5. Aqui, que acompanhou a ligação da proteína RAD51 dobrarADN de cadeia simples; RAD51 é conhecido tanto alongar e relaxar ADN como forma de um filamento de nucleoproteína 31. Após a lavagem RAD51 na célula de fluxo, observamos que o cordão passa por uma trajetória em espiral no FOMT (Figura 5a). Através da conversão de rastreio de (x, y) de movimento como uma função do tempo de q (t) tal como descrito acima, pode-se co-trama o efeito que tem sobre RAD51 o comprimento do tirante de ADN e do seu grau de desenrolamento (Figura 5b, c) .
Uma abordagem alternativa para medir as propriedades de torção de ADN são o MTT (Figura 1c, a Figura 6). O esquema da Figura 6a ilustra o princípio da medição: após overwinding (ou underwinding) o tirante de ADN por N espiras, o ADN exerce um binário de restabelecimento no talão que leva a uma mudança na posição angular do equilíbrio a partir de 0 a θ θ N. No MTT a componente transversal do campo magnético é reduzida em comparação com o MT, o que facilita a medição de tais mudanças angulares enquanto permite ainda a rotação do grânulo (Figura 1). A magnitude do desvio angular medido após a aplicação de N = 45 voltas com um ADN 7,9 kpb é mostrado na Figura 6b. A sequência completa do protocolo de medição de MTT e o resultado resultante de um binário de rotação em função da curva de ADN são mostradas na Figura 6c-f. Aqui, as medições do desvio padrão (Figura 6c) e a média (Figura 6d) da coordenada angular são mostradas como uma função do excesso de underwinding e, com o desvio padrão de ser inversamente proporcional à rigidez armadilha angular (Equação 1). Tomados em conjunto, estas quantidades permitem construir uma curva de torque versus rotação para ADN (Figura 6f), que deve mostrar uma região de resposta linear centrada cerca de 0 transforma umnd dois planaltos em que os ácidos gordos saturados de binário, em rotações positivas e negativas, respectivamente. Tal curva de torque versus rotação complementa a informação em uma extensão contra curva de rotação (Figura 6e), quantificando assim as transições que acompanham a flambagem e desnaturação de DNA.
Figura 1. Esquemas de pinças magnéticos convencionais (MT), livremente orbitando pinças magnéticas (FoMT), pinças de torque magnético (MTT) e duas estratégias de rastreamento do ângulo de rotação. (A) Em todos os três implementações de pinças magnéticas, esferas magnéticas são amarrados a uma superfície de célula de fluxo por macromoléculas funcionalizados, por exemplo, as moléculas de ADN de cadeia dupla mostrado esquematicamente. Pérolas de referência está ligada à superfície da célula de fluxo e rastreados para drifcorreção t. Todos os três MT set-ups empregar imans para aplicar uma força para cima que se estende sobre o grânulo magnético e, por conseguinte, do tirante de ADN. Em MT convencional, um par de imans exerce um campo magnético que é orientada transversalmente em relação ao eixo do tirante, limitando fortemente a rotação do rolete em torno do eixo de ADN-peia. Em FOMT, um imã em forma cilíndrica fornece um campo magnético que orientado ao longo da direção corda. Quando o tirante está alinhado com o centro do magnete de forma cilíndrica, quaisquer campos transversais restantes são minimizados, o que permite a rotação livre em torno do eixo de precinta em MTT, um íman lado é adicionada ao íman cilíndrico utilizado em FOMT, a fim de proporcionar um pequeno campo transversal (reduzida em grandeza em comparação com MT). Esta pequena área transversal permite a aplicação de binário, bem como a sua medição. (B) Duas estratégias para medir o ângulo de um cordão magnético em torno do eixo de rotação de ADN-de precinta são mostrados. 1): um talão de marcador (cartn) ligado à esfera magnética (castanho) dá uma imagem assimétrica que permite ângulo tracking por imaginar análise. Duas imagens CCD de um grânulo magnético 1,4 mícrons de raio com um marcador fiducial 0,5 mícrons de raio são mostrados, em foco e fora de foco. 2): quando o ADN se encontra presa à esfera magnética numa posição afastada do pólo sul do grânulo, o centro da esfera flutua ao longo de um arco, cujo centro define uma posição angular. De qualquer estratégia pode ser usada para rastrear o ângulo de rotação e para monitorar mudanças na posição de ângulo que a corda está torção tensas (traços à direita), permitindo assim medidas da única molécula de torque.
Medições de calibragem DNA Figura 2. No MT convencional. (A) curvas de rotação-extensão para a DNA 7.9 kb tomada em F = 00,25, 0,5, e 2,0 pN. A resposta assimétrica sob rotação de voltas positivos e negativos de pelas individuais de ADN de cadeia dupla pode ser utilizado como um teste prático da fixação do tirante. (B) da curva da força de extensão de DNA para um 7.9 kb, juntamente com um encaixe para o verme como modelo de cadeia (linha contínua), produzindo uma cozinha equipada contorno comprimento L C = 2,71 mM e dobra persistência comprimento L P = 45 nm. Todas as medições foram realizadas em tampão PBS.
Figura 3. Alinhamento no FOMT. (A), (x, y) as flutuações de grânulo de DNA-tethered realizada na FOMT como uma função da posição do íman. A posição do íman cilíndrico foi digitalizada a uma altura constante de 3 mm em toda a superfície da célula de fluxo, em passos de 250 um em xe
Figura 4. Medição da rigidez à torção do ADN usando FOMT. (X, y)-trajectória (um) e um histograma (b) de um DNA-tethrado flutuações do cordão após o alinhamento fino da posição ímã-corrente relativa no FOMT. Sob estas circunstâncias, o histograma revela uma cobertura essencialmente uniforme das posições sobre o círculo. (C) as flutuações de rotação do cordão determinada a partir da (x, y)-posições. (D) Histograma das flutuações de rotação. A linha vermelha é um ajuste Gaussian com σ ° θ = 223. (E) O panorama energético implicado pela densidade de flutuação de rotação a partir de (c) e (d). A diferença entre a paisagem de energia implícita pelas flutuações de rotação e uma aproximação harmônica (com k θ = k B T / σ θ 2 = 0,27 pN-nm/rad) é muito menor do que a energia térmica B k T ao longo de várias voltas. Os dados são deslocados para clareza de modo a que θ 0 = 0. A larguraas flutuações podem ser usadas para determinar a rigidez à torção do ADN, ver texto principal. A medição foi realizada em tampão de PBS a uma força de alongamento de ~ 1 pN. Os dados são adaptados de Lipfert et al 21.
Figura 5. A ligação da proteína ao ADN RAD51 medido usando FOMT. (A) Assembleia da proteína RAD51 em um tethered 7,9 kbp dsDNA monitorados em 3,5 pN. O (x, y, z)-trajectória executado pelo grânulo magnético (diâmetro 1,0 mm), durante os primeiros 200 segundos de o conjunto é mostrado, com o tempo, um código de cores de azul para vermelho. (B) A extensão da dsDNA deduzida da componente z da trajectória do grânulo em (a) como uma função do tempo. (c) O ângulo de rotação em torno do eixo do tirante dsDNA deduzidasde x, y componentes da trajectória do grânulo em (a) como uma função do tempo.
Figura 6. Medições do torque de um único tirante ADN no MTT. (A) esquemático mostrando o princípio da medição do binário. Após o excesso de (ou sub-) enrolamento do cordão de ADN por N espiras, o ADN exerce um binário de restabelecimento no talão que leva a uma mudança na posição angular do equilíbrio a partir de 0 a θ θ N. (B) Exemplo de vestígios ângulo utilizados para medir o binário:. flutuações angulares de um cordão amarrado a uma molécula de DNA 7,9 kbp torção relaxado antes (azul) e após a introdução de 40 voltas (vermelho escuro) (cf) de medição de torque em uma molécula de DNA 7,9 kbp em tampão PBS realizada em uma ruavomitando força de ~ 3 pN usando o talão marcador fiducial baseada em protocolo de rastreamento angular. Oscilações angulares como mostrado em (b) foram registadas como uma função do número de voltas aplicadas. (C) O desvio padrão das variações angulares como uma função de voltas aplicadas. A largura das oscilações é aproximadamente constante, indicando constante de rigidez angular armadilha. (D) A mudança no ângulo de rotação significativo como uma função de voltas aplicadas. Desvios sistemáticos do ângulo significativo sobre o excesso de e underwinding são aparentes. (E) o prolongamento do tirante ADN monitorizados simultaneamente como uma função de voltas aplicadas. (F) O binário exercido pelo tirante de ADN determinadas a partir do ângulo médio mostrado em (d) , veja o texto principal. Over-e underwinding voltas em torno de zero dá origem a um binário de contra linear transforma resposta do ADN-tirante (pistas cinzentos montados ião (d) e (f)) que podem ser usadas para determinar o comprimento efectivo de persistência de torção (~ 77 nm para este conjunto de dados). Além disso overwinding leva a flambagem e formação de supercoils plectonemic (esquematicamente mostradas nas inserções), correspondendo a um platô de torque (linha preta na volta positivos em (f) em ~ 26 pN · nm) e uma redução linear da extensão corda com o número de de voltas (declive preto em (e)). Desenrolamento além do regime linear faz com que o DNA para derreter localmente (mostrado nas inserções no lado esquerdo), marcada por um patamar de binário igual ao binário de fusão (linha preta em voltas negativas em (f) em ~ -11 pN · nm).
Discussion
Ao executar experimentos usando o MTT ou o FOMT, uma série de escolhas precisam ser feitas em relação a contas, ímãs, protocolos de rastreamento, etc Os melhores escolhas a serem feitas dependerá da experiência de seu interesse. A seguir, descrevemos os trade-offs que acompanham diferentes opções, o que deve facilitar a seleção para uma experiência particular. Em seguida, descrevem vários passos críticos que acompanham o alinhamento e execução de experimentos de MTT e FoMT. Finalmente, discutiremos o significado do MTT e FOMT no que diz respeito aos métodos existentes, bem como aplicações futuras.
Considerações antes do início de MTT e FoMT Experimentos
Qualquer experimento requer um para selecionar um tipo de grânulo magnético para uso. Pode-se escolher entre várias contas comercialmente disponíveis revestidas de estreptavidina superparamagnéticos, por exemplo, 0,25 mM esferas de raio, 0,5 mM esferas de raio, ou 1,4 mM esferas de raio (see tabela de Materiais). Grânulos maiores terão um maior momento magnético em comparação com grânulos menores (cerca de escala dado que o volume) e, por conseguinte, a sua utilização irá facilitar a aplicação de forças mais elevadas (por forças típicos obtidos nos instrumentos, ver Tabela 1). Quando o rastreamento angular usando pérolas marcador é desejada, que normalmente trabalham com 1,4 mM raio e usar 0,5 um raio contas biotinilados não magnéticos como contas do marcador (ver ponto 1.9 para o protocolo anexo correspondente). O uso de pequenos grânulos é particularmente recomendada para a FOMT, como a escala de tempo característico para τ rotação cordão C é igual à proporção de arrasto do sistema sobre a sua constante de mola θ γ / k; importante, o coeficiente de arrasto de rotação relevante para as escalas de tempo de medição escala angular que ~ R talão 3, ou seja, com a terceira potência do raio (ver Tabela 2 parao tempo característico escalas para várias combinações de ADN grânulo em FOMT e medições de MTT). Reduções concomitantes na força máxima que pode ser aplicada pode ser endereçada através da utilização de uma pilha invertida de imans cilíndricos 27. No entanto, em medições FoMT que por vezes pode ser necessário compromisso entre a melhor resolução temporal possível, e a força máxima aplicada.
Além disso, uma experiência exige a selecção de uma configuração do íman. Na configuração convencional pinças magnéticos (figura 1a), que tipicamente utilizam um par de 5x5x5 mm imans cúbicos na orientação vertical, com um intervalo de 0,5 ou 1 mm entre os imans 4. Quando os ímans são espaçadas ao longo do eixo x (y), este gera um campo magnético que é dirigido principalmente ao longo do eixo x (y). Para experiências FoMT, um ímã de forma cilíndrica é selecionado em cujo centro o campo magnético é direcionado principalmenteao longo do eixo z (Figura 1b). Na prática, usamos uma pilha de três desses ímãs em forma cilíndrica, cada um com um diâmetro de 6 mm e um furo central 2 mm de diâmetro, para uma espessura total de 6 mm. Quando as forças que puxam mais elevados são desejados, uma "pilha capotou" configuração ímã em que o ímã de fundo é empilhado com magnetização oposta é o preferido. Para conseguir a configuração de MTT (Figura 1c), adiciona-se um magnete adicional para o lado da pilha principal íman da configuração FOMT, tipicamente um cilindro sólido com o diâmetro de 4 mm e uma altura de 7 mm. Para ver como as forças máximas alcançadas em nossos instrumentos dependem da configuração ímã, ver Tabela 1.
O Alinhamento de MTT e FoMT Experimentos
Uma vez que as esferas magnéticas têm uma superfície (aproximadamente) uniformemente funcionalizado (tipicamente estreptavidina) e uma vez que a ligação de ambos o n funcionalizadoamarras ácido ucleic e grânulos do marcador (no caso de ser utilizado o rastreamento angular à base de talão marcador) ocorre por meio de incubação em solução simples, não se controlar onde o tirante e / ou marcador de talão anexar à esfera magnética. As pérolas magnéticas têm um eixo de magnetização preferido que tende a alinhar ao longo da direcção do campo externo. Se denotamos os pontos onde o eixo de magnetização preferido cruza a superfície da pérola como os pólos norte e sul, em seguida, contas em que o DNA-corda está ligado perto do equador vai traçar um anel circular com um raio próximo ou ligeiramente maior do que o raio talão no FOMT; em contraste, contas que estão ligados perto do pólo sul vai flutuar em um anel circular com raio muito pequeno no FOMT, o que pode impedir a montagem do círculo usando Equações 3-5. Notamos que por simples geometria esférica, a probabilidade de prender perto do equador é muito maior do que um anexo exatamente nos pólos; portanto, mais bEADS vai ser amarrado de tal forma que o rastreamento angular (x, y) com base em pode ser realizada com sucesso.
Um argumento similar vale para a fixação das esferas marcador para o rastreamento angular marcador baseado fiducial. O grânulo marcador é utilizado para criar uma assimetria na imagem do grânulo magnético que permite a captação de ângulo. Se o talão marcador está ligado exatamente no pólo norte ou sul do cordão (ou seja, diretamente na parte superior ou na parte inferior), a imagem resultante é ainda rotacionalmente simétrico eo protocolo de rastreamento angular falhar. No entanto, o mesmo argumento geometria esférica, a chance de um talão marcador para anexar diretamente para um dos pólos é relativamente pequeno; vemos que na prática a maioria das contas de marcadores dão uma assimetria suficiente para permitir rastreamento angular. Finalmente, observamos que nas pinças magnéticos convencionais a direção do campo está no (x, y)-plano; por conseguinte, o eixo de magnetização preferidas do talão irá alinhar em the (x, y) de plano e os pólos norte e sul, como definido acima, vão ser nos lados do cordão, improvável a situação na FOMT ou MTT, em que os postes são na parte superior e na parte inferior.
Em experiências FoMT, um passo crítico é o alinhamento do íman cilíndrica de tal modo que o campo magnético radial é negligenciável na proximidade do rebordo. Este alinhamento é realizado por uma única pérola de cada vez. Para avaliar se o movimento do grânulo no FOMT é distribuída uniformemente ao longo de um anel circular, o tempo de medição deve exceder 20 · τ C. Como τ C é igual a 45 ~ s por 8 kpb de ADN e um talão de raio 0,5 milímetros, o tempo de medição é de aproximadamente 900 segundos nas fases finais de alinhamento. Para efeitos de comparação, a utilização de 1,9 kpb de ADN e 0,25 milímetros de raio grânulos reduz τ C vinte vezes a ~ 2 segundos (ver também a Tabela 2).
Etapas críticas e considerações para Rastreamento Durante FOMT e MTT Experimentos
Para controlar as flutuações do talão em plano, isto é, o seu (x, y) da posição, que emprega uma análise de correlação cruzada dos perfis de intensidade exibidos por um cordão em intervalos de tempo subsequentes 35, 36. Esta pode ser levada a cabo a resolução de sub-pixels, com uma precisão de poucos nanómetros 20. Para controlar o movimento do cordão em z, que tipicamente utilizam um método de primeira concebido por Gosse e croquete, em que plano focal da objectiva (OFP) é deslocada com precisão na direcção vertical, enquanto a imagem dos anéis de difracção do cordão ligado ao ácido nucleico 20 . Deste modo, um perfil de calibração é gerado correlacionar o padrão de difracção do grânulo com a distância entre o rebordo e o OFP 19. Quando este perfil calibração é interpolada, os deslocamentos verticais do cordão também pode ser medida com uma precisão de até alguns nm 20.Nós nos referimos ao leitor referências adicionais que descrevem algoritmos mais refinadas de rastreamento 37, 38, bem como a sua aplicação para monitoramento de múltiplas contas de 5, 6, 37 paralelos.
Ao usar o rastreamento angular que depende da conversão de (x, y) posições em coordenadas angulares, aconselha-se proceder da seguinte forma. A partir de um traço do tempo em que o talão traça um anel circular, utilize o (x i, y i) posições (onde o índice i denota pontos de medição subseqüentes) para ajustar o centro do círculo (x 0, y 0) e raio do círculo R (Figura 2a), minimizando:
(3)
em que a soma é executado ao longo de todos os pontos de dados. Após Fitting x 0, y 0, e R círculo, determinar as coordenadas polares (r i, θ i) de cada ponto de dados no traço do tempo usando:
(4)
(5)
Note-se que deve-se tomar cuidado para "desembrulhar" o ângulo θ, ou seja, adicionar saltos de fase de ± π se for o caso. O código personalizado escrito para a instalação e conversão de (x, y) a (r, θ) coordena está disponível a partir dos autores, mediante solicitação. No FOMT, um tempo de rastreio em que o grânulo traça um anel circular pode ser obtida através da realização de alinhamento grosseiros (cf. passo 3.3) e gravando as flutuações térmicas do talão. No MTT, flutuações térmicasções são insuficientes para traçar o anel circular; em vez disso, use um traço do tempo em que os ímãs são lentamente (tipicamente de 0,1 Hz) rodado por várias voltas para ajustar o círculo usando Equações 3-5.
Fazemos notar que, para o MTT, é importante escolher a aproximação seguindo angular adequada, ou seja, através de um marcador de seguimento angular (Figura 1c, Fig. 1d, Figura 3a), ou através da conversão de (x, y) em posições coordenadas angulares ( Figura 1d, Figura 2b). Embora tipicamente a precisão da localização angular de (x, y)-posições e o uso de contas de marcadores são comparáveis, é importante perceber que a diafonia ocorre entre as flutuações de um grânulo em (x, y) e em ângulo, como descrito em Janssen et al 32: assim, rastreamento angular de (x, y) posições só é válido desde que as flutuações browniano em (x, Y) contribuem apenas de forma insignificante para a incerteza na coordenada angular, e seu uso adequado de (x, y)-tracking pode exigir ajuste da rigidez armadilha de rotação através de ajuste da posição do ímã lado. Tipicamente, o uso de uma maior rigidez armadilha requer o uso de rastreamento angular utilizando esferas marcadoras. O uso de grânulos de marcador requer um passo adicional de fixação, o que pode reduzir o número de amarras utilizáveis (ver o protocolo de ligação em fase 1.9). Ao utilizar o seguimento com base em grânulo marcador, é importante seleccionar os grânulos magnéticos que têm um rebordo marcador é ligado perto do equador para obter os melhores resultados.
Significado do FOMT e MTT Abordagens Em comparação com os métodos existentes e Aplicações
No exemplo acima, nós mostramos como se pode, a partir MT convencional, facilmente modificar as configurações de ímã para converter o instrumento em MTT ou FOMT. Este m simplesODIFICAÇÃO, que pode ser acompanhada pela introdução de rastreamento angular quando a utilização de um marcador de seguimento angular é desejado, é um ponto forte imediata de duas configurações, uma vez que permite ao utilizador aplicar o torque, medir o binário, ou medir a torção de acordo com a experimentar na mão. Como mencionado na introdução, tanto FOMT e MTT benefício de muitos dos pontos fortes existentes de MT, nomeadamente a sua simplicidade, com o MTT, em especial, beneficiando também a capacidade de medições paralelas 5, 6 (estes não são tão facilmente alcançado em FOMT dado o requisito de alinhamento do tirante em relação ao centro do íman cilíndrico). Notavelmente, MTT e FOMT não exigem, em contraste com outras técnicas, especialmente fabricado nano-partículas de 22, 39, 40, design óptico complexo 41, ou a introdução de contas adicionais no tethered (DNA) molécula 42. Tal outras técnicas no entanto pode fornecer outras vantagens, tais como maior resolução temporal 27, 43, 44. Ambos FOMT e MTT deve encontrar futuras aplicações no estudo do processamento do genoma, como o comportamento dos motores moleculares no DNA é tanto influenciado e tem consequências para a torção e torque local. Aplicações adicionais podem ser encontradas no campo emergente da nanotecnologia DNA 27 ou no campo mais vasto de motores rotativos activados no processamento biológico 7, 45.
| M270 (R talão = 1,4 mM) | MyOne (R talão = 0,5 micron) | Ademtech (R talão = 0,25 mM) | |
| Convencional MT (par de 5 x 5 cúbicos x 5 mm 3 ímãs, 1mm lacuna, o alinhamento vertical) | 70 pN | 8 pN | 1.6 pN |
| FOMT ou MTT * (pilha de três ímãs cilíndricos, 6 mm de diâmetro, 2 lacuna diâmetro mm) | 9 pN | 1 pN | 0,2 pN |
| FOMT ou MTT * (pilha de três ímãs cilíndricos, 6 mm de diâmetro, 1 lacuna diâmetro mm) | 18 pN | 2 pN | 0,4 pN |
| FOMT ou MTT * (pilha de três ímãs cilíndricos com última capotou, gap diâmetro de 1 mm) | ~ 50 pN | 9 pN | 1,8 pN |
* A presença do pequeno íman no lado do MTT tem um efeito insignificante sobre a força de alongamento
Tabela 1. Forças máximas tipicamente alcançado para diferentes configurações de ímã e tipos de contas.
| R = 1,4 mM talão | R = 0,5 um talão | R talão =0,25 mM | |
| Coeficiente de atrito * | 120 pN · nm · sec | 5,5 pN · nm · sec | 0,7 pN · nm · sec |
| Escala de tempo característica: FOMT, 10 kbp DNA ** | 1.200 sec | 55 seg | 7 seg |
| Escala de tempo característica: FOMT, DNA 1 kbp | 120 seg | 5.5 sec | 0,7 seg |
| Escala de tempo característica: MTT, k q = 100 pN · nm / rad | 1.2 sec | 0.06 sec | 0.007 sec |
| Escala de tempo característica: MTT, k q = 1000 pN · nm / rad | 0,12 seg | 0,006 s = 6 ms | 0,0007 s = 0,7 ms |
* Coeficiente de atrito para rotação em torno de um eixo através do "equador" (isto é a situação mostrada na Figura 1b), Dada por p 14 · · · h R talão 3, onde h é a viscosidade do tampão.
** No FOMT, a rigidez armadilha de rotação é dada pela rigidez à torção do ADN, k q, ADN = C · k B T / L C, em que C é o comprimento eficaz persistência de torção, assumida como sendo de 80 nm aqui ( o que é característico de um regime de força intermediária, F ~ 1 pN) e G C é o comprimento do contorno do DNA, 0,34 nm por par de bases.
Tabela 2. Coeficientes de fricção e tempo característico escalas para FOMT e MTT.
Disclosures
A patente relacionada com este trabalho foi apresentado com a referência PCT/NL2011/050446.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela TU Delft, a Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO), a Fundação para a Investigação fundamental sobre a matéria, e pela Fundação Europeia da Ciência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
| Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
| Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
| Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
| Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
| Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
| Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
| Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
| Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
| Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
| Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
| Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
| High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
| Software for coding analysis routines | The Mathworks | MATLAB | custom-written routines are available from the authors |
References
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