Summary
Manuskriptet beskriver trinnene som kreves for å utføre heterotop hjertetransplantasjon i musen.
Abstract
Det er nå over førti år siden denne teknikken først ble rapportert av Corry, Wynn og Russell. Selv om det tok noen år for andre laboratorier for å bli dyktigere i og utnytte denne teknikken, er det nå mye brukt av mange laboratorier rundt om i verden. En betydelig raffinement til den opprinnelige teknikken ble utviklet og rapportert i 2001 av Niimi. Beskrevet her er de teknikkene som har utviklet seg over mer enn et tiår i hendene på tre kirurger (Plenter, Grazia, Pietra) i vårt senter. Disse teknikkene blir nå sendt videre til en yngre generasjon av kirurger og forskere.
Stor grad basert på Niimi erfaring, har de prosedyrene som brukes utviklet seg i de fine detaljene - detaljer som vi vil forsøke å forholde her på en slik måte at andre kan være i stand til å bruke dette svært nyttig modell. Som Niimi, har vi funnet ut at en video hjelpemiddel til læring er en uvurderlig ressurs for nybegynnere.
Introduction
I en tid da det er mulig å utføre nyre, lunge, lever og bukspyttkjertel transplantasjoner i mus, hjørnesteinen i grunnleggende organtransplantasjon og immunologi forskning siden 1973 1-4 forblir heterotop hjertetransplantasjon modell i musen. I de mellomliggende årene har flere artikler er publisert detaljering forbedringer / avgrensninger 5,6 til denne prosedyren.
Som en modell av solid organ primært vaskualisert transplantasjon denne prosedyren er uten sidestykke. Når mestret denne prosedyren gir seg til forskning på allogene avvisning svar 7, utvikling av kroniske vaskulitter 8 og mekanismene for iskemi reperfusjonsskade ni.
Nøklene til vellykket læring denne prosedyren er akkurat som alle andre kirurgi, tålmodighet på den delen av instruktør og trainee og oppmerksomhet på detaljer. Ved begynnelsen av prosessen den nye kirurgen vil finne at thei vil tilbringe mange timer på hver transplantasjon. Som man får erfaring, vil kirurgiske ganger, og derfor iskemi, drastisk redusere. Betalende oppmerksomhet til detaljer om hvert trinn vil før eller senere føre til suksess.
Mens instruktør kan gjøre sitt beste for å passere på, og å forutse, alle mulige pit faller som kan oppstå under disse operasjonene, vil den "kreative" trainee sannsynlig finne noen av sine egne!
Det grunnleggende prosedyren er som følger. Giveren stigende aortabuen er ende-til-side anastomoseres til mottakeren abdominal aorta og donor lungearterien er ende-til-side anastomoseres til mottakeren abdominal inferior vena cava (IVC). Blod flyter fra mottakeren aorta i retrograd mote gjennom donor aorta til koronararteriene. Når blodet har strømmet gjennom koronar-systemet det renner inn i det høyre atrium via den koronare sinus, er pumpet inn i den høyre ventrikkel ogderetter via lungearterien inn i mottakeren IVC. På denne måte kan koronar-systemet tilføres arterielt blod og sinusrytme returnerer til pode innen 1-2 min av reperfusjon. Siden venstre hjertekamrene er i hovedsak trykket under belastede venstre ventrikkel fri vegg vil bli svekket over tid.
Protocol
Alle dyrene ble plassert under patogen frie forhold ved University of Colorado Barbara Davis senter Animal fasilitet på IACUC godkjenning og tatt vare på i henhold til NIH retningslinjer.
Anestesidybden er dømt etter tå klype i første omgang og ved overholdelse av pusterytme når prosedyren har begynt.
En. Donor Hjerte Harvests
- Anesthetize donor mus ved injeksjon av pentobarbital (60 mg / kg IP).
- Immobilisere musen ved 4-veis begrensninger og klippet pelsen. Tørk huden med alkohol.
- Etter dissekere bort huden, åpne bukhulen ved å gjøre et tverrgående snitt bare dårligere til mellomgulvet.
- Kutt membranen posterior til kyst innsetting og løft den fremre brystveggen anteriorly og overlegent utsette hjertet.
- Extend en full tykkelse kuttet opp bakre laterale brysthula på venstre og høyre side av brystet.
- Isolerinferior vena cava (IVC) og plassere en løs 5-0 silke sutur rundt IVC nær dens innsetting i høyre forkammer.
- Injiser 1,0 cm på 4 ° C heparinisert saltvann (200 u / ml) inn i IVC, så ligere fartøyet med 5-0 silke sutur og deler seg.
- Isoler riktig superior vena cava (rSVC) på lignende måte og ligate med 5-0 silke sutur og dividere.
- Forsiktig rulle hjertet mot dyrenes høyre side og isolere venstre superior vena cava (lSVC), ligate med en 5-0 silke sutur og dele utsette venstre lungearterien.
- Sikre hjertet under en våt gasbind mens thymus blir sløv dissekert bort fra de viktigste lungearterien (PA), og venstre og høyre PA grener og stigende aorta bue.
- Blunt dissekere aortabuen fri for de omkringliggende vev. Mikro-saks brukes til å dele aorta proksimale til høyre brachialis-cephalic arterie, dvs. det bør ikke være noen grener mellom hjertet og divisjonenpunkt av aorta.
- Denne delen av aortabuen danner arterielle mansjetten til implantat prosessen.
- Reflekter aortic mansjetten inferiorly å eksponere PA bagasjerommet og venstre og høyre grener av PA.
- Blunt dissekere venstre og høyre PA greiner vekk fra de omkringliggende vev som langt fra hjertet som mulig. Dette gir enkel disseksjon av PA stammen fra omkringliggende vev.
- Fordel PA stammen som distalt som mulig, bare proksimale til sin bifurkasjon. Denne seksjon av lungearterien danner venøs mansjetten for implantatet prosessen.
- Plasser en 5-0 silke sutur rundt bunnen av hjertet og slips. Hjertet blir deretter skåret fri ved basen, og plassert i 4 ° C saltoppløsning. Total tid for innhøsting er ca. 10-15 min.
2. Hjerte Implant Teknikk
- Anesthetize mottaker mus med pentobarbital (60 mg / kg IP initial dose, 25 mg / kg IP supplerende dose om nødvendig).
- Klem pels ogimmobilisere musen ved 4-veis begrensninger og prep huden med povidonjodid og drapere i et sterilt mote.
- Lag en 2 cm midtlinjen vertikal abdominal snitt og inn i bukhulen.
- Trekk tarmen overlegent og eksternaliserte videre til brystet. Hold innpakket i steril fuktig gasbind (sterilt saltvann) gjennom hele saken.
- Isoler abdominal aorta og vena cava inferior (IVC) under nyre fartøy og plasserer 4-0 bomullsbånd rundt aorta og IVC overlegen da dårligere enn anastomosestedet.
- Identifisere eventuelle lumbale fartøy innenfor feltet og ligate med 10-0 nylon sutur.
- Knyt bomull bånd, først mindreverdig etterfulgt av den overlegne. På denne måten kan noe blod beholdes i aorta gjør aortotomy enklere.
- Danne aortotomy med en 30 G nål å gå inn i lumen av aorta. Utvid snittet med fine mikro saks til en lengde på ca 2 mm. Dette snitt er gjort i en rett linje langs den langeitudinal akse av fartøyet.
- Foreta en ende til side anastomose av donor aorta til mottakeren aorta på følgende måte. Plasser en 10-0 nylon sutur opphold sting i donor aorta og til dårligere vinkel av snittet i resipienten aorta og slips. Sett en annen 10-0 nylon motsatt den første i donor aorta og den overlegne hjørne av snittet i abdominal aorta og slips.
- Foreta en løpende sutur linje fra overlegen underlegne i den laterale veggen i aorta, og tie mot tidligere plassert opphold søm. Pass på å bringe intimas (indre kar overflaten) sammen som du syr. Deretter sy den mediale side i en løpende mote og slips. Den første og siste masken på hver side bør plasseres så nær oppholdet masker som mulig. Deretter tar sikte på å ha tre jevnt fordelt masker mellom disse to gjør til sammen fem sting.
- Gjør slutt på side anastomose av donor lungearterien til mottakeren IVC i følgende moten. Puncture den IVC med en 30 G nål og forlenge snittet for ca. 2 mm med fine mikro saks. Dette snitt er gjort i en rett linje langs den langsgående akse av fartøyet.
- Knyt donor lungearterien til mindreverdig hjørne av snitt i IVC med 10-0 nylon. Sett en annen 10-0 nylon motsatt den første i donor arterien og overlegen hjørne av snitt i IVC og slips.
- Foreta en løpende sutur linje mellom lungearterien og IVC og slips. Den første og siste masken på hver side bør plasseres så nær oppholdet masker som mulig. Deretter tar sikte på å ha fem jevnt fordelt masker mellom disse to gjør til sammen syv sting.
- Slipp distal 4-0 bomull tie reetablere venøs flow.
- Etter hemostase av venøs anastomose Det er observert proksimale 4-0 bomullsbåndet er gradvis løsne og arterielle anastomose observert for hemostase. Når begge anastomoser anses sikrere, fjerne cotton binder fra musen.
- Returner tarmen til magen. Bukveggen er stengt i to lag som bruker 5-0 Silke sutur i en løpende mote.
- Administrer en 1,0 ml bolus av steril, varm normal saltoppløsning i bukhulen som gjenopplivning ved lukking, og 0,8 ml av normal saltløsning injiseres subkutant post-operativt. Det kreves ingen andre støttetiltak under operasjonen. Gjenopprette dyret på en varmende teppe. Total implantat Tiden er ca. 90-120 min for nybegynnere, 45-60 min med erfaring. Administrer buprenorfin analgesi, 0,05 mg / kg, SC, 0,1 til 0,2 ml ved begynnelsen av fremgangsmåten, og hver 6-12 timer etter 72 timer etter operasjonen.
Tre. Graft vurdering
- Vurdere organfunksjon daglig av trans-abdominal palpasjon.
- Hold musen som om det skulle bli gitt en intraperitoneal injeksjon.
- Trykk forsiktig på tuppen av en pekefinger mot bukveggen og konstatere juling strength og regulariteten i pode.
- Gi palpasjon kvalitet en score fra 4 (normal styrke og frekvens) til 0 (ikke-juling avvist graft).
VIKTIGE MERKNADER:
Alle instrumenter som er sterilisert, sterile hansker er benyttet i den fremgangsmåte og et sterilt område opprettholdes. De donor-og mottaker-operasjoner utføres ved bruk av et operasjonsmikroskop. Sørg for at de anastomoser er "ren". Det vil si at bakveggen ikke er fanget når du plasserer masker. Dette vil føre til en betydelig innsnevring til å flyte som vil mer enn sannsynlig resultere i en mislykket pode og i ekstreme tilfeller å hind-lem lammelse. Det er også av stor betydning at full tykkelse passerer herunder det vaskulære adventitia og det indre av sutur nålen er oppnådd. Evertion av kantene sikrer også at det er intima-til-intima kontakt, som hjelpemidler i tetting og helbredelse av anastomoser. Et annet svært viktig faktumeller er å sikre at spenningen i anastomotisk suture linjene er også optimal. For løst, og det vil være irreversible lekker, strammer og striktur å flyte vil medføre. Hvis på den arterielle siden dette vil føre til dårlig blodgjennomstrømming i pode, hvis på venelaget belastet hjerte vil medføre.
Representative Results
Utnyttelsen av denne operasjonsteknikk åpner veien for enten enkle transplantatoverlevelse / avvisnings studier, eller ganske kompliserte eksperimentelle protokoller. I studien kort beskrevet på figuren nedenfor, søkte vi å definere involvering, om noen, av Fas-og / eller perforin som mekanismer for CD4 T-celle mediert avvisning hjertestans. Dette ble gjort mulig av ekstraordinær rekke musestammer som er tilgjengelige i dag. Resultatene viser at den direkte avvisning av hjerte allografts ved CD4 effektor T-celler krever alternative bidrag pode Fas uttrykk og T-celle perforin uttrykk. Så vidt vi vet, er dette den første demonstrasjonen som cytolytisk aktivitet ved CD4 T-celler kan spille en obligat rolle for primær akutt rejeksjon ved vivo.
1.jpg "/>
. Figur 1 perforin og Fas Representer obligat og parallell Pathways of CD4 T-celle-mediert Cardiac Avslag B6, B6 PFPKO (perforin knock-out), og B6 GLD (Fas-ligand mangel) CD4 T-celler ble brukt til å rekonstituere B6 fille - / - mottakere av C3H vill type eller Fas-mangel C3H lpr hjerte allografts. Fjerning av Fas alene (♦, p = NS vs kontroll Wt C3H + B6 CD4 T-celler) fra donor hjerter eller fjerning eller perforin alene fra de CD4 T-celler (■, p = NS vs kontroll Wt C3H + B6 CD4 T celler) ikke oppheve avvisning. Interessant nok fjerning av Fasl fra effektor-CD4 T-celler gjorde forsinkelse avvisning signifikant (●, p <0.02 vs Wt C3H + B6 CD4-T-celler, p <0.01 vs Wt C3H + B6 PFPKO CD4-T-celler, og p <0.01 vs . C3H lpr + B6 CD4 T-celler). Imidlertid ble de fleste allografts fortsatt avvist (4 av 5). Betydelig, den samtidige fjerning av både donor Fas-og CD4 T-celle perforinhelt avskaffet avvisning (○, p <0,002 vs kontroll Wt C3H + B6 CD4 T-celler, Vekt C3H + B6 PFPKO CD4 T-celler, og C3H lpr + B6 CD4 T-celler). Dette oppheving var betydelig mer robust enn den enkelte fjerning av CD4 T-celle Fasl (○, p <0,003 vs kontroll Wt C3H + B6 gld CD4 T-celler). Fra Grazia et al 10. Gjengitt med tillatelse.
Discussion
Det kirurgiske teknikken er ikke lett å mestre, men når de mestrer er en kraftig forskningsverktøy. Forskeren / kirurgen er belønnet med konsistens av teknikk og av oppmerksomhet på detaljer. Tålmodighet under læringsfasen er nøkkelen. Som publisert av Niimi 3, ved hjelp av et videobasert læremiddel det tar et gjennomsnitt på 11 forsøk på å oppnå den første vellykkede fremgangsmåten og 78 forsøk på å oppnå en 90% treff. Videoer har blitt et viktig verktøy i undervisningen i kirurgi 11,12.
Feilsøking
Blødning fra anastomoser kan forekomme, og dette er trolig på grunn av enten mangel på riktige draget i sting, eller for få sting. Mens en blodpropp induserende middel som Gelfoam kan være nyttig for å redusere lekkasjer, anbefaler vi at kirurgen bør stole på god teknikk. Congested ikke-bankende hjerte er som oftest på grunn av anastomoser som er for stramt, spesielt på venesiden. En ikke-beating, er ikke-perfunderte pode ofte forårsaket av en luftboble som har beveget seg til en av de koronare arteriene. Det er viktig å opprettholde et damp-til-vått-feltet for å unngå inngang av bobler inn i fartøy.
Begrensninger av teknikken
Denne teknikken er ikke egnet hvis en forsker ønsker å undersøke effektene på en fullt fungerende hjerte. Det ville kreve en orthotopic transplantasjon teknikk, som hittil har vist seg umulig å utføre.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Dersom man ønsker å studere effekter på en fullt vaskularisert, solid organtransplantasjon hos mus, så hjertet modellen er trolig den enkleste å mestre. Musemodeller av lunge, nyre-og levertransplantasjon finnes, men er mye vanskeligere å lære og perfekt.
Kritiske trinnene i protokollen
Det er viktig at full tykkelse passes deriblant vaskulære adventitia og det indre av sutur nålen er oppnådd. Evertion av kantene sikrer også at det er intima-til-intima kontakt, som hjelpemidler i tetting og helbredelse av anastomoser. En annen svært viktig faktor er å sikre at spenningen i anastomotisk suture linjene er også optimal. For løst, og det vil være irreversible lekker, strammer og striktur å flyte vil medføre. Hvis på den arterielle siden dette vil føre til dårlig blodgjennomstrømming i pode, hvis på venelaget belastet hjerte vil medføre.
Fremfor alt vil repetisjon, konsistens av prosedyre og kontinuerlig oppmerksomhet på detaljer gi gode resultater og fundable og publiserbare data.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke dr. Biagio Pietra for sitt tidligere arbeid i vår lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5 m spool | 18020-50 | ||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Biogel from Medex Supply | ||
| Drapes | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | B-D 1 cc insulin, #329424 | ||
| Cotton applicators | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | PDI, #B40600 | ||
| 4/0 Cotton ties | Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343 (1973).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).
- Su, S., et al. Modified suture technique in a mouse heart transplant model. Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).
- Mao, M., et al. A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice. J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).
- Csencsits, K. L., Bishop, D. K. Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction. Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).
- Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H.
- Grazia, T. J., et al. Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin. Transplantation. 89 (1), 33 (2010).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Plenter, R. J.
