Two-Photon In vivo Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

Summary

L'imaging time-lapse nell'animale vivente fornisce informazioni preziose sulla riorganizzazione strutturale nel cervello intatto. Qui, introduciamo una preparazione di cranio assottigliato che consente l'imaging transcranico di strutture sinaptiche marcate in fluorescenza nella corteccia di topo vivente mediante microscopia a due fotoni.

Abstract

Nella corteccia dei mammiferi, i neuroni formano reti estremamente complicate e scambiare informazioni a livello delle sinapsi. I cambiamenti della concentrazione sinaptica, nonché aggiunta / rimozione di sinapsi, si verificano in modo dipendente dall'esperienza, fornendo la base strutturale di plasticità neuronale. Come componenti postsinaptici delle sinapsi più eccitatori nella corteccia, spine dendritiche sono considerati un buon indicatore di sinapsi. Prendendo vantaggi della genetica del topo e tecniche di etichettatura fluorescenti, i singoli neuroni e le loro strutture sinaptiche possono essere etichettati nel cervello intatto. Qui vi presentiamo un protocollo di imaging transcranica con due fotoni microscopia a scansione laser per seguire fluorescente post-sinaptici spine dendritiche nel tempo in vivo. Questo protocollo utilizza un preparato assottigliato-teschio, che mantiene il cranio intatto ed evita effetti infiammatori provocati dall'esposizione delle meningi e la corteccia. Pertanto, le immagini possono essere acquisite subito dopo suviene eseguita rgery. La procedura sperimentale può essere eseguita ripetutamente su vari intervalli temporali da ore ad anni. L'applicazione di questa preparazione può anche essere esteso per indagare diverse regioni corticali e strati, così come altri tipi di cellule, in condizioni fisiologiche e patologiche.

Introduction

La corteccia dei mammiferi partecipa a molte funzioni cerebrali, dalla percezione e il controllo del movimento per l'elaborazione delle informazioni sensoriali astratta e cognizione. Varie funzioni corticali si basano sui diversi circuiti neurali, che sono costituiti da diversi tipi di neuroni che comunicano e scambiano informazioni su singole sinapsi. La struttura e la funzione delle sinapsi sono costantemente in corso di modifica in risposta alle esperienze e patologie. Nel cervello maturo, la plasticità sinaptica assume la forma di entrambe le modifiche di forza e l'aggiunta / rimozione di sinapsi, che giocano un ruolo importante nella formazione e il mant....

Protocol

Approvazione deve essere ottenuto da istituti d'origine prima dell'inizio della chirurgia e studio di imaging. Esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti della University of California, Santa Cruz Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa.

1. Chirurgia

1. Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e sterilizzare l'area di lavoro con il 70% di alcol accuratamente prima di un intervento chirurgico.
2. Anestetizzare il mouse intraperitoneale (IP) iniezione di soluzione anestetica KX (200 mg / ketamina kg e 20 mg / kg xilazin....

Results

In YFP-H topi linea ^25, proteina fluorescente gialla esprime in un sottoinsieme di neuroni piramidali strato V, che proiettano loro dendriti apicali agli strati superficiali della corteccia. Attraverso la preparazione assottigliato-teschio, i segmenti dendritiche fluorescente possono essere ripetutamente ripreso sotto il microscopio a due fotoni su vari intervalli di imaging, che vanno da ore a mesi. Qui mostriamo un esempio di rappresentazione quattro volte le stesse dendriti oltre 8 giorni in corteccia moto.......

Discussion

Per ottenere un successo preparato assottigliato-teschio, diversi passaggi in questo protocollo sono cruciali. 1) Lo spessore del cranio. L'osso cranico ha una struttura a sandwich, con due strati di alta densità dell'osso compatto e uno strato intermedio di bassa densità dell'osso spugnoso. Mentre il micro trapano ad alta velocità è adatto per rimuovere gli strati esterni di osso compatto e osso spugnoso, la lama microchirurgico è ideale per diluire lo strato interno di osso compatto. Poiché lo spessore e l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamina	Bioniche Pharma	67457-034-10	Miscelato con xilazina per anestesia
Xilazina	Lloyd laboratories	139-236	Miscelato con ketamina per anestesia
Soluzione salina	Hospira	0409-7983-09	0,9% NaCl per iniezione e imaging
Lame di rasoio	Microscopia elettronica scienze	72000	Lamette da barba in acciaio inossidabile a doppio taglio
Tamponi imbevuti di alcol	Fisher Scientific	06-669-62	Tamponi sterili per la preparazione dell'alcol
Unguento per gli occhi	Henry Schein	102-9470	Unguento oftalmico Petrolatum lubrificante oculare sterile
trapano ad alta velocità	Fine Science Tools	18000-17	Il micro trapano ad alta velocità è adatto per assottigliare lo strato esterno di osso compatto e mirare a una piccola area
Micro frese in acciaio	Fine Science Tools	19007-14	da 1,4 mm di diametro
	Surgistar	6961	La lama microchirurgica è adatta per assottigliare lo strato interno di osso compatto e lo strato intermedio di osso spugnoso
Colla cianoacrilica	Fisher Scientific	NC9062131	Fissare la piastra della testa sul cranio
Sutura	Havard Apparato	510461	Sutura di seta sterile e non assorbente, 6-0 monofilamento
Microscopio da dissezione	Olympus		SZ61
CCD camera	Infinity
Microscopio a due fotoni	Prairie Technologies		Ultima IV
10X obiettivo	Olympus		NA 0.30,
aria 60X obiettivo	Olympus		NA 1.1, IR permeabile,
immersione in acqua Laser Ti-zaffiro	Spectra-Physics		Mai Tai HP