Abstract
Una gran parte del genoma humano se transcribe pero no se traduce. En esta era post genómica, las funciones de regulación de ARN se ha demostrado ser cada vez más importante. Como la función del ARN a menudo depende de su capacidad para adoptar estructuras alternativas, es difícil predecir de ARN estructuras tridimensionales directamente de secuencia. Single-molécula se acerca mostrar potenciales para resolver el problema de la ARN polimorfismo estructural mediante el control de las estructuras moleculares de una molécula a la vez. Este trabajo presenta un método para manipular con precisión el plegamiento y la estructura de las moléculas de ARN individuales utilizando pinzas ópticas. En primer lugar, los métodos para sintetizar moléculas adecuadas para una sola molécula trabajo mecánico se describen. Se discuten, varios procedimientos de calibración siguientes para garantizar las operaciones propias de las pinzas ópticas. A continuación, se explican varios experimentos. Para demostrar la utilidad de la técnica, los resultados de desplegar mecánicamente horquillas de ARN y un único ARN kissing complejo se utilizan como evidencia. En estos ejemplos, se utilizó la técnica nanomanipulación para estudiar el plegado de cada dominio estructural, incluyendo secundaria y terciaria, de forma independiente. Por último, se discuten las limitaciones y futuras aplicaciones del método.
Introduction
El desarrollo de la técnica de las pinzas ópticas mucho tiempo se ha acompañado de su aplicación en la investigación biológica. Cuando el efecto de atrapamiento óptico fue descubierto por primera vez, Arthur Ashkin observó que las bacterias en el agua contaminada podrían quedar atrapados en el foco de láser 1. Desde entonces, las bacterias trapping se ha convertido en una, divertido experimento no intencional para las generaciones de estudiantes biofísica, así como una herramienta de investigación serio para estudiar la fisiología microbiana 2,3. La técnica de captura óptica utiliza rayo láser enfocado para inmovilizar un objeto microscópico 1. Prácticamente, una Trampa de láser funciona como un resorte óptico, que también mide la fuerza (F) en el objeto atrapado por su desplazamiento desde el centro de la trampa (Delta X). Dentro de un corto rango, F = κ x Delta X, en κ es la constante del resorte de la trampa. La trampa óptica se puede utilizar para ejercer la fuerza en picoNewton (PN) a una precisión microsobjeto copic y medir su posición con nanómetros (nm) de precisión. En las últimas dos décadas, las pinzas ópticas se han convertido en una de las técnicas de una sola molécula más utilizados en biofísica. La técnica se ha empleado para estudiar el plegado y la mecánica de ADN 4-6, 7-9 ARN, y proteínas 10,11. Las pinzas ópticas también se han utilizado para observar la replicación del ADN 12, la transcripción del RNA 13, y la síntesis de proteínas 14,15, así como muchos otros eventos biomoleculares 16-18.
Se emplean enfoques sola molécula en investigación estructural ARN principalmente para explorar el paisaje de energía plegable resistente de ARN. Una secuencia de ARN normalmente puede plegarse en múltiples estructuras estables, mutuamente excluyentes, debido a la composición química y de pelado de base de reglas simples de ARN. Durante mucho tiempo se ha sabido que el ARN polimorfismo estructural, como la que se produce en riboswitches 19,20, juega un papel importante en la regulación génica. Una recent encuesta en todo el genoma ha revelado que las variaciones de temperatura de hasta unos pocos grados influyen en gran medida la estructura y la síntesis de proteínas de una gran parte del transcriptoma celular 21. Este ejemplo sugiere que el papel biológico de ARN plegables alternativa es tal vez más importante y generalizada que se suponía. Polimorfismo estructural, sin embargo, plantea un desafío para los enfoques bioquímicos y biofísicos tradicionales, que examinan las propiedades promedio de muchas moléculas. Por ejemplo, el "on" y conformaciones "off" de un riboswitch son mutuamente excluyentes. Una estructura de un promedio de derivado de estructuras heterogéneas no es probable que se asemejan a cualquiera de los confórmeros biológicamente relevantes. Por otra parte, ARN no traducido del ARNm y generalmente se forman estructuras. Su interacción con las proteínas y ARNs reguladores comúnmente requiere despliegue de la estructura existente como parte de la interacción. Por lo tanto, el estudio de RNA de desplegamiento / replegamiento se convierte en un pertinentecuestión de la biología de ARN. Para afrontar este reto, el enfoque de una sola molécula se ha empleado para desentrañar ARN polimorfismo estructural mediante el estudio de una molécula a la vez 22-27.
En comparación con el método de fluorescencia de una sola molécula popular, pinzas basados despliegue mecánico ofrece la ventaja de que las conformaciones de las moléculas individuales se pueden manipular por la fuerza aplicada y ser medidos con precisión nanométrica. Esta capacidad nanomanipulación puede ser utilizado para controlar el despliegue / plegado de dominios estructurales individuales tales que el plegado jerárquica de un gran ARN puede ser disecado 28. Alternativamente, una sola hebra puede ser dirigida a plegarse en uno de varios confórmeros; o una estructura existente puede ser inducida mecánicamente a replegarse en una conformación diferente 29. Bajo condiciones biológicas, una estructura de ARN puede ser alterado al cambiar la temperatura o la unión del ligando. La capacidad de manipular directamente s molecularestructure abre un nuevo espacio de estudio estructural del ARN. En principio, otras técnicas mecánicas, tales como microscopio de fuerza atómica y pinzas magnéticas, también se pueden utilizar para estudiar el plegado de las moléculas de ARN individuales. Sin embargo, tales aplicaciones se limitan en gran parte debido a la relativamente baja resolución espacial 30.
El empleo de pinzas ópticas permite estructuras de ARN que se desplegaron por la fuerza mecánica.
La ventaja de mecánica despliegue es varias veces. La fuerza puede ser utilizado para desplegar tanto estructuras secundarias y terciarias, mientras que los iones de metal y ligando inducida plegado se limitan principalmente a estructuras terciarias. La temperatura y la desnaturalizante pueden afectar significativamente las actividades de agua y solutos. En contraste, la fuerza se aplica localmente para perturbar las estructuras moleculares; el efecto de la fuerza sobre el medio ambiente circundante es despreciable. Además, se utiliza mejor de fusión térmico para estudiar la termodinámica de plegado de las pequeñas estructuras de ARN,mientras que las pinzas ópticas se han utilizado para estudiar las estructuras de ARN con diversos tamaños, que van desde un tetraloop horquilla de siete pares de bases 28 a un ribozima 400-31 nucleótidos. Además, las estructuras de ARN se pueden desplegar mecánicamente a temperaturas mesófilas. En contraste, se desarrolle ARN en un experimento de fusión térmica, la temperatura se eleva típicamente muy por encima de las temperaturas fisiológicas, lo que aumenta significativamente la hidrólisis de ARN, especialmente en presencia de iones Mg 2 +.
Es importante señalar que el efecto mecánico de la fuerza depende de cómo se aplica a una estructura. La fuerza aplicada inclina el plegado panorama energético. Por ejemplo, cuando se aplica una fuerza a una horquilla, los pares de bases se rompen secuencialmente, uno a la vez (Figura 1a). El tenedor rasga progresa a lo largo del eje de la hélice, que es perpendicular a la fuerza aplicada. En contraste, cuando un complejo mínima besos está bajo tensión, los dos besarpares de bases, que son paralelas a la fuerza aplicada, comparten la carga de fuerza (figura 1b). Las diferentes geometrías de la horquilla y besar complejo relativa al resultado fuerza aplicada en su diferente respuesta mecánica, que puede ser utilizado para distinguir plegado secundaria y terciaria 28,32. El aspecto teórico de la mecánica despliegue ha sido revisado previamente 8,9,30. Este trabajo describe los enfoques básicos para configurar y realizar una sola molécula de ensayo de desarrollo mecánico.
Configuración Experimental. En nuestro experimento tracción mecánica, la muestra de ARN para la depilación con pinzas consiste en el ARN de interés flanqueada por dos asas de doble hebra de ADN / ARN (Figura 2) 7. La molécula entera puede ser atado a dos perlas de micras de tamaño con recubrimiento de superficie (Spherotech) a través de estreptavidina-biotina y digoxigenina interacciones anticuerpo-anti-digoxigenina, respectivamente. Un grano está en manos de un tr óptico de medición de fuerzaap, mientras que el otro se mantiene en la punta de una micropipeta. La distancia relativa entre las perlas se puede cambiar por cualquiera de dirigir la trampa o mover la micropipeta. Usando este enfoque, una sola molécula de ARN tethering las perlas puede ser estirado y relajado.
Preparación de las muestras. La síntesis de RNA de muestras para la depilación con pinzas incluye algunos pasos (Figura 3). En primer lugar, la secuencia de ADN correspondiente al ARN de interés se clona primero en un vector plasmídico. A continuación, tres reacciones de PCR se llevan a cabo para generar las dos asas y una plantilla para la transcripción. La plantilla de la transcripción abarca las regiones de la manija y las secuencias insertadas. El ARN de longitud completa se sintetiza por transcripción in vitro. Por último, el ARN y las manijas modificados químicamente son recocidos juntos para generar las moléculas para la depilación con pinzas.
Calibración y Operación de pinzas. El diseño básico de la utilización Minitweezersd en este trabajo se desprende que de las pinzas ópticas de doble haz 33. Con muchas mejoras, los Minitweezers mostrar una estabilidad extraordinaria en comparación con las pinzas ópticas primera generación. Un número de grupos de investigación en varios países utilizan las Minitweezers en sus investigaciones de una sola molécula 14,15,34-37. Los detalles de construcción, calibración y operación del dispositivo, incluyendo videos de instrucción, están disponibles en el sitio web "Pinzas Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Aquí, las mejoras y los procedimientos de calibración que deban llevarse a cabo en bases diarias se describen en detalle.
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Protocol
1 Preparación de ARN Moléculas por Single-molécula Tweezing
- La clonación de la secuencia de interés. Clonar la secuencia de ADN correspondiente a la estructura de ARN en un vector.
- Síntesis y purificación de la plantilla de la transcripción. Sintetizar una plantilla de transcripción por PCR. [Lugar de la tabla 1 aquí] A continuación, purificar los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR, y concentrar la muestra de> 200 ng / l. Debido a que el ADN purificado se utiliza para la transcripción, RNasa libre de agua se debe utilizar en las etapas de elución y concentración.
- Transcripción in vitro. Sintetizar ARN por transcripción in vitro a 37 ° C durante la noche para maximizar el rendimiento de ARN. [Lugar de la tabla 2 aquí] Después de la transcripción, añadir 1 l de DNasa I para digerir el molde de ADN durante 15 minutos a 37 ° C. Se purifica el ARN utilizando una columna de centrifugación de sílice.
- Síntesis de la manija biotinilado A. En primer lugar, producir el mango no modificada A por PCR usando los cebadores Af y Ar y HCl concEntrate el ADN amplificado a> 200 ng / l. A continuación, incorporar modificaciones de biotina en el producto de PCR usando una reacción de extensión del cebador. [Lugar de la tabla 3 aquí] NOTA: El mango biotinilada (biotina-HA) se puede utilizar directamente en el recocido sin purificación. A medida que la biotina-HA ha de recocido con el ARN, es fundamental utilizar RNasa libre de agua en ambas etapas.
- Síntesis del mango modificado digoxigenina B. Sintetizar digoxigenina modificado mango B (dig-HB) por PCR usando el cebador Bf y oligo modificado digoxigenina-Dig-Br (Figura 3). A continuación, purificar el producto de PCR y concentrar la muestra a> 200 ng / l.
- Hibridación de ARN a los mangos. Recocer el ARN con asas. [lugar los cuadros 4 y 5 aquí]
- Purificar muestra recocida. Añadir 3 volúmenes de etanol de la muestra recocida y mezclar bien. Guarde la mezcla a -70 ° C durante al menos 1 hora. Centrifugar a 15.800 xg y desechar el sobrenadante. Secar la pella utilizando un liofilizador. Disolver el precipitado en100 l de agua libre de RNasa. NOTA: La muestra está listo para ser utilizado y se puede almacenar a -20 ° C.
2. Calibración y Operación de las pinzas ópticas
- Calibrar Tamaño de píxel de monitor de vídeo
- Utilice la trampa óptica para atrapar un cordón con diámetro conocido (tamaño estándar).
- Capturar imágenes de un cordón atrapado usando un software de imagen (Figura 4).
- Determinar el diámetro de la perla usando el software de imágenes basada en el método centroide.
- Repita este procedimiento para determinar diámetros de granos de diferente tamaño.
- Montar los diámetros medidos y conocidas de las perlas mediante una regresión lineal para obtener el tamaño físico de un píxel.
- Verifique Distancia Calibración
- Utilice la trampa óptica para atrapar un cordón.
- Determine la posición de píxel de su centro de gravedad por el software de captura de imágenes y grabar su posición usando los Minitweezers.
- Dirigir el talón a dife alquilar posiciones y repetir la determinación de la posición.
- Convertir las posiciones X e Y de la perla de los píxeles a la unidad de m usando el tamaño de píxel calibrado.
- Comparar la X e Y entre las posiciones medidas por vídeo y por los Minitweezers. Los dos conjuntos de valores deben estar de acuerdo. A medida que la resolución de la imagen es de> 0,1 m, mover el grano más de 1 m entre las medidas para asegurar la exactitud. Si la calibración de la distancia no es comparable a la que está almacenada en los Minitweezers, vuelva a calibrar el instrumento.
- Trampa Rigidez Calibración
- Capturar un cordón usando la trampa óptica y mantenerla quieta.
- Registre la fuerza de la trampa usando una adquisición de datos rápida derivación a una velocidad> 5 kHz durante 3 segundos.
- Generar un espectro de potencia de la grabación del movimiento de talón utilizando el software. Montar el espectro de potencia de un Lorentz (Figura 5) 38:
542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Eq. 1)
en la que S (f) es la potencia en la frecuencia de f, f c es la frecuencia de corte, y S 0 es la potencia asintótica. La frecuencia de esquina, f c, es la frecuencia donde el poder de movimiento térmico ha disminuido a la mitad del valor asintótico. Como f c varía con la potencia del láser y el tamaño del grano, calibre cada talón atrapados individualmente. - Calcular la constante de resorte de la trampa, κ, desde f c:
(Ec. 2)
en la que γ es el coeficiente de arrastre de la perla (. ecuación 3). Utilice la constante del resorte para determinar los cambios de extensión de un ARN de cambio vigente.
- Prueba de la Ley de Stokes
- Capturar un cordón usando la trampa óptica. Mueva el talón hacia atrás y la fuerza a diferente velocidad.
- Registre el movimiento del talón y forzar utilizando los Minitweezers.
- Calcular el radio de la perla.
NOTA: La fuerza de rozamiento, F d, generada por el movimiento de una partícula esférica en un fluido puede ser descrita por la ley de Stokes:
(. La ecuación 3)
en la que r es el radio de la esfera, v es la velocidad, y h es la viscosidad dinámica del fluido, que se puede encontrar en las tablas de referencia. El uso de la fuerza medida como F d, el radio de la perla puede ser calculado usando la ecuación. 3 (Figura 6) y debe estar de acuerdo con el determinado por el software de adquisición de imágenes. Prueba de la ley de Stokes pone a prueba de manera efectiva las calibraciones y el rendimiento del instrumento en general.
(Ec. 2) 
(. La ecuación 3) 3. Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN
- Hacer fluidos.
- Taladre seis agujeros (2 mm de diámetro cada uno) en una cubierta de vidrio No. 2 (Figura 7a) y cortar tres ranuras (ancho de 2 mm) en la cinta de doble cara poliimida (Figura 7b) usando un grabador láser.
- Hacer una cámara de flujo intercalando dos de vidrio cubierta con dos capas de cinta de doble cara Kapton. Inserte una micropipeta y dos tubos de derivación entre la cinta (Figura 7c).
- Montar la cámara de flujo sobre una estructura de metal, haciendo coincidir los agujeros de fluidos (Figura 7d).
- Conecte los canales fluidos de la cámara a 10 ml jeringas llenas con tampón de elección a través de tubos de polietileno (Figura 7e).
- Montar toda la cámara sobre las pinzas ópticas entre los dos objetivos. Asegúrese de que el lado frontal de la cámara con los canales fluídicos se enfrenta a la derecha. Repliegue el objetivo correcto y conecte las clavijas de bronce del bastidor (Figura 7e) para agujeros de montaje en tél pinzas. Apriete los tornillos para fijar la posición de la cámara.
- La mezcla de la muestra y perlas de recocido. Mezclar la muestra recocida con perlas recubiertas con anti-digoxigenina (DIG-perlas), y dejar que la mezcla para permanecer a temperatura ambiente durante 5-10 min. Típicamente, 1 l de muestra recocida se mezcla con 5 l DIG-perlas en 1 ml de tampón. NOTA: La cantidad de los granos que se carga en la cámara de flujo se debe elegir para asegurar una cantidad razonable de las cuentas que se entregarán a partir del tubo de derivación. La relación de la muestra recocida a las perlas no se puede cuantificar fácilmente. En un caso ideal, la mayoría de los granos no tienen ARN de tal manera que sólo una pequeña fracción de las perlas puede tener sólo una molécula de ARN por perla. Como las muestras recocidas y la suspensión de cuentas son difíciles de cuantificar, la mejor y única manera actualmente es variar la proporción de mezcla y probar la mezcla de las pinzas.
- Entregar perlas para el sitio de reacción en la cámara de flujo (es decir, unos pocos micrómetros en la parte superior de la micropipette punta, Figura 7c).
- Cargue una suspensión de perlas recubiertas con estreptavidina (strep-perlas) en una jeringa de 1 ml.
- Conectar la jeringa al tubo de fluido que conduce a la parte inferior del canal de la cámara de flujo (Figura 7a).
- Empuje la jeringa a fluir los estreptococos-cuentas en la cámara.
- Mueva toda la cámara utilizando el software de control del motor para colocar la trampa óptica cerca de la abertura del tubo de derivación inferior (Figura 7b). Entonces operar la trampa óptica por un trackball para capturar un strep-perla.
- Mueva el cordón cerca de la punta de la micropipeta mediante el software de control del motor.
- Tire de la jeringa conectada a la micropipeta a chupar la gota sobre la micropipeta.
- Aplicar flujo presionando suavemente la jeringa para el canal central para eliminar perlas de Strep-extra.
- Del mismo modo, suministrar la mezcla de la muestra y los dig-cuentas (véase el paso 3.2) en el canal superior de la cámara.
- Capturar una dig-talón y lo acercan a la strep-grano utilizando la trampa óptica.
- Limpie el canal central mediante la aplicación de flujo. NOTA: El estreptocócica y DIG-cuentas son elegidos para ser de diferentes tamaños para que puedan distinguirse visualmente bajo la visión microscópica (Figura 4).
- Pesca "una sola molécula de inmovilización entre un par de talones.
- Coloque la dig-bead verticalmente en la parte superior de la Strep-talón (Figura 4).
- Mueva la dig-talón hacia el strep-grano dirigiendo la trampa. Abra una ventana gráfica fuerza-distancia en el ordenador para visualizar los cambios de fuerza.
- Tras el contacto de los dos talones, mover la dig-bead verticalmente lejos de la Strep-perla.
- Si no se realiza ningún contacto específico, la fuerza se mantiene casi cero. Si los dos talones están conectados por las moléculas, la fuerza aumenta significativamente cuando los dos talones separados. Este procedimiento, conocido comúnmente como "pesca", es a menudo perfOrmed varias veces en cada par de talones para encontrar un amarre efectivo de una sola molécula.
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Representative Results
Limitado por el espacio, nanomanipulación de moléculas de ARN individuales se demuestra mostrando sólo ejemplos mecánicos se desarrollan de ARN horquillas y un ARN con estructura terciaria.
Manipular Individual horquilla moléculas
Una vez que se estableció una correa de sujeción entre las perlas, la extensión y la fuerza de sujeción en el se pueden manipular usando un protocolo definido por el usuario. Cuatro protocolos de manipulación comunes son de uso general.
Experimento de la Fuerza-rampa. El experimento más intuitivo y común para manipular un único ARN es para estirar y relajar la molécula en la dirección del eje helicoidal de las asas en repetidas ocasiones (verticalmente como se muestra en la Figura 4). La fuerza, F, y la posición trampa, Y, se registran como una función del tiempo. La extensión de la molécula, e, se puede calcular e = Y - F / κ, en la que es la constante de muelle del trap. El resultado de tracción se puede mostrar como la curva de fuerza-extensión (Figura 8a). El estiramiento de los mangos de doble cadena se muestra por la curva ascendente con pendiente positiva. La curva de relajación de los mangos vuelve a trazar la del estiramiento. La transición estructural de una horquilla simple, de dos estados-plegable muestra una "estafa" con pendiente negativa, lo que indica una sola, la transición se desarrolla cooperativa 39. El replegamiento de la horquilla se indica mediante un "zip" en la curva de fuerza-extensión. Es importante destacar que la misma molécula puede ser desplegada y replegada en diferentes fuerzas cada vez. Esta tendencia es evidente en las distribuciones de las fuerzas de transición (Figura 8B). Comúnmente, la fuerza se cambia como una función lineal del tiempo, es decir, a un / tasa de descarga de carga fija. Bajo un régimen de carga / descarga constante, la cinética dependientes de fuerza pueden ser extraídos de las distribuciones de las fuerzas de transición 40-42.
Experimento fuerza constante. En el modo de fuerza constante, el instrumento emplea un mecanismo de retroalimentación para compensar las desviaciones de la fuerza de un valor establecido. La extensión de una molécula de ARN se registra como una función del tiempo (Figura 9). Ajuste de la fuerza en o cerca de la fuerza de transición de la transición molécula de ARN particular, permite la observación y cuantificación de estados extensionales moleculares. Los tiempos de vida de la molécula en cada estado pueden ser agrupados juntos para calcular la cinética de la transición estructural 7. La fuerza constante experimento se utiliza para controlar el plegado reversible, tales como las de horquillas 7,28.
Experimento Fuerza Jump. En un experimento de fuerza de salto, la fuerza se cambia rápidamente en un valor diferente y se mantiene constante; la vida útil de la primera transición se monitoriza 43. La fuerza de salto es particularmente útil para caracterizar la cinética deprocesos irreversibles, debido a que los tiempos de vida de la reacciones directa e inversa se puede medir directamente por separado a diferentes fuerzas. En cada fuerza salto / drop, sólo se observa una sola vida. Por lo tanto, múltiples rondas de dichos experimentos deben realizarse con el fin de recoger observaciones suficiente para extraer la cinética.
Experimentos pasiva. En el modo pasivo, las posiciones de la trampa y la micropipeta se fijan tanto (Figura 10). Una horquilla presenta dos estados correspondientes a ARN desplegada y plegada cerca de sus fuerzas de transición. A diferencia del experimento de fuerza constante, tanto la fuerza y la extensión del cambio molécula de sobre la transición estructural. La eliminación de control de retroalimentación permite transiciones moleculares para ser monitoreado directamente sin interferencia externa. Sin embargo, es difícil mantener una fuerza constante bajo el modo pasivo revela. A medida que el grano difusa atrapado en la trampa óptica, los cambios de fuerza en consecuencia. Thmodo pasivo e es inadecuado para la medición de estados moleculares con el tiempo de permanencia largo, durante el cual la fuerza se altera significativamente. Los pros y los contras de la fuerza constante y modos pasivos han sido ampliamente estudiados y discutidos 44.
Desvela plegable de estructuras secundarias y terciarias
Despliegue mecánico de un ARN besando dos pares de bases formada por dos horquillas vinculadas tetraloop GACG se utiliza como un ejemplo aquí (Figura 11a). Tanto las horquillas de un vástago 9 pares de bases, aunque las secuencias madre son diferentes. El camino despliegue mecánico de la ARN (Figura 11a) se ha caracterizado por métodos fuerza de rampa 34. Cuando se eleva la fuerza, el complejo está besando primero roto, seguido de despliegue secuencial de las horquillas. En el replegamiento, las horquillas se pliegan primero, seguido por una interacción besar a baja fuerza. Estas transiciones son visibles en la curva de fuerza-extensión (Figura11b). Para confirmar la asignación de las transiciones de la horquilla, cada una de las horquillas se pueden estudiar individualmente. La asignación de las transiciones unkissing / kissing se puede verificar mediante el estudio de un ARN mutante, en el que los tetraloops se mutan para prevenir la formación de la interacción besar 28. Por otra parte, la fuerza más bajo se puede ajustar a 10 pN, superior a las fuerzas que se besan. Como se esperaba, la curva de fuerza-extensión en tales condiciones sólo muestra el desplegamiento / replegamiento de las horquillas (Figura 11c) 34. Por lo tanto, es posible investigar la interacción plegable besos y cada una de las dos horquillas de forma independiente a diferentes fuerzas.
Llama la atención que el plegado de las dos horquillas es reversible, mientras que la interacción besar es altamente irreversible, como es evidente por muy diferentes unkissing y fuerzas que se besan, y por gran histéresis. Directl Por lo tanto, la cinética de plegamiento de las horquillas se pueden estudiary el uso de los experimentos de fuerza constante. La cinética de la interacción besarse, sin embargo, se deben medir utilizando el método de la fuerza de salto. La Figura 12a muestra un salto experimento fuerza típica 28. En 3 pN, todo el ARN se pliega. La fuerza se eleva entonces rápidamente a 22 pN y se mantiene constante. Después de unos pocos segundos, todo el ARN se desdobla en una sola hebra, como es evidente por un aumento repentino de la extensión de ~ 30 nm. La fuerza se eleva a continuación hasta 30 pN para estirar aún más el ARN, antes de que se baja a 13 pN. Después de doblar de las horquillas, la fuerza se redujo rápidamente a 8 pN. La formación del complejo besando se indica mediante el acortamiento de la extensión de ~ 7-8 nm. Mediante la recopilación de muchas de estas mediciones de toda la vida, unkissing y besando la cinética de fuerzas constantes se pueden calcular.
Bajo todas las condiciones experimentales, el complejo de besar siempre se despliega primero. En las fuerzas que las horquillas son inestables por sí mismos, interactúan besosion protege las estructuras de horquilla de despliegue. Tal efecto limitante de la velocidad también se revela por medio de experimentos de fuerza de salto. Como se muestra en la Figura 12b 28, cuando la fuerza se aumentó a 16 pN, la extensión de la molécula permanece en gran parte sin cambios durante unos segundos, seguido por un despliegue cada vez mayor la extensión de ~ 20 nm. Los cambios en la extensión indican la más débil de siete pares de bases de la horquilla se despliega justo después de interrumpir del complejo besos. La metaestabilidad de la horquilla es evidente por los tiempos de vida. Una vez que los besos se rompe, la horquilla transita rápidamente entre los estados plegado y desplegado; los tiempos de vida son menos de 1 seg. En esencia, esta observación es un experimento de fuerza constante para desplegar la horquilla. En contraste, se tarda más de 10 segundos para romper el complejo besos junto con la horquilla. Del mismo modo, la fuerza se subió a 17,7 pN (Figura 12c), en la que todo el ARN se desdobla en una sola hebra, como es evidente por la enpliegue en la prolongación de ~ 30 nm. La biestabilidad de la gran, 11 pares de bases de la horquilla puede ser visto como la extensión de saltos entre dos valores. Una vez más, los cortos tiempos de vida de la horquilla están en marcado contraste con su larga vida útil en el estado metaestable. Usando una combinación de la fuerza y la fuerza de rampa de salto, los experimentos de termodinámica y cinética de desplegamiento / individuo pasos de plegado se puede medir 28. Las observaciones directas de la hora y la formación del complejo besar nos permite analizar las contribuciones energéticas de flanqueo bases para el complejo besos mínima 34 y para medir la dependencia de la sal de la interacción besos 45.
Figura 1. estructuras de ARN relativos a la fuerza aplicada. a) Una horquilla bajo tensión. b) Tirar de un dos-basalpar de besos complejo. Los dos bucles en horquilla son de color rojo y amarillo.
Figura 2 Montaje experimental. La estructura del ARN está flanqueada por dos asas de ADN / ARN. A través de las modificaciones químicas en los extremos de las asas, la molécula completa se puede conectar a un par de talones de tamaño micrométrico de proteína recubierta. Una de las cuentas está en manos de una trampa óptica orientable de medición de fuerza. El otro se coloca en una micropipeta, que es accionado por una etapa flexture piezoeléctrico. El dibujo no está a escala.
Figura 3 Un esquema general para sintetizar moléculas de ARN con asas. El asa A, B manejar, y transcription plantilla son generados por PCR a partir de un plásmido con la secuencia de ARN clonado. El mango A es modificado por digoxigenins (DIG) en los extremos 3 '. El mango B tiene una modificación de biotina en el extremo 5 'de una hebra. El ARN de longitud completa se transcribe a partir de la plantilla de la transcripción. Las asas de ARN y modificados se mezclan y recocido. Las moléculas pueden ser adecuadamente anclada a un par de perlas recubiertas por estreptavidina y anticuerpo anti-digoxigenina. El dibujo no está a escala.
Figura 4. Imágenes de pesca una sola molécula entre dos perlas capturadas por la tarjeta de vídeo. Uno de talón se coloca en la punta de una micropipeta por succión. El otro se mantiene y dirigidos por una trampa óptica de medición de fuerza. Las direcciones de los movimientos de trampa se indican mediante flechas. Las perlas atrapado primeros movimientosverticalmente hacia el talón sobre la micropipeta. Al contactos, el cordón atrapado se mueve hacia arriba. Si se establece una correa de sujeción entre las perlas, la separación de los granos tira de la molécula y la fuerza aumenta a medida que la molécula se extiende. Si dos perlas no están vinculados por cualquier molécula, el movimiento de retracción genera ninguna fuerza.
Figura 5. Un espectro de potencia del movimiento browniano de una perla atrapado. La curva de trazo continuo es un ajuste a la ecuación de Lorentz (. Ecuación 1), que se muestra en el inserto. La constante de resorte de la trampa puede calcularse a partir de la frecuencia de esquina (. Ecuación 2).
Figura 6. Un ejemplo de prueba de la ley de Stokes.
Figura 7. una cámara de flujo para la depilación con pinzas. a) Seis agujeros, cada uno con un diámetro de 2 mm, se perforan en una cubierta de vidrio No. 2 mediante el uso de un grabador láser. b) Tres ranuras 2 mm de ancho se cortan en cintas de poliimida de doble cara. c) Una mirada de cerca en la región experimental que contiene la micropipeta y dos tubos de derivación. Las cuentas de los canales superior e inferior atraviesan a través de sus respectivas tuberías de bypass (azul y verde) a la central de canal en las direcciones indicadas por las flechas. d) montar la cámara de fluido sobre una estructura de metal, haciendo coincidir los agujeros de fluidos. e) Una cámara de tres canales conectados a fluir tuberías. El canal central se utiliza para tirar de ARN. La parte superior (azul) y la inferior (verde) canales se utilizan para la entrega de cuentas. La región experimental se indica mediante un cuadrado rojo.
Figura 8. Fuerza rampa. a) Una curva de fuerza-extensión de desplegar mecánicamente de una horquilla. Tirando se muestra en azul y la relajación en rojo. El despliegue / repliegue de la horquilla se indica mediante las flechas. B) Distribución de despliegue (azul) y el replegamiento (rojo) las fuerzas de la horquilla. La figura es una adaptación de un manuscrito presentado 39.
Figura 9. Una horquilla de ARN bajo una fuerza constante. a) Diagrama de experimento. La posición de la trampa se cambia a través de retroalimentación para mantener una fuerza constante en la horquilla. B) Fuerza y la posición frente al tiempo para las Naciones Unidas horquilla / plegado. Como la fuerza se mantiene constante, la posición de la trampa fluctúa entre dos valores, que muestra biestabilidad de la horquilla en la fuerza. La distribución binomial de la distribución trampa produce el cambio de extensión de la horquilla despliegue de 19,4 ± 0,2 nm. La figura es una adaptación de un manuscrito presentado 39.
Figura 10. Modo pasivo de una horquilla. a) B) Fuerza y extensión en función del tiempo de una horquilla en el modo pasivo.
Figura 11. Fuerza rampa del ARN besar a dos pares de bases. a) plegado jerárquica de dos pares de bases besar ARN en mecánica tensión. b) Curva fuerza-extensión. Transiciones estructurales se indican mediante flechas. C) Curva Fuerza-extensión cuando la fuerza más baja se fija en 10 pN para evitar la interacción besos. La figura está adaptado con permiso del Journal of American Chemical Society 34.
Figura 12. Fuerza salto del ARN besando dos pares de bases. a) ciclo de fuerza Un salto / drop para medir unkissing y vidas que se besan en dos fuerzas diferentes. El panel superior muestra la curva del tiempo de la fuerza. El panel inferior muestra la extensión relativa de la molécula. La fuerza se saltó primero de 3 pN al 22 pN para medir el tiempo de vida del complejo besándose en 22 pN. El unkissing se indica mediante un rápido aumento en la extensión de ~ 30 nm, lo que indica todo el ARN se desdobla en una sola hebra. En la relajación, la fuerza disminuya al 14 pN para permitir que las dos horquillas se plieguen. La fuerza se dejó caer a 8 pN. Formación de la interacción besar es indicada por disminución de la extensión de ~ 8.7 nm b.)Como fuerza se aumentó a 16 pN, la curva del tiempo de extensión de muestra que se toma varios segundos para que el complejo de besos y la horquilla de siete pares de bases a desarrollarse, después de lo cual la horquilla se despliega y repliega rápidamente. C) Todo el complejo beso es desarrollado en una sola hebra de unos pocos segundos después de la fuerza se subieron al 17,7 pN. La traza restante muestra la biestabilidad de la horquilla 11 pares de bases. Cada una de las transiciones estructurales en el despliegue del ARN besar muestra X. distintivo La figura está adaptado con permiso de Actas de la Academia Nacional de Ciencias 28.
| Reactivo | l |
| El plásmido (10 ng / mL) | 10 |
| Primer T7F (100 mM) | 10 |
| Br Primer (100 mM) | 10 |
| mezcla de dNTP (25 mM cada uno) | 10 |
| 10xTampón de PCR | 100 |
| H 2 O | 850 |
| Taq ADN polimerasa | 10 |
| Total | 1000 |
Nota: Un ciclo térmico típico para la síntesis de ADN 3 kpb es: 95 ° C 45 segundos, 53 ° C 1 minuto, 72 ° C 3 minutos.
Tabla 1. Un ejemplo de PCR para sintetizar la plantilla de la transcripción.
| Reactivo | l |
| plantilla (> 200 ng / mL) | 8 |
| PNT | 8 (2 ml cada uno) |
| Tampón de reacción 10x | 2 |
| T7 ARN polimerasa | 2 |
| Total | 20 |
Nota: Se incuba la reacción a 37 ° C overniluchar.
Tabla 2 La transcripción in vitro.
| Reactivo | l |
| Maneje A (~ 10 mg) | 50 |
| Biotina-11UTP | 5 |
| Tampón de reacción pol T4 | 5 |
| Solución de BSA | 1 |
| ADN polimerasa de T4 | 5 |
| Total | 66 |
Nota: Se incuba la reacción a temperatura ambiente durante 20 minutos. Inactivar la enzima mediante calentamiento a 70 ° C durante 20 minutos, seguido de un enfriamiento lento a temperatura ambiente.
Tabla 3. reacción de extensión de cebador.
| Reactivo | l |
| Formamida | 800 |
| EDTA (0,5 M, pH 8,0) | 2 |
| TUBOS (1 M, pH 6,3) | 40 |
| De NaCl (5M) | 80 |
| Total | 922 |
Tabla 4. Receta del tampón de recocido.
| Reactivo | |
| Biotina-HA | 1000 ng |
| Dig-HB | 1000 ng |
| ARN | 1000 ng |
| Recocido de amortiguación | 80 ml |
Nota: Un ciclo térmico típico para el recocido es: 95 ° C 10 minutos, 62 ° C 1 hora, 52 ° C 1 hora, seguido por el aumento gradual a 4 ° C.
Cuadro 5 ARN Recocer con asas.
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Discussion
Modificación y resolución de problemas en la preparación de muestras Tweezing
Elección de clonación del vector. Aunque el esquema general descrito aquí (Figura 3) no requiere un vector de clonación especial, se prefiere el vector no tener T7 intrínseca o promotor T3 para la facilidad de la transcripción de tal manera que un promotor puede ser introducido a través de PCR en las posiciones deseadas.
Secuencia y longitudes de las manijas. No hay ningún requisito específico de secuencia para las asas. Sin embargo, se prefiere una estrecha relación de GC a AT, mientras que las secuencias homopoliméricas y altamente repetidas deben ser evitados. En trabajos publicados, los dos mangos se mantienen como longitudes similares de tal manera que la estructura de ARN de interés se coloca aproximadamente en el centro. El trabajo previo muestra que la longitud total de las asas varió de 500 a 10.000 pares de bases sutilmente afecta la cinética medidos 46,47.
ve_content "> Comprobación de la calidad y la cuantificación de la mezcla recocido. Además de la ARN previsto con asas, el producto final contiene también mangos sin recocer de ADN y ARN, así como otros. Es difícil y antieconómico para purificar las moléculas de tweezing. En cambio, el recocido mezcla se puede utilizar directamente para la depilación con pinzas, ya que sólo los ácidos nucleicos hibridados correctamente pueden ser atados a dos perlas con recubrimiento de superficie. El producto correctamente recocido es también difícil de distinguirse de las asas y el ARN en la electroforesis en gel de agarosa. La mejor manera de probar la calidad y para cuantificar la concentración del producto de recocido es probarlo en las pinzas. Sin embargo, es útil para verificar y cuantificar la PCR y los productos de transcripción en cada etapa utilizando diversas técnicas de biología molecular.Métodos Alternativos a Tether ARN a perlas. Hay muchos métodos concebibles para enlazar moléculas de ARN a las superficies covalentemente o no covalentemente 48
Escoger vs múltiple-molécula Tether. Un par de Strep- y dig-cuentas puede estar vinculado por múltiples moléculas. Para desentrañar la posibilidad de múltiples moléculas de amarrar a la perla de este tipo, las curvas fuerza-distancia deben estar estrechamente examinados. Single-molécula correa mostrar una elasticidad gusano-como la cadena 4 que es generalmente invisible en los amarres de varias moléculas. Experimentos de control adicionales específicos para cada sistema pueden ser necesarios para confirmar la correa de sujeción de una sola molécula.
Las mejoras de los Minitweezers
Rápido y lento de grabación de datos. El Minitweezers tiene un built-in de adquisición de datos que registra hasta 21 parámetros instrumentales a una velocidad de 200 Hz en una computadora, que se hará referencia como el equipo de operación en este trabajo. Sin embargo, algunos applications y calibraciones requieren una velocidad de adquisición de datos rápida. Para este fin, las señales electrónicas de fuerza y la distancia se dividen para ser registrada en un nuevo equipo, el equipo "rápido-grabación", además de la adquisición de datos en el equipo operativo. El ordenador rápido-de grabación lee los datos a través de una tarjeta y software de adquisición de datos por separado, lo que permite múltiples canales de hasta 1 MHz. La nueva adquisición de datos del ordenador y no interfiere con el funcionamiento del instrumento, que está exclusivamente controlada por el equipo operativo. En un experimento, los datos se graban simultáneamente en ambos equipos a diferentes velocidades. Sincronización de tiempo se lleva a cabo durante el análisis de los datos mediante la comparación de los ficheros de datos correspondientes.
Grabación de vídeo de imagen. Una tarjeta de vídeo y software de imágenes se instalan en el equipo rápido de grabación para capturar imágenes en directo de la reacción y el análisis de imágenes de vídeo. Este desarrollo hace que sea posible implementar tque el tamaño del píxel y calibraciones distancia descritos anteriormente.
Limitaciones y futuras aplicaciones del Método
Se han discutido métodos para manipular con precisión y medir los cambios conformacionales de una sola molécula de ARN. Tales habilidades hacen posible el seguimiento de reordenamiento estructural de una cadena de ARN en tiempo real. Además, la fuerza se puede utilizar para influir en la estructura de ARN y plegables vías, permitiendo estructuras raras y / o menos que óptima a ser plegadas.
Sin embargo, hay limitaciones del enfoque mecánico. Lo más importante, la extensión, que se utiliza para interpretar los cambios conformacionales, es una proyección unidimensional de las estructuras tridimensionales. Es posible que algunos cambios conformacionales no se pueden medir 49-52, y / o barreras cinéticas se ocultan de observación 53. También hay varios efectos instrumentales y limitaciones que puede unffect la termodinámica y la cinética 44,46,47 observados.
Las pinzas ópticas se han aplicado al estudio de un número limitado de estructuras de ARN, en comparación con las numerosas transcripciones sugeridas por las encuestas en todo el genoma 54. La técnica se puede utilizar para estudiar diferentes motivos estructurales y grandes RNAs. Además, el método de encontrar nuevas aplicaciones en la investigación de ARN. Por ejemplo, el ligando de ARN y las proteínas de unión puede estabilizar o cambiar la estructura de ARN, que puede ser medida utilizando el enfoque mecánico.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
| Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programming software | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |
References
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