Abstract
ヒトゲノムの大部分は転写されるが翻訳されていません。このポストゲノム時代においては、RNAの調節機能は、ますます重要であることが示されている。 RNAの機能は、多くの場合、別の構造を採用する能力に依存するので、シーケンスから直接RNA三次元構造を予測することは困難である。単一分子は、一度に一つの分子の分子構造を監視することにより、RNA構造多型の問題を解決するためにショーの電位に近づく。この作品は、正確に光ピンセットを用いて単一のRNA分子のフォールディングおよび構造を操作するための手法を提案する。まず、単一分子力学的仕事に適した分子を合成する方法が記載されている。次に、光ピンセットの業務の適正を確保するために、さまざまなキャリブレーション手順が説明されています。次に、さまざまな実験が説明されている。技術の有用性を実証するために、機械的に展開するRNAヘアピンの結果や単一のRNAキーシングラム複合体は証拠として使用される。これらの例では、ナノマニピュレーション技術は、独立して、二次および三次構造を含む各ドメインのフォールディングを研究するために使用した。最後に、制限及び方法の将来のアプリケーションが説明されています。
Introduction
光ピンセット技術の開発は、長い生物学的研究におけるその適用を伴っている。光閉じ込め効果が最初に発見された場合には、アーサーAshkinは汚染された水の中の細菌は、レーザーの焦点1に捕捉することができたことを観察した。それ以来、トラッピング細菌は生物物理学の学生の世代のために意図的で、楽しい実験だけでなく、微生物生理学2,3を研究するための本格的な研究ツールとなっています。光トラッピング技術は、顕微鏡対象物1を固定する集束レーザービームを使用する。実際には、また、トラップ（ΔX）の中心からの変位によって挟み込まれた物体に作用する力（F）を測定する光学春、などのレーザートラップ機能。短距離、F =κのxΔX内では、κトラップのバネ定数である。光トラップは、ミクロスにピコニュートン（pNで）精度の力を発揮するために使用することができコピックオブジェクトとナノメートル（nm）の精度でその位置を測定します。過去20年間では、光ピンセットは、生物物理学の中で最も使用された単一分子技術の一つとなっている。技術は、DNA 4-6、7-9、RNAおよびタンパク質10,11の折り畳みおよび力学を研究するために採用されている。光ピンセットはまた、DNA複製12、RNA転写13、及びタンパク質合成14,15、ならびに多くの他の生体分子のイベント16-18を観察するために使用されている。
単一分子アプローチは主にRNAの頑丈なフォールディングエネルギー地形を探索するRNA構造的研究に用いられている。 RNA配列は、通常によるRNAの単純な化学組成及びベースペアリングルールに、複数の安定した、相互に排他的な構造に折り畳むことができる。これは、長いRNA構造多型、すなわちリボスイッチ19,20に生じるような、遺伝子調節において重要な役割を果たしていることが知られている。 recenトンゲノムワイドの調査では数度と小さい温度変動が大きく、携帯トランスクリプトーム21の大部分の構造とタンパク質合成に影響を与えることを明らかにした。この例では、選択的RNAフォールディングの生物学的役割は、以前に想定よりもおそらくもっと重要かつ普及していることを示唆し。構造的多型は、しかし、多くの分子の平均的性質を調べ、従来の生化学的および生物物理学的アプローチ、のための課題を提起する。たとえば、「オン」とリボスイッチの「オフ」のコンホメーションは、相互に排他的です。異質の構造に由来し、平均化構造は、生物学的に関連する配座異性体のいずれかに似ている可能性は低い。また、非翻訳RNAおよびmRNAは通常、構造を形成する。タンパク質や調節RNAとの相互作用は、一般的な相互作用の一部として、既存の構造のアンフォールディングが必要です。そのため、RNAフォールディング/リフォールディングを研究することは、該当になるRNA生物学の問題。そのような課題に対応するために、単一分子アプローチは、時間22〜27時、一分子を研究することによって、RNAの構造多型を解明するために採用されている。
人気のある単一分子蛍光法と比較して、アンフォールディング機械ベースのピンセットは、個別の分子の立体配座は、加えられた力によって操作することができ、ナノメートルの精度で測定するという利点を提供する。このナノマニピュレーション能力は、大きなRNAの階層的なフォールディングが28を解剖することができるように個別の構造ドメインのアンフォールディング/フォールディングをモニターするために利用することができる。あるいは、一本鎖は、いくつかの配座異性体の一方に折り畳むように指示することができます。または既存の構造は、機械的に異なるコンフォメー29内にフォールディングするように誘導することができる。生物学的条件下で、RNA構造は、温度変化またはリガンドの結合の際に変化させることができる。直接操作する分子の能力体制は、RNAの構造研究の新しい会場をオープンします。原則として、そのような原子間力顕微鏡、磁気ピンセットのような他の機械的技術もまた、単一のRNA分子のフォールディングを研究するために使用することができる。しかし、このようなアプリケーションは、主に、比較的低い空間分解能30に制限されている。
光ピンセットの雇用は、RNA構造は機械的な力で展開することができます。
機械的な展開の利点は数倍である。金属イオンと配位子誘起フォールディングは主三次構造に限定されるのに対し、力は、二次および三次構造の両方を展開するために使用することができる。温度と変性剤が大幅に水と溶質の活動に影響を与えることができる。対照的に、力が分子構造を乱す局所的に適用される。周辺環境への力の影響は無視できる。また、熱溶融が最高の小さなRNA構造のフォールディングの熱力学を研究するために使用され、光ピンセットは、7塩基対テトラループヘアピン28から400ヌクレオチド、リボザイム31に至るまで、さまざまなサイズのRNA構造を研究するために使用されているのに対し。さらに、RNA構造は、機械的に中温の温度で展開することができる。対照的に、熱融解実験でRNAを展開するために、温度は、典型的にはかなりよく、特にはMg 2 +イオンの存在下で、RNAの加水分解を増大させる生理学的温度、より高くなる。
これは、力の機械的効果は、それが構造に適用される方法に依存することに留意することが重要である。加えられる力は折りたたみエネルギー地形を傾斜させる。例えば、力がヘアピンに適用した場合に、塩基対を順次、時間（ 図1a）少なくとも一つを破壊される。リッピングフォークは、加えられた力に垂直な螺旋軸に沿って進行する。最小限キス錯体は張力下にあるときとは対照的に、二つのキス加えられた力に平行な塩基対は、力の負荷を共有する（ 図1b）。異なるヘアピンの形状及び二次及び三次折り畳み28,32を区別するために利用することができ、それらの異なる機械的応答して、加えられた力の結果に複素比キス。メカニカルアンフォールディングの理論的側面 は、以前に8,9,30概説されている。この作品は、設定および単一分子機械的アンフォールディングアッセイを実行するための基本的な方法の概要を説明します。
実験のセットアップ 。私たちの機械的引っ張りの実験では、ピンセットのためのRNA試料は二つの二本鎖DNA / RNAハンドルが隣接し、目的のRNA（ 図2）で構成されて7。分子全体は、それぞれ、ストレプトアビジン - ビオチンおよびジゴキシゲニン - 抗ジゴキシゲニン抗体相互作用を介して2つの表面コートされたミクロンサイズのビーズ（Spherotech）に係留することができる。一つのビーズは、力測定光学TRに保持されているAPが、他方はマイクロピペットの先端に保持されている。ビーズ間の相対距離は、トラップを操縦またはマイクロピペットを移動させることのいずれかによって変更することができる。このアプローチを使用して、ビーズをテザリング単一のRNA分子が引き伸ばされ、緩和することができる。
試料の調製 。ピンセットのためのRNA試料の合成は、いくつかの手順（ 図3）を含む。まず、関心対象のRNAに対応するDNA配列は、第一のプラスミドベクターにクローニングする。次に、3つのPCR反応は、2つのハンドルおよび転写のための鋳型を生成するために実行される。転写鋳型は、ハンドル領域および挿入された配列を包含する。全長RNAをin vitro転写により合成される。最後に、RNA及び化学的に修飾されたハンドルは、ピンセットのための分子を生成するために一緒にアニールされる。
キャリブレーションとピンセットの動作 。 Minitweezers利用の基本設計この作品におけるdはデュアルビーム光ピンセット33のことに従います。第一世代の光ピンセットに比べて多くの改善により、Minitweezers臨時安定性を示す。いくつかの国の研究グループの数は、それらの単一分子研究14,15,34-37にMinitweezersを使用しています。命令ビデオを含む建設、キャリブレーション、デバイスの動作の詳細は、「ピンセットラボ」のウェブサイト（http://tweezerslab.unipr.it）でご利用いただけます。ここで、毎日の塩基で実行する必要の改良や校正手順について詳細に説明する。
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Protocol
単一分子ピンセットのためのRNA分子の調製
- 目的の配列のクローニング。ベクターへのRNAの構造に対応するDNA配列をクローニングする。
- 合成および転写鋳型の精製。 PCRによる転写鋳型を合成する。 [ここで、プレース表1]次に、PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、> 200 ngの/μlのサンプルを濃縮する。精製されたDNAを転写するために使用されているため、RNaseを含まない水が溶出及び濃縮の工程で使用されるべきである。
- インビトロ転写 。 RNAの収量を最大にするために37℃で一晩のin vitro転写によってRNAを合成する。転写した後、[ここの場所テーブル2]、私は37℃で15分間のDNA鋳型を消化するために1μlのDNA分解酵素を加える。シリカスピンカラムを用いてRNAを精製する。
- ビオチン化され、ハンドルAの合成は、まず、プライマーのAf及びAr濃を用いたPCRにより、未修飾ハンドルAを生成する> 200 ngの/μLに増幅されたDNAをentrate。次に、プライマー伸長反応を使用して、PCR産物にビオチン修飾を組み込む。 [場所ここで表3]備考：ビオチン化ハンドルA（ビオチン-HA）は精製することなく直接アニーリングで使用することができます。ビオチン-HAは、RNAとアニールされるように、両方の工程でのRNaseフリー水を使用することが重要である。
- ジゴキシゲニンで修飾されたハンドルB.論理合成の合成プライマーBfとし、ジゴキシゲニンで修飾されたオリゴ掘る-BR（ 図3）を用いたPCRによる修正されたハンドルBを（DIG-HB）をジゴキシゲニン。次に、PCR産物を精製し、> 200 ngの/μlにサンプルを濃縮。
- ハンドルへのRNAをアニール。ハンドルを有するRNAをアニール。 [場所の表4とここ5]
- 焼きなましサンプルを精製する。アニールされたサンプルの3容量のエタノールを加え、よく混ぜる。少なくとも1時間-70℃で混合物を保管してください。 15,800×gでスピンダウンし、上清を捨てる。凍結乾燥機を使用してペレットを乾燥させる。ペレットを溶解100μlのRNaseフリー水を。注：サンプルを使用する準備ができ、-20℃で保存することができる。
光ピンセットの2キャリブレーションと運用
- ビデオモニターのピクセルサイズのキャリブレーション
- 既知の径（サイズ標準）でビーズをトラップするために光トラップを使用してください。
- イメージングソフトウェアを使用して捕捉されたビーズの捕捉画像（ 図4）。
- 重心法に基づくイメージングソフトウェアを使用して、ビーズの直径を決定します。
- 異なるサイズのビーズの直径を決定するために、この手順を繰り返します。
- ピクセルの物理的サイズを得るために、線形回帰によってビーズの測定され、既知の直径を取り付けます。
- 距離校正を確認する
- トラップしたビーズを光トラップを使用してください。
- 画像キャプチャソフトでその重心の画素位置を決定し、Minitweezersを使用してその位置を記録。
- diffeにビーズステアポジションをレンタルし、位置決定を繰り返す。
- ビーズのX及びY位置は、較正されたピクセルサイズを使用して、m個の単位に画素からの変換。
- ビデオによって及びMinitweezersによって測定された位置の間で、XとYを比較してください。 2組の値が一致する必要があります。画像解像度は>0.1μmであるため、精度を確保するために測定値の間の1ミクロンのビーズの上を移動します。距離校正はMinitweezersに格納されている1つを比較することはできません場合は、機器を再校正。
- トラップ剛性リブレーション
- 光トラップを使用してビーズを捕捉し、まだそれを保持します。
- 3秒のための> 5 kHzのレートでバイパス、高速データ収集を使用して、トラップの力を記録します。
- ソフトウェアを使用して、ビーズの動きの記録からパワースペクトルを生成する。ローレンツ（ 図5）38にパワースペクトルをフィット：
542 / 51542eq1.jpg "幅=" 200 "/>（式1）
S（f）は周波数fでの電力である、f cとは、コーナー周波数であり、S 0は漸近的な力である。コーナ周波数f cは 、熱運動の力が漸近値の半分に減少している周波数である。 f cとレーザパワーとビーズのサイズに応じて変化するように、個別に捕捉されたビーズを較正する。 - F c からトラップのバネ定数、κを計算します。
（式2）
においてγは、ビーズ（式3）の抗力係数である。力変化からのRNAの伸長の変化を決定するために、バネ定数を使用する。
- ストークスの法則をテスト
- 光トラップを使用してビーズをキャプチャします。異なる速度でバック·アンド·フォースビーズを移動します。
- ビーズの動きを記録し、Minitweezersを使用して強制的に。
- ビーズの半径を計算します。
NOTE：摩擦力、流体中の球状粒子の運動によって発生F dは 、ストークスの法則によって記述することができる。
（式3）
rは球の半径である、vは速度であり、hは 、参照表に見出すことができる流体の動粘度である。 F dとして測定された力を使用して、ビードの半径は、式を用いて計算することができる。 3（ 図6）と、画像取得ソフトウェアにより決定することに同意する必要があります。ストークスの法則·テストを効果的に全体的なキャリブレーションと計測器の性能をテストします。
（式2） 
（式3） 単一のRNA分子の3ナノマニピュレーション
- 流体工学を作る。
- 2号のカバーガラス（ 図7a）上のドリル6穴（直径2mmずつ）とレーザー彫刻機を使用した両面ポリイミドテープ（ 図7b）内に3つのスリット（幅2mm）に切断。
- 両面カプトンテープの二つの層を持つ2つのカバーガラスを挟んでフローチャンバーを作成します。テープ（ 図7c）との間にマイクロピペットと2つのバイパス管を挿入します。
- 流体穴（ 図7d）を一致させることによって、金属フレームにフローチャンバーをマウントします。
- ポリエチレンチューブ（ 図7E）を介して、選択した緩衝液を満たした10ミリリットルの注射器チャンバの流体チャネルに接続します。
- 二つの目的の間の光ピンセットに全室をマウントします。流体チャネルとチャンバーの前面右に直面していることを確認してください。右の目的を引っ込めとtの取り付け穴にフレーム（ 図7E）の真鍮製のピンを差し込む彼はピンセット。チャンバー位置を固定するネジを締めます。
- アニールしたサンプルとビーズを混合する。抗ジゴキシゲニンコーティングビーズ（DIG-ビーズ）でアニールしたサンプルを混合し、混合物を5〜10分間、室温で滞在することができます。一般的には、アニールされたサンプルを1μlの緩衝液1mlに5μlのDIG-ビーズと混合されている。注：フローチャンバにロードされるビーズの量は、バイパス管から送達されるビーズの合理的な量を確実にするように選択されるべきである。ビーズへのアニーリングサンプルの比は、容易に定量化することができない。理想的なケースでは、ほとんどのビーズは、ビーズのごく一部がビーズごとに1つのRNA分子を有することができるように何RNAを持たない。アニールされたサンプルとビーズ懸濁液は、定量化が困難であるため、唯一の方法は、現在最善とは混合比を変化させ、ピンセットでの混合物をテストすることです。
- マイルの上に、 すなわち （フローチャンバ内の反応サイトに数μmのビーズを提供cropipetteチップ、 図7c）。
- 1ミリリットルの注射器にストレプトアビジンでコーティングしたビーズ（ストレプトビーズ）の懸濁液をロードします。
- フローチャンバー（ 図7a）の底部のチャネルに通じる流体チューブに注射器を接続します。
- チャンバー内に連鎖球菌ビーズを流す注射器を押してください。
- ボトムバイパス管の開口部（ 図7b）に近い光トラップを配置するモータ制御ソフトウェアを使用してチャンバ全体を移動します。その後、連鎖球菌ビーズを捕捉するためにトラックボールによって光トラップを運営しています。
- モータ制御ソフトウェアを使用してマイクロピペットの先端に近いビーズを移動します。
- マイクロピペットの上にビーズを吸うためにマイクロピペットに接続された注射器を引き出します。
- 余分な連鎖球菌ビーズを洗い流すために中間チャネルに注射器を押して、静かに流れを適用します。
- 同様に、チャンバの上部のチャンネルに（ステップ3.2参照）をサンプルとディグビーズの混合物を提供する。
- DIG-ビーズを捕捉し、光トラップを使用して、ストレプトビーズの近くにそれを持って来る。
- フローを適用することにより、中央のチャネルを清掃してください。 NOTE：strep-と掘るビーズは、それらが顕微鏡図（ 図4）の下で視覚的に区別できるように異なるサイズであるように選択される。
- 「ビーズのペア間の単一分子テザリング釣り。
- ストレプトビーズ（ 図4）の上に垂直に掘るビーズを配置します。
- トラップを操縦することによってダウンストレプトビーズに向かってDIG-ビーズを移動します。力の変化を可視化するために、コンピュータに力 - 距離プロットウィンドウを開きます。
- 2ビーズの接触すると、垂直方向に離れて連鎖球菌ビーズからDIG-ビーズを移動します。
- 具体的な接触がなされない場合には、力はほぼゼロのままである。つのビードが分子によって接続されている場合、力の増加は著しくつのビードを分離する。一般に「フィッシング」と呼ばれるこの手順は、しばしばパーフォレーションある効果的な単一分子テザーを見つけるために、ビーズの各ペアで複数回ormed。
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Representative Results
スペースによって制限される、単一のRNA分子のナノマニピュレーションは、RNAヘアピン構造および三次構造を有するRNAの唯一の機械的な展開例を示すことにより実証される。
シングルヘアピン分子を操作する
テザーは、ビーズ間で確立されると、テザー上の拡張力は、ユーザ定義のプロトコールを使用して操作することができる。 4つの一般的な操作プロトコルが一般的に使用される。
フォース·ランプ実験 。単一のRNAを操作するための最も直感的で一般的な実験は、（垂直方向、図4に示すように）繰り返し伸ばし、ハンドルの螺旋軸方向に分子を緩和することである。力、F、およびトラップ位置、Yは 、時間の関数として記録される。トラのバネ定数であるF /κ、 -分子の延長、eは電子= Yによって計算することができるページ。引っ張り結果は、力-伸長曲線（ 図8a）として表示することができる。二本鎖ハンドルの延伸は、正の傾きを持つ立ち上がり曲線で示されている。ハンドルの緩和曲線は、延伸ことを引き返す。シンプル、二状態フォールディングヘアピンの構造転移は、単一の協同展開トランジション39を示す、負の傾きを持つ「RIP」を表示します。ヘアピンのリフォールディングは、力伸長曲線上の「ZIP」で示されている。重要なことに、同じ分子が折り畳まと異なる力でたびにリフォールディングすることができる。このような傾向は、遷移力（ 図8b）の分布に明らかである。一般的に、力が一定のローディング/アンローディング率で、 すなわち 、時間の線形関数として変化する。一定のローディング/アンローディング速度の下で、力に依存する反応速度は、遷移力40-42の分布から抽出することができる。
コンスタント·フォース実験 。定荷重モードでは、機器は、設定値からの力偏差を補償するためのフィードバック機構を採用している。 RNA分子の伸長は、分子の伸長状態の観察および定量を可能にする特定のRNA分子の遷移の遷移力またはその付近力を設定する。時間（ 図9）の関数として記録される。各状態での分子の寿命は構造転移7の動態を計算するために一緒にプールすることができる。一定の力の実験は、このようなヘアピン7,28のもののような可逆的な折り畳みを監視するために使用される。
フォースジャンプ実験 。力ジャンプ実験では、力は急速に異なる値に変更し、一定に保たれる。最初の遷移の寿命は43監視されている。力ジャンプの動態を特徴づけるのに特に有用である不可逆的なプロセス、前方の寿命及び逆反応が直接異なる力で別個に測定することができるからである。各力ジャンプ/ドロップで、唯一の寿命が観察される。したがって、このような実験の複数のラウンドは、反応速度を抽出するのに十分な観測を収集するために実行する必要がある。
パッシブ実験 。パッシブモードでは、トラップやマイクロピペットの位置は両方（ 図10）に固定されている。ヘアピンは、その転移軍近く折り畳まれていないと折り畳まれたRNAに対応する二つの状態を示す。一定の力実験、構造転移の際に分子の変化の力と拡張の両方とは異なり。フィードバック制御を排除することは、分子の遷移が直接外部干渉なしに監視することを可能にする。しかし、明らかに、パッシブモードの下で一定の力を維持することは困難である。光トラップ中でトラップされたビーズに拡散したように、それに応じて変更を強制します。のTh電子パッシブモードでは、力が有意に変化している間に長い滞留時間と分子状態を測定するには不向きである。一定の力とパッシブモードの長所と短所は、広範囲に研究され、44を検討されている。
二次および三次構造の折りたたみUNRAVEL
リンクされた2つのGACGのテトラループヘアピンによって形成された機械式2塩基対のアンフォールディングキスRNAは、ここでの例（ 図11a）として使用されます。ステム配列は異なるが、両方は、9塩基対ステムをヘアピン。 RNA（ 図11a）の機械的アンフォールディング経路は、力勾配法34によって特徴付けられている。力が発生すると、キス複合体は、第一ヘアピンの展開シーケンシャルに続く、破壊される。リフォールディングでは、ヘアピンは、小さい力でのキスの相互作用に続いて、最初に折る。これらの遷移は力伸長曲線上に表示されます（ 図11B）。ヘアピン遷移の割り当てを確認するために、ヘアピンのそれぞれを個別に研究することができる。 unkissing /キス遷移の割り当ては、テトラループがキス対話28の形成を防止するために変異させた変異型RNAを研究することによって確認することができる。あるいは、最低の力がキス力よりも高い10 PN、に設定することができる。予想されるように、そのような条件下での力-伸長曲線はヘアピン（ 図11C）34のみの展開/リフォールディングが表示されます。したがって、独立して異なる力でキス対話二ヘアピンのそれぞれを折り曲げる調べることが可能である。
それは、キスの相互作用が非常に非常に異なっunkissingとキス軍による明らかなように、不可逆的な、そして大きなヒステリシスによるものであるのに対し、2ヘアピンの折り畳みは、可逆的であること顕著である。したがって、ヘアピンの折りたたみ動態を研究することができるdirectlyが一定の力の実験を用いて。キス相互作用の速度論は、しかしながら、力ジャンプ法を用いて測定されなければならない。 図12aは、典型的な力ジャンプ実験28を示 している。 3 PNでは、全体RNAは折り畳まれる。力は、その後、急速に22 pNのに上げ、一定に保たれる。数秒後、全体RNAは〜30nmの延長の急激な増加により明らかなように、一本鎖の中に展開されている。それは13 pNのに下降する前に、力は、その後、さらなるRNAを伸ばすために30 pNのに上げる。ヘアピンの折り畳みの後、力はすぐに8〜Pnのドロップされます。キス複合体の形成〜7-8 nmのによる伸長の短縮によって示されます。 unkissing、これらの寿命測定の多くを収集し、一定の力で動力学にキスすることによって計算することができる。
すべての実験条件下では、キス複合体は、常に最初に展開されている。ヘアピンは、自身で不安定であり力で、キスが相互作用イオンが展開からヘアピン構造を保護します。このような律速効果は、力ジャンプ実験により明らかにされる。 図12bは 28に示すように、力は16 pNのにジャンプするときに、分子の伸長は、〜20nmだけ拡張を増加させる展開に続いて、数秒間に大きく変わらない。拡張機能の変化は、より弱い7塩基対ヘアピンがキス複合体混乱させる直後繰り広げられている、指定された。ヘアピンの準安定性は、寿命により明らかである。キスが壊れていると、ヘアピンは急速に折り畳まれ、折り畳まれていない状態の間で遷移する。寿命は1秒未満である。本質的に、この観察結果は、ヘアピンを展開するための一定の力実験である。対照的に、ヘアピンと一緒にキス複合体を破壊するために10秒を引き継ぎます。同様に、力が内により明らかなように、全体RNAは1本鎖に展開された17.7 PN（ 図12c）、にジャンプし〜30nmの拡張にしわ。大、11塩基対ヘアピンの双安定性は、2つの値の間の拡張のホップとして見ることができる。繰り返しますが、ヘアピンの短い寿命は、準安定状態での長寿命と対照的である。力ランプ力ジャンプ実験の組合せを使用して、個別のアンフォールディング/フォールディング工程の熱力学及び動力学は、28を測定することができる。キス複合体の破壊と形成の直接観察は、最小限のキス複合体34に拠点を隣接のエネルギーの寄与を分析し、キスの対話45の塩依存性を測定することを可能に。
加えられた力を基準に、図1 RNA構造。張力下でa）のヘアピン。b）の二塩基-を引っ張るペアは、複雑にキス。 2ヘアピンループは、赤や黄色に着色されています。
図2の実験装置。RNA構造は、二つのDNA / RNAハンドルに隣接している。ハンドルの末端に化学修飾を介して、分子全体は、タンパク質被覆したミクロンサイズのビーズのペアに接続することができる。ビーズの一つは、操縦可能、力測定光学トラップによって保持される。他の圧電フレキシャステージによって駆動されるマイクロピペット、上に配置される。図面は一定の縮尺ではない。
図3のハンドルとRNA分子を合成するための一般的なスキーム。ハンドルA、Bを処理し、およびtranscriptionテンプレートがクローニングされたRNA配列を有するプラスミドからPCRによって生成される。ハンドルAは、3 '末端にdigoxigenins（掘る）によって修正される。ハンドルBは、一方の鎖の5 '末端にビオチン修飾を有する。全長RNAは、転写鋳型から転写される。 RNAおよび修飾されたハンドルを混合し、アニールされる。適切な分子は、ストレプトアビジンおよび抗ジゴキシゲニン抗体によってコートされたビーズ一対の係留することができる。図面は一定の縮尺ではない。
ビデオカードによってキャプチャ2ビーズ間の単一分子釣りの4イメージ図。1つのビーズを吸引マイクロピペットの先端に配置されます。他は力測定光学トラップによって保持され、操縦される。トラップの動きの方向が矢印で示されている。トラップされたビーズ最初の移動垂直にマイクロピペットビードに向かって。連絡先時に、トラップされたビーズが上に移動します。テザーは、ビーズとの間に確立されている場合、分子が延長されるように、ビーズの分離は、分子力増加を引っ張る。つのビードは、任意の分子によって結合されていない場合は、後退運動は力を発生しない。
図5に捕捉されたビーズのブラウン運動のパワースペクトルは実線の曲線は、挿入に示すローレンツの式（式1）に当てはめられる。トラップのバネ定数は、コーナー周波数（式2）から計算することができる。
図6ストークスの法則テストの例。
図7。ピンセットのためのフローチャンバ。 a）は六穴、直径2mmのそれぞれは、三幅2mmのスリット両面ポリイミドテープに切断される。b）は 、レーザー彫刻を使用して第2カバーガラスに穿孔されている。c）によく見マイクロピペットおよび2つのバイパス管を含む実験的な領域に。上部と下部のチャネルからのビーズは、CENへのそれぞれのバイパス管（青と緑）をトラバース矢印の方向であるTralチャネル。d）は 、流体穴を照合することによって、金属フレーム上に流体チャンバをマウントする。e）のパイプを流れるように接続された3つのチャンネルのチャンバ。中央チャネルは、RNAを引っ張るために使用される。上部（青色）及び底部（緑色）チャンネルは、ビーズを送達するために使用される。実験的な領域が赤い四角で示されます。
図8フォースランプ。機械的にヘアピンの展開のa）の力-伸長曲線。引っ張るには青と赤の緩和に示されている。ヘアピンのアンフォールディング/リフォールディングは、矢印で示されている。b）は （青）を展開し、ヘアピンの（赤）の力をリフォールディングの分布。数値は、提出された原稿39から適応される。
図9。一定の力の下でRNAヘアピン。実験のa）のダイアグラム。ヘアピン。B上で一定の力を維持するように、トラップの位置は、ヘアピン解除/折り畳み時間に対する）フィードバックによって力及び位置を変化させる。力が一定に維持されるように、トラップの位置は力でヘアピンの双安定性を示す、2つの値の間で変動する。トラップ分布の二項分布は、19.4±0.2nmでの展開ヘアピン時の拡張子の変更をもたらす。数値は、提出された原稿39から適応される。
ヘアピンの10パッシブモード図。 A） ）力。Bを増加、離れてトラップの中心から捕捉されたビーズをもたらし、これが短縮フォースとパッシブモードでのヘアピンの対時間延長。
2塩基対キスRNAの図11を強制的に傾斜。機械的張力下のRNAにキスを2塩基対のa）の階層折りたたみ。b）の強制延長曲線。構造転移は矢印で示されている。c）の力-伸長曲線は最も低い力キス相互作用を防止するために、10 pNで設定されている場合。第グレは、ジャーナル·オブ·アメリカン·ケミカル·ソサエティ34から許可を得て適応される。
2塩基対キスRNAの図12を強制的にジャンプ。 a）の A力ジャンプ/ドロップ·サイクルは、2つの異なる力でunkissingとキス寿命を測定した。トップパネルには、力の時間トレースを示す。下のパネルは、分子の相対的な延長を示している。力は最初の22 pNのでキス複合体の寿命を測定するために22〜Pnの3 PNからジャンプする。 unkissing全体RNAは1本鎖に展開さを示す、〜30nm程度による伸長での迅速な増加によって示されている。リラクゼーションには、力が2ヘアピンがリフォールディングすることができるように、14〜Pnのランプダウンされる。力は、その後8〜Pnを落とされる。キスの相互作用の形成〜7-8ナノメートルの延長の減少によって示される。b）の力が16 pNのにジャンプするように、時間延長のトレースは、ヘアピンが急速に展開するとリフォールディングした後、キス、複雑で展開する7塩基対ヘアピン、数秒かかることを示している。c）の全体にキス錯体である力が17.7 pNのにジャンプする、数秒後に1本鎖に展開。残りのトレースは、11塩基対ヘアピンの双安定性を示している。キスのRNAフォールディングにおける構造転移は、それぞれの図は、科学28アカデミー紀要の許可を得て適応される特徴的なXを示している。
| 試薬 | μL |
| プラスミド（10 ng / mL）を | 10 |
| プライマーT7F（100ミリモル） | 10 |
| プライマーのBr（100ミリモル） | 10 |
| dNTPミックス（25 mMの各） | 10 |
| 10倍PCRバッファ | 100 |
| H 2 O | 850 |
| Taq DNAポリメラーゼ | 10 |
| 合計 | 千 |
注：3 kbpのDNAを合成するための典型的な熱サイクルは次のようになります。95℃45秒、53℃1分、72℃で3分。
表1の転写鋳型を合成するためのPCRの一例。
| 試薬 | μL |
| テンプレート（> 200 ng / mL）を | 8 |
| NTPを | 8（各2mL） |
| 10×反応バッファー | 2 |
| T7 RNAポリメラーゼ | 2 |
| 合計 | 20 |
注：37℃overniで反応をインキュベートするGHT。
インビトロ転写を表2。
| 試薬 | μL |
| （〜10mg）を処理する | 50 |
| ビオチン11UTP | 5 |
| T4のpol反応バッファー | 5 |
| BSA溶液 | 1 |
| T4 DNAポリメラーゼ | 5 |
| 合計 | 66 |
注：20分間室温で反応をインキュベートする。室温までゆっくりと冷却し、続いて20分間70℃で加熱することにより酵素を不活性化。
表3プライマー伸長反応。
| 試薬 | μL |
| ホルムアミド | 800 |
| EDTA（0.5M、pH8.0）に | 2 |
| PIPES（1M、pHは6.3） | 40 |
| のNaCl（5M） | 80 |
| 合計 | 922 |
アニール·バッファの表4レシピ。
| 試薬 | |
| ビオチン-HA | 千ngの |
| DIG-HB | 千ngの |
| RNA | 千ngの |
| アニーリングバッファー | 80mLの |
注：アニーリングのための典型的な熱サイクルは次のとおりです。4℃に上昇させることで、その後、95℃、10分、62℃1時間、52℃、1時間、。
ハンドル付き表5のアニールRNA。
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Discussion
ピンセット試料の調製における変更とトラブルシューティング
クローニングベクターの選択 。ここに記載した一般的スキーム（ 図3）は 、特別なクローニングベクターを必要としないが、ベクターは、プロモーターが所望の位置にPCRを介して導入することができるような転写を容易にするために固有のT7またはT3プロモーターを持たないことが好ましい。
シーケンスとハンドルの長さ 。ハンドルには特異的な配列の要件はありません。しかし、AT比に近いGCは、ホモポリマー、高度に反復配列は避けるべきであるのに対し、好ましい。出版物では、2つのハンドルは、目的のRNA構造が中央に概ね配置されるような類似の長さとして保持される。以前の研究は、500〜10,000塩基対まで変化させ、ハンドルの全長が微妙に測定動態46,47に影響を及ぼすことを示している。
ve_content "> アニール混合物の品質チェックおよび定量 。ハンドル付き意図したRNAに加えて、最終的な製品はまた、アニールされていないDNAのハンドルとのRNAだけでなく、他の人が含まれています。それはピンセット分子を精製することは困難と不経済である。その代わりに、焼きなましのみ適切にアニールされた核酸は、2つの表面被覆ビーズに繋留することができるため、混合物を直接、ピンセットのために使用することができる。適切にアニーリング産物はまた、ハンドルと、アガロースゲル電気泳動上のRNAから区別することが困難である。最良の方法をテストするアニールされた産物の濃度を定量化するための品質とピンセットでテストすることであるが、それはさまざまな分子生物学技術を使用して、各ステップでPCR及び転写産物を確認し、定量化することが有用である。ビーズにテザーRNAへの代替アプローチ 。共有結合または非共有結合的に表面に48 RNA分子を連結するための多くの考えられる方法があります
シングル対複数分子テザー 。 strep-と掘るビーズのペアは複数の分子によって連結することができる。ビーズを係留する複数の分子のそのような可能性を引き出すためには、力 - 距離曲線を精査する必要がある。単一分子テザーは、マルチ分子テザーにおいて一般に見えないワームのような鎖状の弾力性4を表示します。各システムに固有の追加の対照実験は、単一分子テザーを確認するために必要とされ得る。
Minitweezersの改善
高速と低速のデータ記録 。 Minitweezersは内蔵しており、この作品の営業コンピュータとして呼ばれるコンピュータ内の200ヘルツの速度で21機器パラメータまで記録するデータ収集。しかし、いくつかのアプリケーションシートアドオンやキャリブレーションは、高速データ·アクイジション·レートを必要とします。この目的のために、力と距離の電子信号は、動作中のコンピュータデータの取得に加えて、新しいコンピュータ、「高速記録」コンピュータに記録する分割される。速い記録したコンピュータには、最大1 MHzで複数のチャンネルを可能にする独立したデータ収集カードとソフトウェアを介してデータを読み込みます。新しいコンピュータ及びデータ収集は、単にオペレーティングコンピュータによって制御される機器の動作を妨害しない。実験では、データを同時に異なる速度で両方のコンピュータに記録されている。時間同期は、対応するデータファイルを比較することによってデータ分析中に行われる。
ビデオ画像記録 。ビデオカードおよび画像化ソフトウェアは、反応のライブ画像をキャプチャし、ビデオ画像を分析するために、高速記録したコンピュータにインストールされている。この開発は、トンを実装することを可能にする上述の彼の画素サイズと距離校正。
制限事項と法の今後の応用
正確に単一のRNA分子の立体構造変化を操作し、測定するための方法が議論されている。このような能力により、リアルタイムにRNA鎖の構造的再配列を監視することを可能にする。さらに、力は稀および/または最適未満の構造が折り畳まれることを可能に、RNAの構造およびフォールディング経路に影響を与えるために使用することができる。
しかし、機械的なアプローチの限界がある。最も重要なことは、コンフォメーション変化を解釈するために使用される拡張は、三次元構造の一次元投影である。これは、いくつかのコンフォメーション変化は49-52を測定することができない、および/ または動力学的バリアが観測53から隠されることが可能である。さまざまな楽器の効果と限界がありますことかもしれffect観察熱力学と反応速度44,46,47。
光ピンセットは、ゲノムワイドな調査54によって示唆多数の転写物と比較して、RNA構造の限られた数の研究に適用されている。技術は異なる構造モチーフと大きなRNAを研究するために使用されます。さらに、この方法は、RNAの研究に新たな用途を見出すであろう。例えば、RNA結合リガンドおよびタンパク質は、機械的な手法を用いて測定することができるRNA構造を安定化または変更することができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
| Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programming software | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | National Instruments | ||
| Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
| MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
| T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |
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