Summary
私たちは、ヒトマクロファージの生成のための簡単かつ効率的なプロトコルを提示する。バフィーコートは、二重密度勾配遠心分離によって処理され、単離された単球は、次いで、テフロンコーティングした細胞培養バッグ中でマクロファージに分化される。これは、マクロファージ収量を最大化し、その後の実験のために細胞の回収を容易にします。
Abstract
人間のマクロファージは、感染症から癌に至るまで病理学的過程の過多に関与している。したがって、それらは、これらの疾患の根底にあるメカニズムを理解するための貴重なツールをもたらす。そこで、高いマクロファージの収量が得られる分化手順に続いてバフィーコートからヒト単球を単離するための簡単なプロトコルを提示する。技術は一般的に入手可能な実験装置に主に依存し、したがって、ヒトマクロファージを大量に得るための費用と時間効果的な方法を提供する。簡単に説明すると、健康な血液ドナーからのバフィーコートは、末梢血から単球を採取する二重密度勾配遠心分離にかける。これらの単球マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）の存在下で、フッ素化エチレンプロピレン（FEP）テフロンコート細胞培養バッグ中で培養される。分化したマクロファージを、容易に回収し、その後の研究などの機能のために使用することができると言います。単離および分化段階の品質管理と検証のための重要な方法には、プロトコル内でハイライト表示されます。要約すると、ここで説明するプロトコルは、日常的にかつ再現性、コスト集約的なツールを必要とせずにヒトマクロファージを分離するために、科学者が可能になります。さらに、疾患モデルは、マウスのマクロファージの使用を回避する同系のヒトの系で研究することができる。
Introduction
単球系統とその最終分化した派生物からの細胞-マクロファージ-開発、組織修復、および免疫力1のような多様なプロセスへの関与につながる、それらの生物学的機能に関しての著しい可塑性を示す。後者は、彼らの食細胞や先天性および適応免疫応答2の間の岐路にマクロファージを配置抗原提示能力に起因している。しかし、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、および他のシグナル伝達分子1を分泌するそれらの能力は、それらの免疫調節機能を増強するだけでなく、それらの追加機能の基礎となるだけでなく。非微生物媒介される症状との関連でこれらの多様な活性化工程をミラーリングしようとすると、M1とM2のカテゴリ3をもたらした。この分類が完了していないが、それはマクロファージ生物学の基本的な理解が可能になります。
これらの多面的機能に起因するそれは、マクロファージが何らかの方法で組織の再構築や炎症を伴うこと多くの条件に関連付けられていることは驚くに当たりません。侵入する病原体4-6の認識およびクリアランスにおける彼らの基本的な役割の横に、マクロファージはますますアテローム性動脈硬化症、線維症、肥満症、および癌の7-10の焦点になってきた。ヒトマクロファージを生成するための再現可能な方法は、これらの病態の理解のために、したがって非常に重要です。ここでは、先に説明したように11倍密度勾配遠心分離法により、健康なドナーの末梢血からヒト単球の単離に基づいた手法を提案する。マクロファージへの分化を促進するために、単離された単球細胞は、M-CSFおよび正常ヒト血清12の低濃度の存在下でインキュベートされる。さらなる取り扱いおよび細胞収穫を容易にするために、分化は、ガス透過性FEPで行われる疎水性表面12-15テフロンコーティングされた細胞培養用バッグ。彼らはまだM1またはM2のような形式のいずれかで応答することができるように、得られた安静マクロファージアッセイの広い範囲に供することができる。このような磁気活性化細胞選別（MACS）又は遠心水簸（CCE）の逆流などの単球の単離およびその後の分化の代替的な方法は、必要な歩留まり、コスト、および時間に関するいくつかの制限があります。本明細書中に記載されるプロトコルは特別な試薬を必要とせず、標準的な実験装置を用いて行うことができるという利点を提供する（ 例えば 、MACS磁気ビーズ）、または装置（ 例えば 、CCE装置）と、大量の細胞の処理を可能にする。
Protocol
滅菌ヒトAB血清の調製
- 新鮮凍結血漿（FFP）の4-5袋を収集します。 -20℃で保存袋に十分な袋が収集されるまで。
- 袋を解凍し、補体を不活性化し、フィブリンを除去するために水浴中で56℃で30分間インキュベートする。
- 徹底的に袋の外側を消毒し、50mlチューブにプラズマを移す。
- 析出物や残留血小板を取り除くために、室温で15分間、3000×gで遠心分離します。
- すべての上清をプールし、ペレットを捨てる。
- -20℃で15 mlチューブとストア内のアリコート血清サンプル。
注：また、市販の熱不活化正常ヒトAB血清を使用することができる。
単球の単離2。
遠心機のバランスを容易にするために、並列の2つの軟膜を処理することが推奨される。しかし、CAを取る細胞を混合するために、各ドナーに対して個別の材料を使用していないために再。場合にバフィーコートを容易に得ることができない、ヘパリン処理末梢血400mlの代わりに使用することができる。
- 慎重に軟膜を含むプラスチック袋を消毒し、2 50mlチューブに各軟膜の内容を転送します。
- 各軟膜のために15ミリリットルのフィコール溶液（1.077グラム/ ml）で3 50mlチューブを埋める。フィコール、準備のために室温であるべきである。
- 最初の密度勾配のためのフィコール溶液上にバフィーコート血液30〜35ミリリットル層。両方の層を混合を防止するために、ゆっくりと慎重にこれを行うように注意してください。
- 室温で30分間ブレーキなしで400×gで遠心分離する。
- 各勾配を50 mlチューブにプラスチック製パスツールピペットと転送との二つの相の間に位置している末梢血単核細胞（PBMC）の白色リングを収集する。
- 全部で40ミリリットルまでのPBS-EDTA（1mM）をそれぞれのチューブを埋める。
- 室温でブレーキなしで10分間、300×gで遠心分離する。
- 上清を吸引し、40mlのPBS-EDTA（1mM）を、再度ペレットを洗浄。
- 各ドナープールのために、フェノール10 +赤％のFCSを含まない20ミリリットルRPMI-1640中のペレット。
- 第二密度勾配のための等浸透圧パーコール溶液を調製する：1.87ミリリットル10倍PBSで50mlチューブに2つのドナーは23.13ミリリットルパーコール溶液（1.131グラム/ mlの密度）を混ぜてください。次に、新しい50mlチューブに、この溶液を23mlの転送および46％の等張パーコール溶液を得+フェノールレッド10％FCSで27ミリリットルRPMI-1640を追加する。パーコールは、準備のために室温であるべきである。
- 50mlのチューブに準備されたパーコール溶液25ml各ドナー転送用およびパーコール液の上に2.9で調製したPBMC溶液）層。非常にゆっくりとこれを実行するように注意してくださいdは慎重に、両方の層は簡単に混合する傾向がある。正しく行われた場合、二相が原因の色での差に区別することができる。
- 室温で30分間ブレーキなしで550×gで遠心分離する。
- 各勾配のためにプラスチック製パスツールピペットおよび50 mlチューブに移して2段階の間に配置されている単球の白い輪を収集します。
- 合計で50ミリリットルまでのPBS-EDTA（1mM）をそれぞれのチューブを埋める。
- 室温でブレーキなしで10分間、400×gで遠心分離する。
- 上清を吸引し、フェノール10 +赤％FCSで20ミリリットルRPMI-1640でペレットを懸濁します。
マクロファージへの単球の分化3。
- パンブルーでの1:10希釈で孤立した単球の数を決定します。単球である大規模な、しばしば不規則な形の細胞を、のみをカウントします。リンパ球である小さく、丸い形の細胞をカウントしないでください。
NOTE：単球数は、彼らが唯一（大小）、FEPテフロンコーティングされたバッグは、細胞の分化のために使用されなければならないどのように多く、どの程度ヒントを与えるので、あまりにも正確に決定する必要はありません。 - 一人のドナーからの1.0〜1.5×10 8単球、大FEPテフロンコーティング細胞培養バッグ中の細胞を播種。各バッグについては174ミリリットルRPMI-1640、2％ヒトAB血清（セクション1で調製）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および2.5 / mlのM-CSF（180 mlの総容積）からなる培地を調製。
- 一人のドナーからの3.0〜5.0×10 7の単球については、小さなテフロン被覆細胞培養バッグ中の細胞を播種する。各バッグについては28.5ミリリットルRPMI-1640、2％ヒトAB血清（セクション1で調製）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および2.5 / mlのM-CSF（30 mlの総容積）からなる培地を調製する。
注： たとえば 、8.0×10 7の単球が得られた場合、当社はTWでそれらをシードすることをお勧め4.0×10 7個の細胞それぞれにOより少ない容量のバッグ。代わりにM-CSFの単球は、代替的に、同じ濃度（2.5 ng / mL）を少なくとも顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）と区別することができる。
- 一人のドナーからの3.0〜5.0×10 7の単球については、小さなテフロン被覆細胞培養バッグ中の細胞を播種する。各バッグについては28.5ミリリットルRPMI-1640、2％ヒトAB血清（セクション1で調製）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および2.5 / mlのM-CSF（30 mlの総容積）からなる培地を調製する。
- 準備された媒体に細胞懸濁液（20ml）に加え、慎重に混合します。二つの袋は、一人のドナーから調製される場合、細胞懸濁液に20ミリリットルRPMI-1640を追加し、各培地調製する懸濁液の半分を加える。
- オプション：単球調製物が無菌のままでいる場合に、血液寒天プレート上の細胞懸濁液の一滴を引き裂き、37℃で一晩インキュベートするかを決定する。
- FEPテフロンコーティングされた細胞培養バッグのプラグに50ミリリットルperfusorシリンジのシースを締めて、調製した細胞懸濁液でそれを埋める。
- 注射器のプラグを抜き、袋から残りの空気を押し出す。閉会コーンと袋を閉じます。
- 37で6-7日間、袋をインキュベート76; C、5％CO 2。
4。マクロファージ収穫
- （最大3時間のインキュベーションが可能です）細胞の剥離を容易にするために、少なくとも1時間氷上で差別化マクロファージとのFEPテフロンコーティングされた細胞培養バッグを置きます。バッグの表面全体が氷で覆われていることを確認してください。
- 机/ボードの端に最小の圧力の10倍とバッグを引き出します。
- 慎重にバッグの外側を消毒および閉鎖コーンを取り外します。
- 、袋のプラグの50ミリリットルの注射器を締め細胞懸濁液を除去し、50mlチューブに移す。
- 細胞をスピンダウンする、室温で10分間、400×gで遠心分離する。
- 上清を吸引し、合計で10ミリリットルのRPMI-1640 + 10％FCS中で1袋からのペレットをプール。
- 血球計で細胞数を決定します（1：4-1：パンブルーでは10倍希釈）。大きな丸い細胞のみをカウントします。
注：FEPテフロンコーティングされた袋にマクロファージを分化した後に、ドナーに単球の分離の品質に応じて、残留細胞例えばリンパ球が存在し得る。 - FEPテフロンコーティングされた袋を再利用するには、残留細胞を除去するために70％エタノールで2回、それらを洗ってください。 50ミリリットルの70％エタノールでそれらを記入し、一晩インキュベートする。バッグは、滅菌PBSで3倍の滅菌紙でラップし、標準的な手順を用いてオートクレーブ中で滅菌洗浄する。
注：細胞培養バッグは、マクロファージ収量の損失なしに数回再使用することができる。しかし、私たちは彼らがリークし始める前に、10の使用後の袋を捨てることにしました。 - RPMI-1640 + 10％FCS中で次の実験培養マクロファージ。低い血清濃度が必要な場合は、1％FCSを含むRPMI-1640中で培養することも可能である。シードと3-4時間細胞をインキュベートする。この期間の後、マクロファージは細胞培養皿の一方の表面に付着することに注意してくださいいずれの混入細胞（ すなわち赤血球、リンパ球、及び樹状細胞）を懸濁液に滞在。非接着細胞を除去し、PBSで少なくとも二回細胞を洗浄する。
- さらなる実験のための細胞培養ディッシュから培養マクロファージを切断するには、慎重に表面を、それらを削り取る。あるいは、氷上で20分間皿をインキュベート培地を吸引し、そして1mlの無酵素細胞解離緩衝液を加える。 37℃で5分間インキュベートした後、4ミリリットルのPBSを追加し、少なくとも3分間、上下にピペッティングすることにより細胞を剥離。
Representative Results
フィコールを用いて第密度勾配遠心分離は、PBMCを（ 図1A）、 すなわちリンパ球および単球を含む白色中間相が得られる。これは月グリューンワルト染色（リンパ球の典型的な）高い核/細胞質比の両方を示して収集された細胞の（ 図1BおよびC）を介して確認し、（単球の典型的な）をBean管理またはリング形の核ことができます。これらの細胞は次に、パーコールを用いて第2の密度勾配上にロードされると、単球はさらにリンパ球から分離し、再び白色中間相（ 図1D-F）として表示することができる。各軟膜のために説明した二重密度勾配遠心分離は、日常軟膜あたり70±30×10 6マクロファージ（ 図2）に分化させることができる150±40×10 6単球が得られます。からの平均マクロファージ収量20の独立した製剤は、総孤立単球の47±14％であった。
パーコール勾配遠心分離した後、まだ血液ドナーに依存するだけでなく、単離プロセスの精度にある調製物中に存在するいくつかの残留非単球細胞があるかもしれません。しかし、6〜7日の分化段階の後に、準備は主によってさらにプラスチック表面への密着性、ランダムな混入細胞によって共有されていない機能（ 図4Aに濃縮することができる成熟したマクロファージ（ 図3）で構成されていおよびB）。一度播種した細胞は、延伸紡錘様表現型（ 図4CおよびD）ともありますが、マクロファージの大部分は、古典的な「目玉焼き」形態を示す。これは細胞質との接着性クラスター内でのF-アクチン分布によってミラーリングされます。分化した細胞成熟したマクロファージ（ 図5）の典型的なマーカーであるCD45、CD14、CD16、CD206（マンノース受容体）、CD11bおよびCD11cの発現によって特徴づけられる。のCD11bの存在は、細胞が樹状細胞マーカーCD209（DC-SIGN）に対して陰性であるという事実によってサポートされている、主に樹状分化に対して主張している。
それは、AM染色し、腫瘍細胞から脱落細胞外小胞を取り込む能力をカルセインによって可視化することができるように分化過程後、細胞を約5〜7日間（ 図6）のための機能的および代謝的に活性のまま。さらに、細胞は依然としていくつかの炎症促進性遺伝子（ 図7）の発現をもたらすリポ多糖（LPS）で刺激し、図示例のように活性化することができる。
倍密度勾配遠心分離後の図1の外観とPBMC-の組成及び単球層が。等浸透パーコール遠心分離後のフィコール勾配及び（D）単球段階の後に、（A）PBMCバンドを示す写真。 （B、C）PBMC画分と残りの（E、F）単球のサイトスピン調製物もよい-Gruenwaldの染色。 CとFの中のBとE中=200μmのスケールバー=50μmで
単球およびマクロファージの図2収量。20軟膜PRの孤立単球およびマクロファージの代表的な細胞countingseparations。
図3の顕微鏡写真および単球およびマクロファージの細胞サイズの測定。（A）および後（B）マクロファージ分化前単球細胞懸濁液を位相差顕微鏡。単球（C）およびマクロファージ（D）のセルサイズヒストグラムを対応する。スケールバー=100μmである。
図4の形態と付着性のマクロファージの細胞骨格編成。（A）の前に付着したマクロファージの位相差顕微鏡と非adherenの後に（B）の除去T細胞。付着性、非刺激マクロファージにおける繊維状アクチンの（C、D）ファロイジン-TRITC染色。 AC、Dの20μm単位=100μmのスケールバーこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図分化したマクロファージの5。免疫表現。FEPテフロンコーティング細胞培養袋に分化の6日後にマクロファージのフローサイトメトリー分析（赤色で表示）。対応するアイソタイプコントロールはグレーで表示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マクロファージによる腫瘍細胞の微小胞の図6の取り込み。PKH26で標識した（赤色蛍光）は、腫瘍細胞由来の微小胞に博覧会の後に付着したマクロファージの顕微鏡写真。画像は、対応する（A）、明視野または生存色素カルセインAMと、（B）細胞質ゾルの染色にオーバーレイされます。スケールバー=100μmでは、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7、IL-1βのアップレギュレーション、Wnt5aの、TNFα、IL-6、MMP-2、MMP-7、及びMT1-MMP STIMU後に24時間LPSによるマクロファージの設置と（100ng / mlの）遺伝子発現は、全RNAサンプル（A）から、定量的RT-PCRにより測定し、HPRT1とGNB2L1発現に対して正規化した。示した値は、未処理の対照（平均±SD、nは= 5、*はp <0.05、**はp <0.01、***はp <0.001）と比較して倍の変化である。 LPS刺激の下でTNFαおよびIL-6誘導はさらに、（0.05 *はp <、±SDを意味する）ELISA（B）によって確認した。
Discussion
マクロファージは、自然免疫系の重要なエフェクター細胞であり、免疫調節、抗原提示および組織恒常性において重要な機能を表示する。それらの著しい可塑性のために、彼らは彼らの表現型の変化に異なる刺激に応答することができる。マクロファージ偏光マーカーのわずか約50％が直接人体16にマウスから翻訳することができることを示す報告があるものの、マクロファージ偏光に関するデータのこれまでの多くは、マウス系で得られる。そこで、高価な材料、 例えば 、MACS磁気ビーズまたは向流遠心水簸装置を必要とせずに、ここで十分な数および純度で初代ヒトマクロファージを得るための手法を提案する。
本手法は、低conceの存在下でのFEPテフロンコーティング細胞培養バッグ中のマクロファージへのPBMCおよびその後続の分化から単球の単離に基づいているM-CSF 11-13のntrations。単球は、ヒトにおける末梢血白血球未満の5〜10％を占める一方で、刺激の際にそれらが常駐組織マクロファージまたは樹状細胞17へと分化末梢部位に補充される。サイトカインM-CSFは、単球の生存のために重要であり、マクロファージ18,19への分化を駆動します。これまでに、単球分化のために選択されたM-CSF濃度がしかし、私たちのプロトコルでは私たちはわずか2.5 / mlの12のM-CSF濃度が成熟したマクロファージの十分な数を得ることができるが、100 ng / mlの最大の範囲であった、20。さらに、細胞は、マクロファージの剥離および定義された細胞数のそれらのその後の播種を促進FEPテフロンコート細胞培養バッグ中で培養する。バッグを数回再使用することができるので、これはさらなる分離プロセスのコストを減少させる。
この手順により得られたマクロファージCD45、CD14、CD11bの、CD11cのために非常にポジティブであり、純粋な、成熟したマクロファージ21,22の人口のために主張しているマンノース受容体CD206の発現を示す。特に高いCD14発現は、M-CSF 23の存在下で分化したマクロファージに典型的である。他は目玉焼き表現型を示すが、細胞の播種後、彼らは、典型的な紡錘状の形態を示すいくつかの細胞をプラスチック表面への高速順守を表示します。これは他の著者18,22,24からの観測によるものである。
これは、M-CSFの存在下で単球分化はM2偏マクロファージ16,25につながることが報告された。しかし、私たちのプロトコルによって単離したマクロファージは、それらがプロの誘導と反応することが、腫瘍細胞26,27またはLPSに暴露された腫瘍細胞由来の微小胞と共培養への暴露を含む刺激の広い範囲に応答することができる例えば、IL-1＆などの炎症性遺伝子M1-偏光されたマクロファージ3,5,28ための典型的な考えられている＃946 ;,TNFα、Wnt5aのか、さまざまなマトリックスメタロ。
結論として、技術的に困難または高価な手順を必要とせずに、二重密度勾配遠心分離およびマクロファージの高い数のFEPテフロンコーティング細胞培養バッグ結果のマクロファージに向けて、その後の分化による単球を単離する。得られたマクロファージは、腫瘍細胞との共培養にLPSを介して、古典的な活性化に至るその後の分析のために利用することができる。
Disclosures
著者らは、利害の衝突が存在しないように、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、ここ数年の間に彼女は常に優れた技術支援のために夫人マイクスSchaffrinskiに感謝したいと思います。
この作品は、共同研究グループ942（FOR942）内のドイツ研究会議（DFG）を通って、医学部、ゲオルク·アウグスト大学ゲッティンゲンの研究プログラムによって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunophenotyping | Beckman Coulter | for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795) | |
| BioLegends | for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105) | ||
| Axiovert 200M microscope | Zeiss | ||
| Calcein AM | AnaSpec | 89201 | |
| Combi-stopper closing cones | Braun | 4495101 | |
| 1x PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0.5 M EDTA per 500 ml PBS |
| 10x PBS, w/o Ca and Mg | Invitrogen | 14200-067 | |
| EDTA (Titriplex III) | Merck | 1084211000 | prepare a 0.5 M solution in H2O, use a sterile filter |
| Cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based) | Gibco | 13151-014 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated |
| Ficoll (density 1.077 g/ml) | Biochrom AG | L6115 | |
| FACSCanto II | BD Biosciences | ||
| Goat anti-mouse FITC | santa cruz | sc-2010 | |
| LPS from E.coli | Sigma | L8274 | final conc: 100 ng/ml |
| Multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Percoll (density 1.131 g/ml) | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| Perfusor syringe 50 ml | Braun | 8728844F | |
| Phalloidin-TRITC | Sigma | P1951 | resuspend in methanol (c = 0.1 mg/ml) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic disposable Pasteur pipettes | LVL technologies | 2655181 | |
| rh M-CSF | ImmunoTools | 11343117 | Resuspend in 500 µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot |
| RPMI-1640 with phenol red | Gibco | 21875-034 | |
| RPMI-1640 without phenol red | Gibco | 11835-063 | |
| Sterilization paper | VP group | 3KFKFS230116 | |
| Trypan blue stain (0.4% w/v) | Sigma | T8154 | |
| FEP Teflon-coated cell culture bag, small | CellGenix | 72-C | |
| FEP Teflon-coated cell culture bag, large | CellGenix | 197-C |
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