Summary
لقد أثبتت النماذج الحيوانية لتكون أدوات لا تقدر بثمن في تحديد آليات المضيف والممرض المحددة التي تسهم في تطوير الالتهاب المزمن. نحن هنا وصف نموذج الفأر العدوى عن طريق الفم مع الممرض البشري Porphyromonas اللثوية ومنهجيات التفاصيل لتقييم تطور التهاب في المواقع المحلية والنظامية.
Abstract
الالتهاب المزمن هو المحرك الرئيسي للتلف الأنسجة المرضية وصفة توحيد العديد من الأمراض المزمنة في البشر بما في ذلك الأورام، أمراض المناعة الذاتية، والأمراض الالتهابية المزمنة. أدلة تورط الناشئة الناجمة عن مسببات المرض التهاب مزمن في تطور وتقدم من الأمراض المزمنة مع مجموعة واسعة من المظاهر السريرية. بسبب المسببات معقد ومتعدد العوامل من الأمراض المزمنة، وتصميم التجارب لإثبات العلاقة السببية وإنشاء الروابط الميكانيكية يكاد يكون من المستحيل في البشر. ميزة استخدام النماذج الحيوانية هي أن كل من العوامل الوراثية والبيئية التي قد تؤثر على مسار مرض معين يمكن التحكم. وهكذا، وتصميم النماذج الحيوانية ذات الصلة من العدوى يمثل خطوة رئيسية في تحديد آليات المضيف والممرض المحددة التي تساهم في الالتهاب المزمن.
نحن هنا وصف نموذج الفأر التي يسببها الممرض infla المزمنmmation في المواقع المحلية والنظامية بعد العدوى مع الممرض عن طريق الفم Porphyromonas اللثوية، بكتيريا المرتبطة بشكل وثيق مع أمراض اللثة البشري. العدوى عن طريق الفم من معين الممرض الفئران الحرة يؤدي الى الاستجابة الالتهابية المحلية مما أدى إلى تدمير الأسنان العظم السنخي الداعم، وهو السمة المميزة لمرض اللثة. في نموذج الفأر أنشئت من تصلب الشرايين، والإصابة بفيروس P. اللثوية تسارع ترسب البلاك التهابات الجيوب الأنفية داخل الأبهر والشريان اللامسماة، يرافقه تفعيل بطانة الأوعية الدموية، وزيادة ارتشاح الخلايا المناعية، والتعبير مرتفع من وسطاء التهابات داخل الآفات. نحن منهجيات التفاصيل لتقييم التهاب في المواقع المحلية والنظامية. استخدام الفئران المعدلة وراثيا والمسوخ البكتيرية المحددة يجعل هذا النموذج مناسبة خاصة لتحديد كل من المضيف والعوامل الميكروبية تشارك في بدء وتطور، ونتائج المرض. Additionallذ، فإن النموذج يمكن أن تستخدم لكشف عن استراتيجيات علاجية جديدة، بما في ذلك التطعيم والتدخل الدوائي.
Introduction
الالتهاب المزمن هو المحرك الرئيسي للتلف الأنسجة المرضية وصفة توحيد العديد من الأمراض المزمنة في البشر. وتشمل هذه الأمراض الورمية، المناعة الذاتية والأمراض الالتهابية المزمنة 1. مسببات العديد من الأمراض المزمنة غير واضح ولكن من المفهوم أن تكون معقدة ومتعددة العوامل، تشمل كلا من الاستعداد الوراثي وإدخال العوامل البيئية. في حين أن الدوام للالتهاب لا تزال بعيدة المنال، لمحات الخلوية والجزيئية لتنشيط جهاز المناعة تتداخل إلى حد كبير مع تلك الأنماط التي لوحظت في استجابات المضيف لمسببات الأمراض 2.
أدلة متزايدة على تورط العدوى مع مسببات الأمراض الميكروبية في تطور وتقدم من التهاب مزمن ومظاهره السريرية المتنوعة 2،3. يمكن أن تحفز مسببات الأمراض والحفاظ التهاب مزمن مباشرة من تخريب الجهاز المناعي المضيف ووضع العدوى المستمرة
على الرغم من أن آليات المضيف والممرض محددة تساهم في تحريض وصيانة التهاب مزمن وغير مفهومة، بدأت التقدم في النمذجة التي يسببها الممرض التهاب مزمن إلى زيادة فهمنا لهذه العمليات. وP. اللثوية نموذج العدوى عن طريق الفم هو فريد من نوعه، يتميز نموذج الفأر جيدا من العوامل المسببة للأمراض التي يسببها الالتهاب المزمن الذي يسمح للتحليل آليات المضيف والممرض محددة تساهم في التهاب مزمن في المحلية (فقدان العظام عن طريق الفم) ومواقع النظامية (تصلب الشرايين) 5،6.
P. اللثوية هو، الممرض عن طريق الفم اللاهوائية سلبية الغرام المتورطين في أمراض اللثة البشري، وهو مرض التهابي مزمن يحركها العدوى يتميز تدمير الأنسجة الداعمة الأسنان 7. بالإضافة إلى أمراض في الموقع الأولي للعدوى، تراكم الأدلة تورط P. اللثوية يسببها التهاب مزمن في تطور وتقدم من الأمراض الجهازية بما في ذلك تصلب الشرايين 5، وهو مرض يتميز التهاب مزمنن من جدار الوعاء الدموي الشرياني. العدوى عن طريق الفم من معين الممرض الفئران الحرة مع P. اللثوية يؤدي الى الاستجابة المحلية للالتهابات التي تؤدي إلى تدمير الأسنان العظم السنخي الداعم 8. P. اللثوية يمكن استردادها من أفواه الفئران المصابة تصل إلى 42 أيام بعد الإصابة 8 والفئران تطوير مستويات عالية من الممرض محددة التتر الأجسام المضادة في مصل الدم 9. في نموذج الفأر أنشئت من تصلب الشرايين باستخدام ئي-E - / - الفئران (APOE - / -)، والعدوى عن طريق الفم مع P. اللثوية يحرض الالتهاب المزمن الذي يدفع ترسب البلاك التهابات الجيوب الأنفية داخل الأبهر والشريان 10 اللامسماة 11. التهاب التدريجي داخل الشريان اللامسماة من P. -infected اللثوية يمكن رصد الفئران في الحيوانات الحية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي. تشريحيا، والآفات الشريانية من P. -infected اللثوية الفئران تظهر زيادة تراكم الدهون accompaNIED بواسطة تفعيل بطانة الأوعية الدموية، وزيادة ارتشاح الخلايا المناعية، والتعبير مرتفع من وسطاء التهابات 12. استخدام هذا النموذج في الفئران خروج المغلوب وتوضيح دور مكونات الإشارات المضيفة وسطاء التهابات، وكذلك التفاعلات الخلية المحددة التي تدفع P. اللثوية يسببها الباثولوجيا المناعية 12-14. وبالإضافة إلى ذلك، حددت تجارب استخدام طفرات بكتيرية محددة P. حرجة اللثوية الفوعة العوامل المساهمة في التهاب مزمن في المواقع المحلية والنظامية 15.
تفاصيل هذه المقالة منهجيات لتقييم P. اللثوية يسببها التهاب مزمن في المواقع المحلية والنظامية. نحن نقدم بروتوكول مفصلة لتحليل فقدان العظم السنخي بواسطة microCT باستخدام برنامج أميرة. بالإضافة إلى ذلك، نحدد فائدة المسلسل في الجسم الحي MRI الحيوانات الحية لتقييم تقدمية فيflammation داخل الشريان اللامسماة. ندرج منهجيات التصور النوعي والكمي لوحة التهابات الآفات في الشرايين، ووصف توصيف لهم النسيجي. استخدام الفئران المعدلة وراثيا والمسوخ البكتيرية المحددة يجعل هذا النموذج مناسبة خاصة لتحديد كل من المضيف والعوامل الميكروبية تشارك في بدء وتطور، ونتائج المرض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام النموذج للكشف عن استراتيجيات علاجية جديدة، بما في ذلك التطعيم والتدخل الدوائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. النمو وزراعة البكتيريا
- خط تجميد أسهم P. اللثوية 381 اللاهوائية على لوحات أجار الدم واحتضان لمدة 3 - 5 ايام في غرفة اللاهوائية (10٪ H 2/10٪ CO 2/80٪ N 2) عند 37 درجة مئوية.
- استخدام الكائنات الحية نمت لوحة لتطعيم 5 مل الثقافات السائل من الدماغ ضخ القلب مرق (BHI) تستكمل مع خلاصة الخميرة (0.5٪)، هيمن (10 ميكروغرام / مل)، وميناديون (1 ميكروغرام / مل). التالية O / N النمو، ونقل 5 مل الثقافات في 45 مل من BHI.
- احتضان 50 مل الثقافات السائلة لا هوائيا لadditional18 - 24 ساعة والحصاد في منتصف إلى أواخر مرحلة السجل. ينبغي دائما التحقق ملاحظة الطهارة من الثقافة التي كتبها غرام وصمة عار قبل إدخال البكتيريا في الحيوانات.
- حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 10 دقيقة. نضح طاف و resuspend بدقة بيليه الخلية البكتيرية في 5 مل PBS باستخدام الماصة المصلية. إضافة مبلغ إضافي45 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين عن ما مجموعه ثلاثة يغسل.
- بعد غسل الماضي، resuspend الكرية خلية في برنامج تلفزيوني بحيث 1:10 التخفيف من ثقافة لديه كثافة ضوئية من 1.0 في 660 نانومتر (وهو OD 660 1 ما يعادل 10 9 خلية / مل). تزن ما يكفي من السليلوز كاربوكسيميثيل (viscocity المتوسط) لتحقيق 2٪ ث / ت حل (على سبيل المثال، 0.1 غرام لكل 5 مل من الثقافة). إضافة ببطء السليلوز كاربوكسيميثيل إلى تعليق البكتيرية في حين vortexing لمن أجل تجنب تراكمها.
2. العدوى عن طريق الفم
ملاحظة: كما هو موضح في الشكل رقم 1، وذلك باستخدام النموذج المناسب والماوس عن طريق الفم نظام العدوى، P. اللثوية يحرض الالتهاب المزمن والباثولوجيا المناعية في المحلي (تجويف الفم) ومواقع النظامية (الشرايين).
- إدارة سلفاميثوكسازول (0.87 ملغ / مل) وسلفاميثوكسازول (0.17 ملغ / مل) (Sulfatrim) إلى ستة الى 8 أسبوع-Oدينار الفئران الذكور libitum الإعلانية في مياه الشرب لمدة 2 أسابيع للحد من الفلورا الطبيعية. يبقي الحل المضادات الحيوية في الزجاجات العنبر وحمايته من ضوء لمنع تدهور.
- لتجنب الترسيب من محلول مضاد حيوي، يهز زجاجات مرة واحدة أو مرتين يوميا (أي في الصباح وبعد الظهر). استبدال مع حل الطازجة كل 3 - 5 ايام.
- بعد أسبوعين، استبدل حل المضادات الحيوية مع مياه الشرب التقليدية. تسمح فترة بقية المضادات الحيوية 2 يوما قبل العدوى عن طريق الفم.
- تحميل P. اللثوية تعليق / مركبة في السلين حقنة 1 مل مع إبرة التغذية المرفقة. كبح يدويا الماوس عن طريق الاستيلاء على القفا على الجزء الخلفي من الرقبة. ضمان قبضة حازمة بما يكفي لتقييد حركة رأس الفأر.
- تصيب الفئران عن طريق التطبيق الموضعي للP. اللثوية على سطح الشدق للفك. ضع إبرة التغذية مثل هذا ثايتم محاذاة تي مع سطح الشدق من الأضراس العلوية اليمنى وإخراج 50 ماي من تعليق البكتيرية. تفريق حل بلطف على طول اللثة لمدة 1 دقيقة باستخدام الكرة من الإبرة التغذية.
- السماح الماوس للراحة لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة قبل تكرار الإجراء على الفك العلوي الأيسر. السيطرة على الفئران تتلقى المعالجة بالمضادات الحيوية والتغذية الأنبوبية عن طريق الفم مع السيارة وحدها (2٪ السليلوز الميثيل كربوكسي في PBS).
- لدراسة العوامل المسببة للأمراض التي يسببها التهاب مزمن في المواقع المحلية التي يسببها فقدان العظام السنخية عن طريق إصابة الفئران 3 مرات على فترات 2 يوما. التضحية الفئران بعد 6 أسابيع لتقييم فقدان العظام بواسطة microCT.
- لدراسة العوامل المسببة للأمراض التي يسببها التهاب مزمن في المواقع المحلية والنظامية، عرضة للإصابة بتصلب الشرايين APOE - / - الفئران 5 مرات في الأسبوع لمدة 3 أسابيع.
ملاحظة: تقدم مرض في الشريان اللامسماة يتم رصد المسلسل في الجسم الحي بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي. صورة الفئران عند نقاط زمنية مختلفة والتضحية 6-16 أسبوعا الراحلص. في وقت التضحية، وتقييم عبء تصلب الشرايين العالمي من خلال تحليل أون تحديد الوجه وفقدان العظم السنخي بواسطة microCT. تميز آفات تصلب الشرايين بواسطة الأنسجة والمناعية.
3. مايكرو-التصوير المقطعي (microCT)
- تحضير العينة
- التضحية الفئران في نقطة الوقت المطلوب بعد الإصابة. الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 asphyxation أو طريقة أخرى وافق عليها منشأة الحيوان المؤسسة.
ملاحظة: جمع الدم عن طريق ثقب في القلب، مصل منفصل، وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحليل مكافحة P.gingivalis مفتش كما هو موضح في مكان آخر 9. - استخدام زوج من مقص كبير لقطع الرأس الحاد رئيس الماوس في قاعدة الجمجمة. إزالة اللحم مع زوج من ملقط ووضع الجمجمة في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 30 مل من 4٪ بارافورمالدهيد مخزنة. إصلاح العينة ل24 - 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- بعد التثبيت، rinsالبريد العينة بدقة مع برنامج تلفزيوني.
- خلق الخزعات كتلة العلوية.
- تخزين نصفي الفك العلوي في الصف النسيجي ETOH 70٪ في 4 درجات مئوية حتى التقييم من قبل microCT.
- التضحية الفئران في نقطة الوقت المطلوب بعد الإصابة. الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 asphyxation أو طريقة أخرى وافق عليها منشأة الحيوان المؤسسة.
- الحصول على الصور
- أداء عمليات الاستحواذ الصورة باستخدام ماسح ضوئي microCT سطح المكتب. تعيين مصدر الأشعة السينية إلى تيار 114 أمبير وجهد 70 كيلو فولت. تحميل الفردية نصفي للفك في الإناء التصوير والمسح الضوئي على قرار من 12 ميكرون في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة.
ملاحظة: قم بتحميل عدة نصفي للفك في وقت واحد داخل سفينة التصوير. - إجراء منخفضة الدقة المسح الأولي التي تسمح للمستخدم لترسم حدود لاقتناء الصورة وتقييد المسح إلى المنطقة ذات الاهتمام (ROI) باستخدام النظام.
ملاحظة: كثافة المينا يجعل تاج الأضراس العلوية تمييزها بسهولة. باستخدام الأضراس كدليل الغروب فضفاضة حدود التصوير لتشمل ثلاثة الأضراس وبون السنخية المحيطةه. يتم استخدام هذه الدالة أيضا للتمييز بين الأفراد نصفي للفك عند مسح عينات متعددة داخل السفينة نفسها. - عندما تكتمل عملية المسح الضوئي، وتحويل ملفات الصور الخام (.ISQ) في dicoms عالية الجودة (.DCM).
- أداء عمليات الاستحواذ الصورة باستخدام ماسح ضوئي microCT سطح المكتب. تعيين مصدر الأشعة السينية إلى تيار 114 أمبير وجهد 70 كيلو فولت. تحميل الفردية نصفي للفك في الإناء التصوير والمسح الضوئي على قرار من 12 ميكرون في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة.
- تحليل صورة
في هذا البروتوكول، يتم إجراء تحليل الصور باستخدام التصور البيانات وتجهيزها، وبرامج التحليل. أولا، استخدام المعالم المورفولوجية لخلق الطائرة من الأنسب للتقاطع ملاطي (CEJ). ثم استخدم لتحويل نصفي الفك العلوي إلى التوجه معيار للقياس لاحقا من حجم العظم السنخي.- افتح البرنامج وانقر على أيقونة "البيانات المفتوحة" الموجود في الزاوية العلوية اليسرى من بركة. بدلا من ذلك، استخدم ملف> البيانات المفتوحة.
- حدد DICOM صورة المكدس وانقر فوق تحميل. يظهر إطار DICOM لودر. انقر فوق موافق.
- مراقبة مجموعة البيانات كرمز الأخضر في حوض السباحة. لاحظ أن النقر على كائن بيانات يسبب إضافية ولكنطن ليتم عرضها في منطقة زر في الجزء العلوي من حوض السباحة. اختيار رمز يسبب أيضا بعض المعلومات عن سجل البيانات ليتم عرضها في خصائص المنطقة.
- كل رمز في بركة يوفر القائمة المنبثقة التي يمكن اختيار وحدات مختلفة. تنشيط القائمة المنبثقة بالنقر على السهم الأبيض في الزاوية اليمنى من رمز البيانات. تحت وحدة العرض، حدد Isosurface (عرض> Isosurface). سوف تظهر أيقونة Isosurface في منطقة حمام السباحة. عند تحديده، تظهر إعدادات إضافية في خصائص المنطقة.
- تعيين نمط رسم للشفافية وعتبة إلى 2،000. ويتم اختيار تأكد من compactify وباختزال تحت أزرار الخيارات. تحت متوسط، وضمان س، يتم تعيين كافة ص، و z إلى 2. انقر فوق تطبيق لتوليد isosurface.
ملاحظة: لاحظ إعادة الإعمار 3D شفاف للنصفي الفك العلوي في العارض 3D. صالح باستخدام أسلوب السحب شفافة لإعادة الإعمار الصورة أن جذور الأضراس يمكنيمكن التعرف عليها بسهولة. هذا وسوف يكون من المهم عند وضع العينة في التوجه القياسية. - حدد رمز البيانات والأخضر في منطقة خصائص حدد الرمز المحاصيل. مراقبة نافذة عرض أبعاد وإحداثيات البيانات. وضع هذا جانبا في الوقت الراهن. لاحظ أن يظهر المربع المحيط في العارض 3D مع علامات التبويب الخضراء في كل زاوية.
- حدد زر في شريط الأدوات التفاعل المشاهد. تعديل حجم المربع المحيط بالنقر والسحب على زوايا الخضراء. تأكد يشمل مربع في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) ويلغي الفضاء الميت قدر والحطام ممكن. هذا سوف يقلل من الطلب الحسابية على الكمبيوتر.
- استخدام كرة التتبع زر في شريط الأدوات المشاهد لتدوير الكائن ضمن المشاهد 3D ضمان العائد على الاستثمار وشمل تماما من المربع المحيط. عندما نشعر بالارتياح، انقر فوق موافق في نافذة المحاصيل جانبا في الخطوة 8.
- حدد رمز البيانات وتحت وحدة العرض تحديد شريحة المائل (OBS). (عرض> OBS)
- حدد OBS. وفي مجال الخصائص، تعيين نوع رسم الخرائط لخطي، ومجموعة نافذة البيانات من -200 إلى 10،000، وأخذ العينات لخيرة. الآن حدد تدوير تحت الخيارات. مراقبة تبديل تدوير في وسط OBS.
- حدد زر في شريط الأدوات التفاعل المشاهد واستخدام مقابض تبديل لضبط الطائرة قطع شريحة. إنشاء المستوى السهمي الذي يمتد موازيا لجذور الأسنان وعمودي على سطح الإطباق الأسنان. الطائرة يجب شطر الأضراس الثلاثة (M1-M3)، كما هو موضح في الشكل 2.
- إيقاف تدوير وتكرار OBS (الكائن> كائن مكرر). ويبدو OBS جديدة باسم OBS 2. تشغيل تناوب على لOBS 2.
- استخدام مقبض تدوير لإعادة توجيه OBS 2 بحيث يكون عمودي مع OBS 1 (انظر الشكل 2).
- بدوره تدوير قبالة لOBS 2 و 3 شرائح خلق مكررة. سيتم تسمية هذه OBS 3 و 4 و 5.
- اختيار نقاط لطائرة من الاحتواء الأفضل
ملاحظة: خطوات 3.4.1-3.4.5 وصف الموقع من 8 نقاط على طول CEJ يخلق طائرة من أفضل مناسبا. اختيار أربع نقاط من شرائح السهمي وأربعة آخرين من شرائح الاكليلية (انظر الشكل 3). عند اختيار نقطة تقع على شرائح السهمي في 3.4.6، قد يكون من الضروري تعديل OBS 1.- محاذاة OBS 1 مع مركز جذور معظم إنسي من M1 في المستوى السهمي. محاذاة OBS 2 مع مركز الجذر أكثر من إنسي M1 في الطائرة الاكليلية.
- محاذاة OBS 3 مع مركز الجذر أوسو البعيدة من M1 في الطائرة الاكليلية. إذا لزم الأمر، وضبط OBS 1 بحيث يتركز تقريبا مع الجذر أوسو البعيدة من M1 في الطائرة saggital عند اختيار نقطة في الخطوة 20.
- محاذاة OBS 4 مع منفرق من جذور الشدق من M2. OBS 4 يجب أن تتركز بين جذور أوسو-إنسية وأوسو-M2 البعيدة. إذا لزم الأمر، وضبط الطرافة OBS 1 بحيث يتم توسيط تقريباح الجذر أوسو البعيدة من M2 في المستوى السهمي عند اختيار نقطة في الخطوة 20
- ضبط 5 OBS بحيث يتم تشغيله أسفل وسط M3 في الطائرة الاكليلية. إذا لزم الأمر، وضبط OBS 1 بحيث يتركز تقريبا مع جذور معظم البعيدة من M3 في المستوى السهمي عند اختيار نقطة في الخطوة 20.
- تكرار أي من OBSs (OBS 6) ويصلح لتحديد نقطة في نافذة الخصائص. ويصلح لنقاط تبديل يسمح الباحث لاختيار 3 أو أكثر من نقطة في 2D أو 3D الكائنات ضمن المشاهد وثم يحسب طائرة من أفضل مناسبا. في هذه الحالة، يتم استخدام OBSs 2D موضح في الخطوات السابقة لتحديد 8 نقاط على طول CEJ.
- إخفاء OBS 6 من المشاهد 3D من خلال النقر على المربع البرتقالي في الزاوية اليمنى من رمز البيانات. إخفاء isosurface من المشاهد 3D لجعل CEJ مرئية على جميع شرائح 2D. تحويل الأيمن فوق وحدد 8 نقاط على طول CEJ كما هو موضح أعلاه.
ملاحظة: إذا كان مفتاح التحول لا يتم الاحتفاظ باستمرار عند اختيارالنقاط، سيتم تلقائيا احتساب طائرة بعد أول ثلاث نقاط. - بعد اختيار كل 8 نقاط، وجعل OBS 6 مرئية. لاحظ أن هذا هو شريحة المحوري الذي يمتد موازيا تقريبا لطائرة الإطباق.
- وتستخدم الطائرة من الأنسب لتحويل البيانات إلى التوجه القياسي لقياسات حجم اللاحقة: التحول وإعادة توجيه ملاحظة.
- انقر أيقونة البيانات> حساب> ApplyTransform. يظهر رمز ApplyTransform في منطقة حمام السباحة. انقر على مربع أبيض في الزاوية من رمز ApplyTransform، إشارة مختارة، وانقر على OBS 6.
- في خصائص المنطقة، حدد معيار لأسلوب الاستيفاء وتمديد للوضع. تطبيق التحول.
- إنشاء isosurface وOBS الاكليلية لملف بيانات جديد. تدوير OBS في الاتجاه المحوري بحيث ما يقرب من عمودي مع M1 (كما هو موضح في الشكل 2). استخدام الشرفات من الضرس والإطباق جurvatures كدليل.
- تستخدم هذه الطائرة لتحويل البيانات كما في خطوات 3.5.1 و 3.5.2. حفظ ملف البيانات المحولة.
- تجزئة وحجم العظام القياس
ملاحظة: تصف الخطوات التالية تجزئة وقياس العظم السنخي. شريحة المقابلة لطائرة من الأنسب لCEJ يتم تحديد واختيار طائرة مرجعية. ومجزأة العظم السنخي بين CEJ والطائرة إشارة على وجهه الشدق من الأضراس وقياسها. جذور معظم إنسي من M1، والجذر الأكثر البعيدة من M3 يخدم معالم نقطة النهاية و. وضع الطائرة إشارة 15-20 شرائح تحت CEJ تعطي أفضل النتائج. إدراج شرائح إضافية يقدم التقلبات التي أقنعة الاختلافات في حجم العظام بين مجموعات العلاج.- فتح محرر الإنقسام وإنشاء تسمية جديدة لتحويل البيانات.
- خلق مواد جديدة وتسميته العظم السنخي.
- تحت التكبير والبيانات النافذة، تعيين مجموعة البيانات جيئة وذهابام -200 إلى 10،000.
- تحت عرض وإخفاء اختيار التقاطع 2D، 3D MPR، وتقديم 3D حجم الرموز. تعيين نطاق البيانات من 2،500 إلى 8،000. تمكين اخفاء البيانات.
- حدد عرض أربعة المشاهدين تحديد المشاهد من شريط الأدوات. يتم تقسيم الشاشة إلى أربعة أجزاء والسماح للفحص في وقت واحد saggital، الاكليلية، ومداخن صورة المحوري، فضلا عن حجم 3D المقدمة.
- استخدام كل الأرباع الأربعة لتحديد شريحة مشاركة حيث المينا واضح على وجوه الشدق من M1 و M3. هذا الموقع يتوافق مع الطائرة من الأنسب لCEJ. تسجيل عدد شريحة المحوري.
- في الطائرة المحورية، ومواصلة 15-20 شرائح نحو قمة العظم السنخي. هذا يمثل إشارة الطائرة.
- استخدام أي تركيبة من الأدوات تجزئة لتحديد العظم السنخي على الوجه الشدق من الأضراس بين CEJ والطائرة المرجعية. استخدام الجذر أكثر من إنسي M1 ومعظم الجذر البعيد من M3 ومعالم نقطة النهاية.
- العودة إلى تجمع الكائن. يجب إلحاق أيقونة جديدة مع التمديد ".Labels" إلى أيقونة بيانات الصورة. حدد رمز تسميات وفي القائمة المنسدلة تحديد المواد> MaterialStatistics.
- في المنطقة خصائص، حدد المواد وضرب تطبيق. يظهر الجدول عرض العديد من المعلمات لكل مادة على لائحة المواد. تسجيل حجم العظام السنخية.
4. تقييم تصلب الشرايين
- تشريح الأبهري
- تضحية الماوس بواسطة CO 2 الاختناق في نقطة الوقت المطلوب بعد الإصابة.
- ضع الماوس على الجانب الظهري، والشريط أسفل ومسح الفأر مع ETOH 70٪. قطع الجلد على الجانب البطني من منتصف البطن إلى ما فوق عملية سيفي الشكل.
- قطع الجلد في منطقة البطن حتى هي عملية سيفي الشكل مرئية. رفع عملية سيفي الشكل مع السلطة الفلسطينية الصغيرةالأشعة تحت الحمراء من الملقط، وجعل التخفيضات على جانبي القفص الصدري، وقطع الحجاب الحاجز. ثم جعل اثنين من التخفيضات أسفل جانبي القفص الصدري لكشف القلب.
- يستنزف الماوس باستخدام حقنة الأنسولين 27 G وضعت في قمة البطين الأيمن. خلال جمع الدم، وتناوب دوري إبرة لمنع حجب الافتتاح الجدار البطيني. عادة، 0،8-1 مل من الدم ويمكن الحصول عليها باستخدام هذا الأسلوب.
- سوب> ملاحظة: المصل منفصلة وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحليل مكافحة P.gingivalis مفتش كما وصفها في أماكن أخرى 9
- استخدام مقص لإزالة الأذين الأيمن.
- تحديد موقع البطين الأيسر على الجانب الخلفي للقلب. إدخال 21 G الإبرة في قمة البطين الأيسر، مع شطبة من الإبرة التي تواجه وسط الغرفة وتدفق الدورة الدموية ببطء مع 3-5 مل من تثبيتي الأنسجة.
- تقليم الدهون والغدة الصعترية المحيطة القلب.
- إزالة لوخ ع.
- تحديد موقع قوس الأبهر مع الفروع الثلاثة وازالة طبقات الدهون المحيطة التعرض للأفضل.
- مواصلة تشريح الشريان الأبهر من القوس إلى قاعدة الحجاب الحاجز.
- إزالة الكبد وتهجير الأنسجة المعوية لفضح الشريان الأورطي النازل. تشريح الشريان الأبهر القاصي وصولا الى فروع الشريان الكلوي.
- قطع الشرايين الكلوية ومواصلة تشريح وصولا الى التشعب اللفائفي.
- مرة واحدة في الشريان الأورطي خالية من معظم الأنسجة الضامة، والعودة إلى الجزء العلوي من الشريان الأورطي وقص الجزء العلوي جدا من الفروع الثلاثة من الشريان الأبهر فوق القلب.
- قشر القلب التصاعدي، والقص الكامنة الأنسجة الدهنية من أجل فصل القلب من الجسم.
- عقد القلب مع ملقط وسحب التصاعدي، وقطع الأنسجة الضامة التي قد تكون لا تزال المرفقة، ومواصلة السير إلى الكلى ومتابعة وصولا الى الساقين وقص عند أدنى نقطة ممكنة.
- إصلاح الشريان الأورطي في 10٪ فورمالين لمدة 1 ساعة مع subsequent PBS غسل ل1HR. بدلا من ذلك، مخزن الشريان الأورطي في 10٪ الفورمالين O / N، شطف في برنامج تلفزيوني في اليوم التالي وتستمر مع تشريح.
- مكان الشريان الأورطي إلى 10 سم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني.
- باستخدام نطاق تشريح، وإزالة بعناية الأنسجة الغلالة البرانية من الشريان الأورطي.
- عندما الشريان الأورطي هو خال من الدهون الزائدة والأنسجة، وقطع أسفل ثلثي القلب. بدء تقشير عضلة القلب بعيدا في نهاية العكس قلب قوس الأبهر. لمبة من الشريان الأورطي يجب أن تظهر ببطء، والتي سوف تكون بيضاء في التلون.
- مواصلة تشريح دقيق باستخدام اثنين ملقط حتى المصابيح الأبهري خالية من أنسجة عضلة القلب.
- وضع الشريان الأورطي تنظيفها في علبة تشريح السوداء وتغطي مع برنامج تلفزيوني.
- تعلق من الشريان الأبهر
- إبقاء الشريان الأورطي المشمولة في برنامج تلفزيوني في جميع أنحاء تعلق.
- وضع الشريان الأورطي في موقف التشريحي مع المصابيح من الشريان الأبهر على يسار.
- وضع دبابيس minutien مؤقتة في 5 مواقع ابتداء من الساعة 1) أعلى من الشريان الأورطي، 2) أدناه ثلثفرع القوس، 3) في منتصف الطريق من الأبهر الهابط 4) قرب أدنى حد من الأبهر الهابط 5) أعلاه فرع من الشريان الفخذي.
- باستخدام مقص الربيع غرامة اضافية قطع، حتى الجانب الأيسر من الشريان الأورطي، بدءا من فرع الأيسر من الشريان الفخذي وصولا إلى الشريان الأبهر إلى ما دون أدنى فرع من فروع الشريان الأبهر الصاعد.
- قطع من الجانب اليساري من أدنى مبة الأبهري في شق ومواصلة خفض للوصول إلى تقاطع قطع على طول قطع رأسي من الشريان الأورطي.
- تتقاطع أفقيا الشريان الأورطي ليصل إلى أدنى نقطة من فرع من الشريان الأبهر الصاعد
- قطع ما يزيد على الجانب الأيمن إلى فوق أعلى فرع من فروع الشريان الأبهر.
- قطع كل فرع لفضح سطحه الداخلي.
- إزالة بعض دبابيس المؤقتة واستبدال مع دبابيس دائمة مع هدف تعلق أسفل كل الشريان الأورطي في موقع تشريحي دون للطي، وتمتد من الشريان الأورطي. الهدف هو فضح السطح الداخلي من الشريان الأورطي.
- مواصلة تعلق حتى يتعرض جميع السطح الداخلي للالشريان الأورطي واضحة للعيان من فوق وخالية من كثافة بصريةerference من الدبابيس.
- الدهون تلطيخ والآفة الكمي
- يعد السودان IV حل تلطيخ (5 ملغ / مل في 70٪ الأيزوبروبانول). تخلط جيدا وتصفية لضمان عدم وجود بلورات موجودة.
- غطاء معلقة الشريان الأورطي في حل رابعا السودان لمدة 50 دقيقة.
- يغسل مع 70٪ الأيزوبروبانول ل1-5 دقيقة. شطف بلطف الشريان الأورطي مع ddH20 حتى المياه القادمة من الشريان الأورطي لم يعد أحمر.
- تغطية الشريان الأورطي مع برنامج تلفزيوني. التقاط الصور من الشريان الأورطي مع كاميرا عالية الدقة تعلق على مجهر تشريح وحفظ ملفات الصور الرقمية و(.TIFF). وضع الحاكم المقبل لكل صورة للمساعدة في المعايرة.
- استخدام البرمجيات يماغيج لتحديد مساحة البطانية ومنطقة من الآفات. يدويا تتبع سطح باطنة لتحديد المنطقة. ويمكن حساب منطقة الآفة باستخدام اللون الآلي العتبة. وهذا يتطلب تحديد عتبة لتحديد كثافة اللون الذي يميز الآفات من المناطق العادية.
- حساب النسبة المئوية للسطح باطنة من آفات تصلب الشرايين المغطاة.
5. تقييم نسيجية من الآفات تصلب الشرايين
- حصاد قوس الأبهر مع أنسجة القلب وتزج في أكتوبر في قالب قاعدة المتاح.
- جمع 5 ميكرون cryosections المسلسل كل 50 ميكرون في الجيوب الأنفية الأبهر والشريان اللامسماة باستخدام ناظم البرد وضعت في -17 درجة مئوية، وتركيب أقسام الأنسجة على شرائح المجهر. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- لتقييم النسيجي، وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين باستخدام الإجراءات المناسبة.
6. المناعى توصيف آفات تصلب الشرايين.
الخطوات التالية مخطط بروتوكول قائم على الضد العام يعمل بشكل روتيني لتقييم آفات تصلب الشرايين في P. -infected اللثوية الفئران. هذا البروتوكول يتطلب الأمثل لكل الأجسام المضادة أو كاشف.
- إزالة الشرائح من الفريزر وإصلاحلمدة 2 دقيقة في مثبت المثلج (الأسيتون أو مثبت أخرى).
- تسمح الشرائح للمجيء إلى RT والتسمية مع قلم مقاومة المذيبات.
- شطف الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني لإزالة مصفوفة تجميد الأنسجة
- منع النشاط البيروكسيداز الذاتية التي يحتضنها الشرائح في 0.3٪ H 2 O 2 الحل في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- شطف الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة في كل مرة.
- منع غير محددة وملزمة التي تفرخ في عرقلة العازلة (10٪ مصل الأرنب في PBS) لمدة 30 دقيقة في RT.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية 1:50 في 10٪ مصل الأرنب.
- تطبيق الأجسام المضادة المخفف إلى أقسام الأنسجة على الشريحة.
- احتضان لمدة 1 ساعة على RT.
- شطف الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
- تمييع مكافحة الفئران المعقدة البيروكسيديز الضد الثانوية 1: 100 في 10٪ مصل الأرنب.
- تنطبق على أقسام الأنسجة على الشريحة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
- شطف الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
- يعد حل الركيزة DAB بإضافة1 قطرة من مولد اللون DAB DAB عازلة على كل 1 مل.
- استنزاف PBS من الشرائح وتطبيق حل DAB الركيزة. السماح لاحتضان الشرائح لمدة 5 دقائق أو حتى يتم الوصول إلى كثافة اللون المطلوب.
- غسل 3X في الماء لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
- مكافحة وصمة عار مع الهيماتوكسيلين.
- يذوى من خلال 4 تغييرات من الكحول (95٪ 1 دقيقة، 95٪ 1 دقيقة، 1 دقيقة 100٪ و 100٪ 5 دقائق).
- واضحة في 3 تغييرات الزيلين.
- ساترة باستخدام حل تصاعد وتحليلها نوعيا بواسطة المجهر. للتحليل الكمي، الحصول على صور وحساب المجال تلطيخ مع يماغيج باستخدام عتبة الآلي.
7. MRI
- إعداد الحيوان للتصوير بالرنين المغناطيسي
- تخدير الفئران التجارب قبل التصوير بالرنين المغناطيسي. أداء الاستقراء الأولي للتخدير باستخدام 4٪ isofluorane المتبخرة لمدة 2-3 دقيقة في غرفة الاستقراء. الحفاظ على التخدير أثناء فترة التصوير باستخدام التدفق المستمر لل0،5-2٪ تبخيرها delivere isofluoraneد من خلال الإعداد مخروط الأنف أو قناع.
- بعد بلوغ الطائرة الجراحية التخدير (أي لا استجابة قرصة أخمص القدمين)، ضع الماوس إلى صاحب الحيوان مع أنفها إدراجه ضمن مخروط الأنف. هناك عدة أنواع من أصحاب الحيوانات المتاحة تجاريا التي يمكن استخدامها للحد من حركة المحتملة أثناء التصوير. نستخدم حامل مصممة خصيصا مع شريط لدغة.
- مراقبة التنفس والقلب والدورة يتزامن مع الحصول على الصور باستخدام وسادة التنفس (توضع على بطن الفأر) مجهزة بنظام مراقبة الحيوانات والنابضة صغير.
- تأمين الماوس ونظام مراقبة على صاحب الحيوان مع فيلم المختبر.
- الحصول على البيانات MRI
- وضع صاحب الحيوان مع رئيس الماوس لأول مرة في موقف ضعيف إلى 30 ملم المسبار الرأسي (مايكرو 2.5) الحفاظ على 23 درجة مئوية و في رأسي الجوف 11.7 T التصوير بالرنين المغناطيسي الماسح الضوئي.
- محاذاة حامل مع مركز رانه المهاجم الملف.
- إجراء عملية الملئ باستخدام تسلسل نبض واحد.
- باستخدام تسلسل نادر، والحصول على الصور الكشفية على ثلاثة اتجاهات متعامدة لخلق صور المحوري، الاكليلية والسهمي.
- إجراء دقة منخفضة الرنين المغناطيسي تصوير الأوعية الدموية (MRA) باستخدام تسلسل صدى ungated التدرج 3D مع المعلمات التالية: لوح سمك = 1.5 سم؛ زاوية الوجه = 45 درجة؛ الوقت التكرار = 20 مللي ثانية. صدى الوقت = 2.2 مللي. مجال الرؤية = 1.5 × 1.5 × 1.5 سم؛ مصفوفة = 64 × 64 × 64؛ عدد متوسط = 1. مجموع الوقت المسح الضوئي: 2~3 دقيقة. والغرض من هذا الفحص هو التأكد من أن الصور يتم الحصول عليها في المنطقة المستهدفة (الشريان اللامسماة).
- أداء عالية الدقة MRA من الشريان اللامسماة مع ungated التدرج 3D صدى تسلسل باستخدام المعلمات التالية: لوح سمك = 1.5 سم؛ زاوية الوجه = 45 درجة؛ الوقت التكرار = 20 مللي ثانية. صدى الوقت = 2.2 مللي. مجال الرؤية = 1.5 × 1.5 × 1.5 سم؛ مصفوفة = 128 &# 215؛ 128 × 128. كان عدد من متوسط مجموع الوقت = 4. مسح ~25 دقيقة.
- الحصول على صور المحوري المستمر لل0.5MM اللامسماة الشريان تحت الترقوة التشعب.
- تحليل بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي
- إجراء إعادة الإعمار وتحليل الصور باستخدام برنامج التصوير المرتبطة الماسح الضوئي. تحقيق إعادة الإعمار 3D من الصور MRA من أقصى كثافة الإسقاط.
- استخدام التشعب تحت الترقوة باعتباره علامة تشريحية لمحاذاة البيانات التي حصل عليها من الفئران مختلفة أو نفس الماوس في نقاط زمنية مختلفة. اختيار القسم الهدف عبر الشريان اللامسماة في 0.3- إلى 0.5 ملم مسافة أقل من subclavianbifurcation.
- تحديد وحساب مساحة اللمعية من المقطع العرضي مع اختيار يماغيج. يجب أن يتم تنفيذ القياسات بشكل أعمى من قبل اثنين من المراقبين المستقلين. التحقق من قياس التكاثر عن طريق حساب معاملات الارتباط interclass.
- للدراسات طولية مع ايماج التسلسليجي، وتطبيع منطقة اللمعية إلى منطقة التجويف الحصول عليها في الأساس (العلبة الأولى في الدراسة) لكل الماوس. التعبير عن النتائج على النحو التغيير في منطقة اللمعية مع مرور الوقت.
- إجراء التحليلات الإحصائية المناسبة (أي طالب ر اختبار) لتحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام نموذج الفأر المناسب عن طريق الفم ونظام العدوى، P. اللثوية يحرض الالتهاب المزمن والباثولوجيا المناعية في المحلي (تجويف الفم) ومواقع النظامية (الشرايين) (الشكل 1).
في الفئران، والعدوى عن طريق الفم مع P. اللثوية يؤدي الى الاستجابة الالتهابية المحلية التي تحرك تدمير الأسنان العظم السنخي الداعم 8. P. -infected اللثوية الفئران تطوير استجابات الأجسام المضادة في مصل الدم لهذا الكائن الحي التي هي في الغالب من نمط إسوي مفتش 9. النتائج هو موضح في الشكل 4 هي تمثيلية من التجربة التي كانت مصابة C57BL / 6 مع P.gingivalis ثلاث مرات على فترات لمدة يومين وضحى بعد 6 أسابيع لتقييم فقدان العظام السنخية بواسطة microCT. التحليل الحجمي باستخدام برنامج أميرة يكشف عن أن P. الفئران اللثوية -infected تظهر فقدان العظام كبيرة مقارنة مع الضوابط غير المصابة (الشكل 4A). ويوضح الفحص البصري من أعيد بناؤها نصفي لفك زيادة في مساحة السطح المعرض من جذور الرحى في الفئران المصابة مقارنة مع الضوابط (الشكل 4B و الشكل 4C).
في تصلب الشرايين المعرضة للAPOE - / - الفئران، P. اللثوية يحرض الالتهاب المزمن الذي يدفع فقدان العظام السنخية 12 و ترسب البلاك التهابات الجيوب الأنفية داخل الأبهر 15 و 11 اللامسماة الشريان. P. اللثوية يسببها تصلب الشرايين يحدث في وقت مبكر من 24 ساعة في أعقاب الإصابة الماضي ويمكن الوقاية من التطعيم قبل الإصابة 16. التهاب التدريجي في الشريان اللامسماة من P. -infected اللثوية يمكن رصد الفئران في الفئران الحية بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي المسلسل في الجسم الحي في وقت مختلف النقاط بعد الإصابة (الشكل 5). أون القياسات وجه السودان IV aortas الملون يدل على أن P. اللثويةالعدوى يزيد بشكل كبير ترسب الدهون ومنطقة الموضعة على السطح باطنة (الشكل 6). في وقت التضحية، الأنسجة والمناعية يمكن استخدامها لنوعيا أو كميا تميز آفات تصلب الشرايين في سياق تكوين الخلايا، والتعبير عن مختلف المستضدات، والمحتوى الدهني. تحليل المناعى للآفات الجيوب الأنفية الأبهري يكشف زيادة تسلل بلعم والتعبير مرتفعة من مستقبلات المناعة الفطري تول مثل مستقبلات 2 (TLR2) في P. اللثوية الفئران -infected (الشكل 7).
الرقم 1. P. اللثوية يسببها التهاب مزمن في المواقع المحلية والنظامية. قبل الإصابة P. الفئران اللثوية هي administe المضادات الحيوية الحمراء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية في مياه الشرب لمدة 10-14 يوما يعقبها فترة راحة لمدة يومين للمضادات الحيوية. العلاج بالمضادات الحيوية عن طريق الفم يقمع النباتات الأصلية وتسهل الاستعمار. لتحريض فقدان السنخية، يصاب الفئران ثلاث مرات على فترات لمدة يومين ويتم قياس حجم العظم السنخي 6 أسابيع بعد الإصابة. عند تقييم تصلب الشرايين، وتصلب الشرايين المعرضة للAPOE - / - عادة ما يصاب الفئران 5 مرات في الأسبوع لمدة 3 أسابيع والتضحية 16-24 أسابيع بعد الإصابة. التهاب التدريجي داخل الشريان اللامسماة من الفئران الحية يمكن قياسها بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي المسلسل في الجسم الحي في وقت نقاط مختلفة بعد العدوى. الأنسجة المناعية ويمكن أن تستخدم لصبغ للالدهون وخلايا التهابية في إنهاء التجربة للتحقق من صحة البيانات التصوير. في وقت التضحية، ويقاس فقدان العظم السنخي بواسطة microCT ويتم تقييم العبء العالمي من خلال تصلب الشرايين أون تلطيخ الوجه من aortas بأكملها. https://www.jove.com/files/ftp_upload/51556/51556fig1highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. ماوس نصفي الفك توضح المواقع من OBS 1 و OBS 2. وصفت والأضراس الثلاثة (M1-M3) ويشار تشريحيا المصطلحات ذات الصلة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. ماوس نصفي الفك توضح المواقع OBS من 1 إلى 5.1556 / 51556fig3highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. السنخية فقدان العظام مقاسا microCT. ذكر C57BL / 6 أصيبوا شفويا مع P. تم تقييم اللثوية وحدها أو مركبة (غير المصابة) وحجم العظم السنخي بواسطة microCT بعد 6 أسابيع باستخدام أميرة. (A) حجم العظم السنخي في نصفي للفك، من غير مصاب وP. اللثوية -infected C57BL / 6. نتائج تمثل حجم العظام فوق الطائرة المرجعية (120 ميكرون من CEJ). يتم التعبير عن البيانات وحجم العظام SD من ن = 8 الفئران في المجموعة. *** P <0.001، مقارنة مع الضوابط غير المصابة. (B) و (C) إعادة البناء الممثل 3D من نصفي للفك من غير مصاب (B)وP. اللثوية -infected (C) الفئران. يمكن رؤية انخفاض كبير في حجم العظم السنخي في P. اللثوية -infected الفئران بالمقارنة مع الضوابط غير المصابة. رؤوس سهام تشير إلى المناطق التي يحدث فقدان العظام مرئية في P. اللثوية الفئران -infected (لاحظ الزيادة في مساحة السطح المعرض من جذور الرحى). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. التقدمي التهاب داخل الشريان اللامسماة التالية P. الإصابة اللثوية مقاسا التصوير بالرنين المغناطيسي (A) الرنين المغناطيسي ممثل (MR) عائية من قوس الأبهر والأوعية الرئيسية لAPOE -/ - الماوس (B) محوري MR صورة من الخط الأصفر في ألف من الشريان اللامسماة على فأرة الحاسوب، 0.3MM دون التشعب لها. تم تصوير الشرايين اللامسماة بواسطة MRA في الأساس وفي 12 و 16 أسبوع بعد العدوى. (C) التغير الزمني في منطقة اللمعية (مم 2) تم حساب للفئران الفردية (ن = 10-12 / المجموعة). غير مصاب APOE - / - (الأزرق)، P. اللثوية -infected APOE - / - (الحمراء) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم تقرير 6. أون مواجهة منطقة الموضعة في الشريان الأورطي بالكامل. (A) السودان IV تلطيخ من الشريان الأورطي <م> أون آفات الوجه 16 أسبوع بعد العدوى مع P. اللثوية. (B) الكمي لمحتوى الدهون في الشريان الأبهر الكلي للغير المصابة (حرف البيضاء) وP. اللثوية الفئران -infected (رمز أسود) (ن = 10-13 / المجموعة). تم حساب نسبة الدهون في الشريان الأبهر التي تحتلها باستخدام يماغيج. * P <0.05. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
أصيب الفئران تغذت على وجبات طعام العادي مع P. - الرقم 7. التحليل المناعى من آفات الجيوب الأنفية الأبهري ذكر APOE - / اللثوية أو غير مصاب وضحى 16 أسابيع بعد الإصابة. كانت ملطخة Cryosections تم الحصول عليها من الجيب الأبهري مع مكافحةالماوس F4 / 80 وTLR2. شريط الحجم، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وP. يوفر اللثوية نموذج العدوى عن طريق الفم أداة قيمة لدراسة مسببات الأمراض التي يسببها التهاب مزمن في المواقع المحلية والنظامية. يسمح هذا النموذج الفريد توصيف كل من المضيف والممرض آليات محددة تسهم في التهاب مزمن والباثولوجيا المناعية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النموذج يمكن أن تستخدم للكشف عن استراتيجيات علاجية جديدة، بما في ذلك التحصين والتدخل الدوائي. الخطوات المبينة في هذا البروتوكول تصف نجاح استخدام هذا النموذج والتفاصيل منهجيات لتقييم بدء، التقدم، ونتائج P. اللثوية يسببها التهاب مزمن.
هناك العديد من الجوانب الحاسمة أن نأخذ في الاعتبار عند استخدام هذا البروتوكول لدراسة فقدان العظام التهابات. أولا، تجدر الإشارة إلى أن نتيجة الإصابة بفيروس P. يتم تحديد اللثوية ثلاثة عوامل رئيسية هي: 1) القابلية الوراثية للمضيف للإصابة 2) الممرضالفوعة (علم الوراثة من مسببات المرض) و3) مما أدى التفاعل المضيف الممرض (تفاعل الجينوم اثنين). القابلية للP. اللثوية يسببها فقدان العظام السنخية مصممة وراثيا في الفئران، وبالتالي يجب الحرص عند اختيار سلالة من الفئران لدراسة 17. استجابات المضيف التفاضلية بين السلالات الفطرية من الفئران يمكن الاستفادة من إجراء شاشات الوراثية إلى الأمام وتوصيف الجينات المسؤولة عن عرضة ومقاومة مسببات الأمراض التي يسببها التهاب مزمن. وبالإضافة إلى ذلك، يوجد تباين كبير في قدرة مختلف P. اللثوية سلالات للحث على فقدان العظم السنخي في الفئران 18. يستخدم هذا البروتوكول الفئران على خلفية C57BL / 6 بسبب توفر الفئران المعدلة وراثيا وقابليتها لتصلب الشرايين. P. اللثوية 381 سلالة يدفع فقدان العظام السنخية وتصلب الشرايين في فئران على C57BL / 6 الخلفية، ولقد تم تصميم عدة طفرات البكتيرية باستخدام ثيق سلالة.
فئران مقاومة خاصة إلى تصلب الشرايين وتطوير الآفات الشريانية العلنية يتطلب استخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا من تصلب الشرايين. نستخدم APOE - نموذج الفأر لأنه نموذج الفأر راسخة من تصلب الشرايين، لا يتطلب تغذية حمية عالية الدهون لتشكيل الآفة، ويلخص جوانب كثيرة من الأمراض التي تصيب البشر 19 - /. نوع من النظام الغذائي لتغذية الحيوانات أثناء التجربة هو متغير مهم. بالنسبة لغالبية عملنا، ونحن إطعام الفئران حمية طعام طبيعي لتجنب مساهمة الدهون الخارجية في تفسير نتائجنا. في الدراسات الأولية، وجدنا أن تغذية الفئران حمية عالية الدهون أقنعة الاختلافات في وجه أون منطقة الآفة بين غير مصاب وP. -infected اللثوية الفئران داخل الجيب الأبهري. ومع ذلك، وارتفاع الدهون واتباع نظام غذائي P. اللثوية العمل بالتآزر العدوى عندما تطور inflamويتم رصد املعلومات في اللامسماة بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي أو علم الأنسجة 11. في الفئران، الشريان اللامسماة لديه درجة عالية من التقدم آفة، والآفات في هذا الشريان صريحة السمات المميزة لمرض السريرية في البشر بما في ذلك تضييق السفينة، وسائل الإعلام ضامرة، والتهاب ماحول الأوعية، وتعطيل اللوحة. الفروق في تركيب الخلوي للآفات واضحة في مواقع تشريحية مختلفة. الضامة هي خلايا المناعة الأولية التسلل آفات الجيوب الأنفية الأورطي، في حين تتكون آفات الشريان اللامسماة كل الضامة وخلايا T.
المدة التجريبية ونقطة الوقت الذي يتم تقييم نقاط النهاية التهابات هي عوامل إضافية في الاعتبار عند تقييم المبادرة، تقدم، ونتائج P. اللثوية يسببها تصلب الشرايين. أثبتنا سابقا أن P. اللثوية -infected APOE - / - الفئران تظهر تسلل بلعم والتعبير مرتفعة من علامات المناعية الفطرية، والثانية زيادة ترسب البلاك التهابات في أقرب وقت 24H بعد الإصابة الماضي داخل الجيب الأبهري وهذا يمكن الوقاية منها عن طريق التطعيم 16. في أيدينا، والتهاب وزيادة الباثولوجيا المناعية مع التقدم في السن وتكون واضحة تصل إلى 24 أسابيع بعد الإصابة. ومع ذلك، القرارات المتعلقة مدة الدراسة تعتمد في نهاية المطاف على الفرضية الأساسية التي تجري دراستها، وطريقة التحليل والمعرفة المسبقة لمدى تصلب الشرايين تحت ظروف بيئية معينة.
استخدام تقنيات التصوير غير الغازية لمراقبة التهاب التدريجي في الشريان اللامسماة يمكن استخدامها لتوجيه المدة التجريبية. المسلسل التصوير بالرنين المغناطيسي تسمح للدراسات مفصلة لتطور تصلب الشرايين في نفس الحيوان التي يمكن أن تصور تضييق التجويف الشرياني ومناطق جدار الوعاء الدموي صغيرة 20. على عكس الطرق التقليدية، مثل الدهون تلطيخ السفن تشريح، لا يتطلب التصوير MR القتل الرحيمويسمح للدراسات طولية لتقييم بدء وتطور تصلب الشرايين. بالتزامن مع الفئران المعدلة وراثيا، المسوخ البكتيرية، أو العلاجات التجريبية، فإن المعلومات التي تقدمها الزمنية التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن استخدامها لتقييم تأثير الوراثة المضيف، والعوامل الممرضة الفوعة، والتدخل العلاجي. باعتبارها وأضاف صالح، والأنسجة المناعية يمكن أن تستخدم لصبغ للالدهون وخلايا التهابية في إنهاء التجربة للتحقق من صحة البيانات التصوير. كنا مؤخرا هذه الأساليب لإثبات أن العدوى عن طريق الفم مع P. اللثوية يسرع تصلب الشرايين في arterties اللامسماة من APOE - / - الفئران، أن التطعيم يوفر الحماية من تطور اللوحة، ويرتبط مع انخفاض في تراكم الدهون وخلايا التهابية 11.
باختصار، هذا البروتوكول يحدد الخطوات المطلوبة لإنتاج نموذج قوي من العوامل المسببة للأمراض التي يسببها التهاب مزمن، وكذلكوالأساليب المستخدمة لتقييم التهاب في المواقع المحلية والنظامية. جانبا من استخدام هذا النموذج لدراسة آليات المضيف والممرض المحددة المعنية في فقدان العظام التهابات وتصلب الشرايين، ويمكن تكييفه لدراسة مساهمة الناجمة عن مسببات المرض التهاب مزمن إلى نماذج المرض إضافية. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا للمرض بما في ذلك التهاب المفاصل والسكري والسرطان. الأدلة الناشئة يشير إلى أن عددا من الأمراض المزمنة من مرض غير معروف قد يكون أصول المعدية. وتشمل هذه الأمراض الورمية، المناعة الذاتية، وأمراض التهابات، وتعرض للخطر معا الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. وبالتالي، فإن استخدام نماذج حيوانية لدراسة دور العوامل الممرضة في الأمراض يقودها التهاب مزمن لديه القدرة على التأثير العلاجي واسع وتحسين التشخيص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للحساسية والأمراض المعدية منح P01 A1078894 إلى CAG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira analysis software | Visualization Sciences Group | ||
| Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500 | Microbiology International | ||
| BHI | Becton-Dickinson | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | 51280-5G | |
| Menadione (Vitamin K) | Sigma-Aldrich | M5625-25G | |
| Yeast Extract | Becton-Dickinson | 212750 | |
| Carboxymethyl cellulose (medium viscocity) | Sigma-Aldrich | C-4888 | |
| Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml | Hi-Tech Pharmacal | NDC 50383-823-16 | |
| μCT 40 | Scanco | ||
| HistoChoice Tissue Fixative | Sigma-Aldrich | H2904 | |
| Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261-25G | |
| Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer | Bruker | ||
| Paravision | Paravision | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Rat anti-mouse F4/80 | Serotec | MCA497R | |
| Rat anti-mouse TLR2 | eBioscience | 13-9021-80 | |
| Leica S4 dissecting scope | Leica | ||
| Microm HM 550 cryostat | Microm |
References
- Nathan, C., Ding, A.
- Karin, M., Lawrence, T., Nizet, V. Innate immunity gone awry: linking microbial infections to chronic inflammation and. 124, 823-835 (2006).
- Connor, S. M., Taylor, C. E., Hughes, J. M. Emerging infectious determinants of chronic diseases. Emerging Infectious Diseases. 12 (7), 1051-1057 (2006).
- Barth, K., Remick, D. G., Genco, C. A. Disruption of immune regulation by microbial pathogens and resulting chronic inflammation. Journal of Cellular Physiology. , (2012).
- Hayashi, C., Gudino, C. V., Gibson, F. C. 3rd, Genco, C. A. Review: Pathogen-induced inflammation at sites distant from oral infection: bacterial persistence and induction of cell-specific innate immune inflammatory pathways. Molecular Oral Microbiology. 25 (5), 305-316 (2010).
- Gibson, F. C. 3rd, Ukai, T., Genco, C. A. Engagement of specific innate immune signaling pathways during Porphyromonas gingivalis induced chronic inflammation and atherosclerosis. Frontiers in Bioscience: a Journal and Virtual Library. 13, 2041-2059 (2008).
- Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W.
- Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
- Baker, P. J., Carter, S., Dixon, M., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Serum antibody response to oral infection precedes but does not prevent Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Oral Microbiology and Immunology. 14 (3), 194-196 (1999).
- Gibson, F. C. 3rd, Hong, C., et al. Innate immune recognition of invasive bacteria accelerates atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation. 109 (22), 2801-2806 (2004).
- Hayashi, C., Viereck, J., et al. Porphyromonas gingivalis accelerates inflammatory atherosclerosis in the innominate artery of ApoE deficient mice. Atherosclerosis. 215 (1), 52-59 (2011).
- Hayashi, C., Madrigal, A. G., et al. Pathogen-mediated inflammatory atherosclerosis is mediated in part via Toll-like receptor 2-induced inflammatory responses. Journal of Innate Immunity. 2 (4), 334-343 (2010).
- Hayashi, C., Papadopoulos, G., et al. Protective role for TLR4 signaling in atherosclerosis progression as revealed by infection with a common oral pathogen. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189 (7), 3681-3688 (2012).
- Papadopoulos, G., Weinberg, E. O., et al. Macrophage-Specific TLR2 Signaling Mediates Pathogen-Induced TNF-Dependent Inflammatory Oral Bone Loss. The Journal of Immunology. , (2012).
- Gibson, F. C. 3rd, Hong , C., et al. Innate immune recognition of invasive bacteria accelerates atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation. 109 (22), 2801-2806 (2004).
- Miyamoto, T., Yumoto, H., Takahashi, Y., Davey, M., Gibson, F. C. 3rd, Genco, C. A. Pathogen-accelerated atherosclerosis occurs early after exposure and can be prevented via immunization. Infection and Immunity. 74 (2), 1376-1380 (2006).
- Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infection and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
- Baker, P. J., Dixon, M., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Heterogeneity of Porphyromonas gingivalis strains in the induction of alveolar bone loss in mice. Oral Microbiology and Immunology. 15 (1), 27-32 (2000).
- Daugherty, A.
- Weinreb, D. B., Aguinaldo, J. G. S., Feig, J. E., Fisher, E. A., Fayad, Z. A. Non-invasive MRI of mouse models of atherosclerosis. NMR in Biomedicine. 20 (3), 256-264 (2007).
