Summary
Akut beyin travması bugüne kadar yeterli bir tedavisi olmayan ciddi bir yaralanma olduğunu. Multiphoton mikroskopi uzunlamasına akut beyin travması gelişim sürecini inceleyerek ve kemirgenlerde terapötik stratejiler sondalama sağlar. Beynin in vivo iki foton görüntüleme ile incelenmiştir akut beyin travması iki model bu protokolde gösterilmiştir.
Abstract
Akut beyin travması genellikle farklı kazalarında baş hasar sonuçları ve nüfusun önemli bir kısmını etkiler de, bunun için etkin bir tedavisi henüz yoktur. Şu anda kullanılan hayvan modellerinin Sınırlamalar patoloji mekanizmasının anlaşılmasını engellemektedir. Multiphoton mikroskopi uzunlamasına fizyolojik ve patolojik koşullar altında sağlam hayvan beyin içinde hücreleri ve dokuları inceleyerek sağlar. Burada, biz posttravmatik koşullar altında beyin hücre davranışı iki foton görüntüleme ile incelenmiştir akut beyin hasarı iki model tarif. Seçilen bir beyin bölgesi beyin parankiminde kontrollü bir genişlik ve derinlikte bir travma üretmek için keskin bir iğne ile yaralandı. Önerilen yöntem, aynı anda, ilaç uygulaması ile kombine edilebilir bir şırınga iğnesi ile stereotaksik dikmek kullanır. Bu yöntem, memeli beyin, akut travma patofizyolojik hücresel mekanizmaları incelemek için bir gelişmiş araç olarak kullanılabilir öneriyoruz
Introduction
Akut beyin hasarı, motorlu araç kazalarında yaralanma insidansı yüksek olan önemli bir halk sağlığı sorunudur düşer ya da saldırılar ve müteakip kronik sakatlık yüksek yaygınlık. Beyin hasarının tedavisine terapötik yaklaşımlar, böylece, hastane öncesi cerrahi ve yoğun bakım etkililiğini sınırlayan, tamamen semptomatik kalır. Bu beyin hasarı, sosyal ve ekonomik etkisi özellikle şiddetli hale getirir. Çeşitli nedenlerle için, klinik çalışmaların en yeni tedavi yaklaşımları kullanarak beyin hasarı sonrası iyileşme iyileşme göstermek için başarısız oldu.
Hayvan modelleri ilaç etkinliği beyin hasarı olan hastalarda tahmin edilebilir bir aşamaya yönelik yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için çok önemlidir. Şu anda, kafa travması birkaç iyi kurulmuş hayvan modelleri kontrollü kortikal etkisi 1, sıvı perküsyon yaralanma 2, dinamik kortikal deformasyon 3, ağırlık düşmesi gibi, mevcut4, ve fotoğraf yaralanma 5. Deneysel modellerin bir dizi kafa travması ile ilişkili patoloji bazı morfolojik, moleküler ve davranışsal yönlerini incelemek için kullanılır olmuştur. Ancak, tek bir hayvan modeli, yeni tedavi stratejileri doğrulayarak tamamen başarılıdır. Beyin hasarı, güvenilir, tekrar üretilebilir ve kontrollü hayvan modellerinin geliştirilmesi karmaşık patolojik durumun değerlendirilmesi için gereklidir.
Son mikroskopik görüntüleme teknolojileri ve genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere yeni kombinasyonu birincil yaralanma, ikincil yaralanma ve rejenerasyon yayılması, birincil travması beyin hasarı tüm aşamalarını, araştırmak için benzersiz bir fırsat sunuyor. Özel olarak, in vivo iki foton mikroskopi kemirgen beyin derin katmanlarında kortikal hücre ve hatta hücre içi yapıların gerçek zamanlı görselleştirme sağlayan eşsiz bir doğrusal olmayan optik bir teknolojidir. Hücre ve organizasyonu çeşitli türleriNelles farklı floresan belirteçleri birleştirerek aynı anda görüntülü olabilir. Bu güçlü aracını kullanarak, posttravmatik koşullar altında beyin yaşayan dinamik morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler oluşturulabiliyor. Beyin hasarı okuyan in vivo iki foton mikroskopi avantajları son zamanlarda Kirov ve meslektaşları 6 tarafından gösterildi. Hafif fokal kortikal kontüzyon modeli kullanılarak, bu yazarlar pericontusional kortekste akut dendritik yaralanma lokal kan akışında düşüş kapılı olduğunu gösterdi. Ayrıca, çürük site çevresinde metabolik tehlikeye korteks daha da yayılmasını depolarizasyon hasar olduğunu gösterdi. Bu ikincil hasar travmatik beyin hasarının sonuçları daha şiddetli hale sinaptik devreyi etkiler.
Burada, lokal beyin için gelişmiş bir model olarak eş zamanlı, topikal ilaç uygulamasıyla kombine edilebilir bir şırınga iğnesi ile stereotaksik dikmek bir yöntem önerilmektediryaralanması ve in vivo memeli beyninde akut travma patofizyolojik sonuçlarını incelemek için bir araç olarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada sunulan tüm prosedürleri hayvan bakımı (Hayvan Deneyleri 62/2006 tarihinde Finlandiya Yasası) için yerel rehberlik göre yapılmıştır. Hayvan lisans (ESAVI/2857/04.10.03/2012) yerel otorite (ELÄINKOELAUTAKUNTA-Ella) elde edilmiştir. 1-3 aylık yaş arasında Yetişkin fareler, ağırlığı 24-38 g, sertifikalı Üniversitesi'nin hayvan tesisinde ayrı kafeslerde tutulur ve yiyecek ve su ad libitum sağlandı.
1.. Bir Kraniyal Pencere sayesinde Beyin Hasarı Görüntüleme
- Hayvanlara anestezi ve işlem alanı hazırlanması
- Filtre ile sterilize edilmiş fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde çözüldü ketamin (Ketalar, 80 mg / kg) ve ksilazin (Rompun, 10 mg / kg) bir karışımı peritoneal enjeksiyonu ile farelerin anestezisi. Anestezi derinliği doğrulamak için fare refleksleri düzenli (kuyruk ve ayak tutam prob) kontrol edin. Uygun zaman, uygun anestezi korumak için, dozu artırın ama overd önlemekose.
- Anestezi kurtarma sonra cerrahi işlem, görüntüleme oturumu ve ilk bir saat içinde bir ısıtma pedi kullanarak 37.0 ° C'de hayvan koruyun.
- Kurumasını fare gözleri korumak için, göz yağ uygulayın.
- Inflamasyon ve serebral ödemi azaltmak için deri altına enjeksiyon ile deksametazon (Rapidexon veteriner, 2 mg / kg) yönetmek.
- Önce ya da hemen cerrahi sonrası 30 dakika kadar (Ketoprophene periton örneğin) bir analjezik yönetmek. Hayvan gibi, hareket yemek veya içmek, kilo kaybı ya isteksizlik gibi herhangi bir ağrı belirtileri, sergiler, tükürük, piloerection veya anormal solunum ameliyattan sonra, analjezik enjeksiyonu tekrar geliyor.
- Bir tıraş makinesi (Malzeme ve Ekipmanları bakınız) ile mouse 'başını tıraş. Bıyıklarını zarar kaçının.
- Traş alanını temizlemek için% 70 etanol çözeltisi ile fare kafasına cilt davranın.
- Cerrahi makas kullanma (Malzeme veEkipman) ve forseps (Malzeme ve Ekipmanları bakınız), alnına kulak arasındaki orta hattan keseceksiniz.
- Yavaşça künt mikrocerrahi bıçak ile kafatasına bağlı bağ dokusu kazınması.
- Yanlara cilt sınırları kaydırın ve hafifçe baş ve deri fiksasyonu için kafatasının işitsel deliklerinin içine kulak çubukları çekin.
- Steril PBS ile kafatası temizleyin ve% 0.5 klorheksidin ile fare kafasına ameliyat siteyi tedavi, daha sonra steril pamuklu ve basınçlı hava bir arada kullanarak kafatası yüzeyi kurulayın.
- Hıyar yaralanma eziyeti
- Bir hayvan sahibinin küçük bir hayvan stereotaksik aleti (Malzeme ve Ekipmanları bakınız) yerleştirin.
- Hayvanın kafatası yüzeyi üzerinde odaklanmak yanında stereotaksik enstrümana binoküler mikroskop konumunu ayarlayın.
- Binoküler mikroskop kullanarak, kafatası üzerinde Bregma noktasını bulun.
- Regio tespitstereotaksik koordinatları kullanarak ilgi n.
NOT: Doğrudan yüzeyel kortikal damarları üzerinde bulunan ilgi bu alanlardan kaçının. Bu imha şiddetle travma ilerlemesini etkileyebilir. - Seçilen bölgenin üstüne 30 G iğne yerleştirin ve kafatası yüzeyi çizilmeye tarafından hedef siteyi işaretleyin.
- Etkilenen kemik yüzey alanının gereksiz derinleşmesini önlemek için mümkün olan tüm önlemleri ile kafatası delin. Mikroskop altında bir yüksek hız cerrahi matkap (Malzeme ve Ekipmanları bakınız) kullanın. Sıvı delinmiş alanında görünür yoksa delme işlemini durdurun.
- Iğne ile delinmiş kuyunun alt dokunun.
- Hıyar uygulama sitenin koordinatlarına göre 0.5-2.0 mm derinliğe kadar, beyin (ekleme hızı 5-10 mm / dk) içine düzgün bir iğne batırın.
- Hemen istenen derinliği (geri çekilme hızı 5-10 mm / dk) ulaştıktan sonra iğneyi çıkarın ve küçük bir tampon ile dikmek sonra ortaya kan silin (see Malzeme ve ekipman).
- Bir mikroenjektör pompa (WPI) ve 10 ul Hamilton şırıngası cam pipet ile monte kullanarak lezyonun siteye 100 uM sülforodamin 101 mikroenjeksiyon veya ilgi duyulan bir başka bileşik yapın.
Not: borosilikat cam kılcal cam pipet hazırlanması sırasında, 10-20 um'lik bir çapa ucu netleştirmek. - 2-5 nl / sn 'lik bir oranda enjeksiyon çözeltisi 250-1,500 nl infüze.
NOT: Beyin parankiminde en az 5 dakika boyunca infüzyon bitiminden sonra pipet bırakın, ardından çözüm çıkışlarını engellemek için yavaşça ve nazikçe çıkarın.
- Kronik kafatası pencere için kraniotomi
- Yaralanma sitenin etrafında bir daire pencere yapmak için yavaşça ve dikkatle kafatası matkap. 3-3.5 mm pencere çapı kullanın.
- Wi kapsayacak şekilde korteks tampon bir damla (125 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM glükoz, 10 mM HEPES, damıtık H 2 O 2 mM CaCl2 ve 2 mM MgSO 4) uygulayınndow.
- Kranial pencerede bir yuvarlak cam lamel (# 1.5 kalınlık) yerleştirin.
- Coverslip etrafında korteks tampon aşırı çıkarın.
- Poliakrilik yapıştırıcı ile lamel kenarları mühür (Malzeme ve Ekipmanları bakınız).
Not: tutkal lamel üst yüzeyine uygulanmaz emin olun. Cam kapak yapıştırıcı ile kirlenmiş ise, daha sonra dikkatlice bir MicroBlade ile kirlenmesine tutkal kaldırmak, cam stabil kafatasına yapıştırılmış kadar bekleyin ve cam yüzeyi üzerindeki tutkal kuruduktan. - 5 dk tutkal kadar kuruması için bekleyin.
- Metal tutucu yerleştirilebilir böylece kulak çubuğu yükseklik vidalarını kullanarak, kafa konumunu ayarlayın.
- Çelik tutucu halka (Malzeme ve Ekipmanları bakınız) poliakrilik tutkal küçük bir miktar uygulayın.
- Geriye yönlendirilmiş metal tutucu saplı cam lamel çelik sahibinin halka Tutkal.
- 5 dk tutkal kadar kuruması için bekleyin.
- Mviskoz koşullarına ulaşmak için 3,5 cm Petri (ya da analog) olarak poliakrilik tutkal ile ix diş çimento (Malzeme ve ekipman bakınız).
- Çimento + tutkal karışımı ile kafatası pencerenin sınırları Seal ve cilt sınırına kadar aynı karışımı ile kafatası yüzeyi maruz kapsamaktadır.
- 15 dk çimento + tutkal karışımı kurumaya bırakın ve daha sonra kulak çubuklarını kaldırmak için bekleyin.
- Protokol 3 de tarif edildiği gibi ilgili bölge ve bir kontrol alanı için iki foton uyarma mikroskopik (TPEM) görüntüleme yapın.
- Görüntüleme sonra, hayvan bir ısıtma yastığı anestezi kurtarmak ve tam iyileşme kadar gözlem altında ayrı bir kafes içinde tutmak için izin verir. Islak gıda çiğneme ve hidrasyon kolaylaştırmak için verilebilir.
2. Beyin Hasarı Görüntüleme İnceltilen Skull Through
- Anestezi yapılmasını ve işlem alanı hazırlanması
- Fare anestezisi ve travma indüksiyon için hazırlamakAdım 1.1 'de tarif edildiği gibi.
- Kafatası incelmesi ve prick yaralanma eziyeti
- Hayvan sahibinin küçük bir hayvan stereotaksik aleti (Malzeme ve ekipman bakınız) yerleştirin.
- Hayvan kafatası yüzeyi üzerinde odaklanmak yanında stereotaksik alet bir binoküler mikroskop konumunu ayarlayın.
- Binoküler mikroskop kullanılarak kafatası Bregma noktasını bulun, stereotaktik koordinatlarına göre yansıması için beyin alanlarını belirlemek ve tırmalama ile işaretleyin.
NOT: kafatası istikrar bu alanlarda tehlikeye gibi Kafatası inceltme pozisyon, kraniyal sütür üzerinde veya yakınında yer olmamalıdır. Ayrıca, büyük kortikal veya meningeal gemiler ve kafatası dikişler altında bulunan Meninksler görüntüleme eserler neden muhtemeldir. - Hayvanın kafatası ilgi alanı üzerinde yapıştırıcı ile kaplanmış metal tutucu yerleştirin, hafif baskı uygulamak ve metal tutucu sıkıca kafatasına yapıştırılmış kadar 5 dakika bekleyin. Viskoz koşullarına ulaşmak için 3,5 cm Petri (ya da analog) olarak poliakrilik tutkal ile diş çimento (Malzeme ve ekipman bakınız) karıştırın.
- Çimento + tutkal karışımı ile metal tutucunun sınırları Seal ve cilt sınırına kadar aynı karışımı ile kafatası yüzeyi maruz kapsamaktadır.
- 15 dk çimento ve tutkal karışımı kuruması için bekleyin.
- Nonpolymerized tutkal kalıntıları, yıkanır, böylece, inceltilmiş kafatası bölge ve PBS ile metal tutucunun parça çevreleyen birkaç kez yıkayın.
NOT: Bu sahibine kafatası istikrarlı eki sağlamak için çok önemlidir. Bu görüntüleme sırasında preparat kararlılığı sağlar. - Binoküler mikroskop yüksek büyütme modunu kullanarak, çapı ~ 0.5-1.5 mm inceltilmiş kafatası alanı oluşturmak için bir yüksek hızlı mikro-matkap ile kafatası kemiğinin üst katmanlarını kaldırmak. Kemik enkaz kaldırmak için sondaj sırasında basınçlı hava kullanın. Sondaj intermittentl gerçekleştirinsürtünme kaynaklı aşırı ısınmasını önlemek için, inceltme işlemi sırasında y. Oda sıcaklığı çözeltisi kullanılarak matkap ucu soğutun ve düzenli ısı emmek için inceltilmiş bölgeye tampon uygulanır.
NOT: korteks zarar görmesini önlemek için, ince bir tabaka (<50 mikron) kadar geniş bölgeleri (> 1.5 mm) üzerinde matkap yok.
NOT: kemirgen kafatası kemik yapısı süngerimsi kemiğin kalın bir tabaka ile ayrılmış kompakt kemiğin iki ince katmanlardan oluşur. Kan damarlarını içeren süngerimsi kemik formu konsantrik daireler ve kanalcıklan minik boşluklar. Dış yoğun kemik tabakası ve süngerimsi katmanın en ortadan kaldırmak için mikrotur kullanın. Süngersi kemik içinde kan damarlarının bozulması kanamaya neden olabilir. Bu kanamayı durdurmak için hemostaz kollajen sünger kullanın. - , Süngersi kemiğin çoğunluğu kaldırıldı olup olmadığını incelemek için, ikinci harmonik oluşumu (SHG) görüntüleme kullanın. Kalan kemik inci olduğundan emin olun, aşırı incelmesi önlemek için dikkatli olunBu hazırlama aşamasında 50 um daha icker.
- Inceltilmiş bölgenin üstüne sıcak tampon bir damla (35-37 ° C) koyun. Ayrıca kemik katmanları kaldırmak ve ~ 20 mikron kalınlığında kemik çapı ~ 700 mikron düzgün bir alan oluşturmak için Bur Terbiye mikrocerrahi bıçak veya Micro kullanın. Bu adım sırasında, tekrarlayan SHG görüntüleme gerçekleştirmek ve düzenli kemik kalınlığını ölçmek için yararlıdır.
- Ilgi bölge ve bir kontrol alanı için TPEM görüntüleme gerçekleştirin.
- Bölge kesinlikle yatay konumlandırılmış inceltilmiş şekilde kulak çubuğu yükseklik vidaları kullanarak kafa konumunu ayarlayın. Inceltilmiş bölgenin üstüne iğne yerleştirin ve hedeflenen sitenin altında hiçbir büyük gemiler var olduğundan emin olun.
- Inceltilmiş kafatası yüzeyinden 0.5-2.0 mm derinliğine, beyin içine iğne batırma ve pislik uygulama mevkii koordinatlarına göre bir lezyon yapın.
- İğneyi çıkarın ve t sonra ortaya çıkan kanama bastırmakO hemostatik tampon (Malzeme ve ekipman bakınız) ile beyin hasarı akut. Yaralanma yerinde kan pıhtıları formu ve damar nabız durana kadar bekleyin.
- Bölüm 1.2.10 de yukarıda tarif edildiği gibi, 100 uM sülforodamin 101 veya lezyon siteye ilgi bir bileşiğinin mikroenjeksiyon yapın.
- Protokol 3 de tarif edildiği gibi yaralanma ilerlemesini ve kurtarma izlemek için görüntüleme TPEM yapın.
- Görüntüleme sonra, hayvan bir ısıtma yastığı anestezi bilinç kazanmak için izin verir. Gözetimsiz hayvan bırakın ve sadece tam fiziksel iyileşme sonra evde kafes iade etmeyin.
3. Görüntüleme
- Özel inşa çerçeveye metal tutucu takarak mikroskop altında hayvan yerleştirin.
- Görüntüleme için, Mai Tai DeepSee lazer ve in vivo iki foton için optimize XLPLN 25X 1.05 NA suya daldırma hedefi ile donatılmış, örneğin FV1000MPE iki foton mikroskop kullanımıgörüntüleme.
- Geniş alan floresan modunu kullanarak mikroskop altında lezyon sitesini tanımlamak. Beyin damarlarını görselleştirmek ve kan damarlarının gözlenen desenine göre kontrol alanını seçmek için uzun bir pas filtreleri kullanın.
- Görüntü ikinci harmonik üretimi (SHG) sinyali, 800 nm dalga boyuna ayar femtosaniye lazer ve 380-410 nm bypass filtresi kullanılarak yayılan ışığı toplamak. Flüoresan görüntüleme için, yayılan ışığı toplamak için bant geçiş filtresi (515-560 nm) kullanarak ve aşağıdaki dalga floresan uyarmak için kullanılır: GFP-860 nm, 950 nm-YFP.
- Görüntü alımı için Fluoview yazılımı kullanın.
- Mağaza sonraki tekrarlayan görüntüleme için her ROI koordinatları. Görüntü zamanla aynı İB'leri ve Koordinatları görüntü örtüşme maksimize etmek için her zaman ayarlayın.
- Uygun yazılım (örn.. İmageJ) ile görüntüleri analiz. Burada yer yeniden düzenlemesi Imaris yazılımı kullanılarak yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transgenik farelerin posttravmatik beyin görüntüleme için 1), kronik kafa penceresi ve 2) kafatası incelme,: Biz iki operasyon prosedürlerini optimize ettik. Deney preparatların şematik görünümü, Şekil 1 'de sunulmuştur. 0.3 mm OD (30 G) çelik iğne ile delme travmatik delinmiş de (Şekil 1A) uygulanır. Kafatası inceltme yaklaşık 300 mikron (Şekil 1C) bir sınırı empoze eğilimi ise başarılı bir kafa penceresi hazırlık Thy1-YFP-3D rekonstrüksiyon gösterildiği gibi, pial yüzey (Şekil 1B) altında 650 mikron derinliğe kadar görüntüleme sağlar H fare kortikal piramidal nöronlar üzerinde etkir.
Beyin korteksinin kontrollü bir hacim içinde dendritler ve kılcal ağlar imha eliminasyonu hıyar travma sonuçları. İlk iki gün boyunca, lezyon alanı artmış ve travma kaynaklı dallantı blebbing ve dendritik retraksiyon b oluşumuperilesion alanlarda ulbs, in vivo multiphoton mikroskobu (Şekil 2) kullanılarak gözlendiği gibi.
Biz hemen yaralanma (Şekil 3A) sonra görüntü aktivasyon ve CX3CR1-EGFP farelerde mikrogliya göç incelme kafatası yapıldı. SHG görüntüleme tam yaralanma sitesi (Şekil 3B) tanımlamak için değerli bir araç sunuyor. SHG sinyalleri üretmek hücre dışı matriks molekülleri büyük ölçüde prick travma beyin parankiminde zenginleştirilmiştir. İlk olarak, ince mikroglial işlemler daha sonra mikroglial hücreler, hasar bölgesi (Şekil 3A) sınırına göç alınır.
Ince bir cam pipet sokma ve boyanın teslim neden olduğu potansiyel yaralanmaları tahmin etmek için, in vivo beyin travması olmadan Thy1-YFP-H farelerde sülforhodamin 101 mikroenjeksiyon ile iki-foton mikroskopi deneyler. Şekil 4'te gösterilen çizimin Örnek MI göstermekenjeksiyondan sonra croinjection Alanı 3 saat. Pipet sokma iz SHG (Şekil 4A) ile görselleştirilmiştir beyin meninks görülebilir. Astrositler enjeksiyonu (Şekil 4B) ile getirilen Sulphorhodamine 101 ile etiketlenir. Thy1 organizatörü altında YFP ifade Dendritler blebbing veya retraksiyon ampuller gibi yaralanma herhangi bir morfolojik işaretleri (Şekil 4 C) göstermek değil.
Şekil 1. Kafatası pencere ya da in vivo iki foton mikroskopi ile birlikte ince kafatası preparatları ile birlikte akut beyin hasarı gibi bir yöntem. 0.3mm, OD (30G) çelik iğne ile bir. Travmatik prick kuyuda uygulanır. İğne kısaca iyi altındaki derin beyin 0,5-2 mm içine daldırılır. B, C (C). D 'de gösterilmiştir. Hemen akut beyin hasarı. E sonra cam pencereden yüzeysel kan damarlarının parlak bir alan görünümü. Yaralanma uygulamadan önce kafatası inceltilmiş. Ilgi (beyaz kare) ve prick uygulama sitesi (kırmızı daire) seçtiğiniz bölge. Inceltilmiş bölgenin farklı bir alanı (kırmızı çerçeve) olası cerrahi kökenli eserler izlemek için görüntülü olmalıdır.
Inceltilmiş kafatası ile beyin travması gelişiminin uzunlamasına multiphoton görüntüleme Şekil 2.. Örneği. Bir. Içinkortikal nöronların 20 dakika travma eziyet sonra, inceltilmiş kafatası hazırlık aracılığıyla görüntülü olarak. B YFP etiketli dendritlerin çevrili yaralanma sitenin p görünümü. Panel A'da belirtilen alanın büyütülmüş görünüşüdür. C. B'de olduğu gibi beynin aynı bölge, 5 gün travma sonrası reimaged. Kırmızı oklarla - Dendrite blebbing beyaz oklar, dendritik retraksiyon ampuller ile gösterilir.
Şekil 3,. In vivo görüntüleme multiphoton örneğin flüoresan protein, boyalar ve ikinci harmonik üretimi için uygun olan farklı sinyal işaretleri kullanarak beyin travması gelişimi esnasında izlenmesi inflamasyon ve glia aktivasyon örnekler. Görsel beyin hasarı edildikten 3 saat sonra elde edildi.
Bir cam mikropipet ile çözelti enjeksiyonu ile yapılan doku etkisinin Şekil 4.. Incelenmesi. Bir. Bir izleme (shoSHG enjeksiyon. Kahvaltı sonrası beyin menenjlerin 3 saat görselleştirme kesikli çizgi) ile wn. Enjeksiyonu ile ortaya Sulphorhodamine ile etiketlenmiş astrositler olarak ayrılırlar. C. Thy1 organizatörü altında YFP ifade Dendritler. D. A (SHG - gri) Kombine görüntüsü, B (astrocytes - kırmızı), C (nöron dendritler - sarı).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beyin travması ani, öngörülemeyen bir olay. Burada, örneğin nörodejenerasyon, dendrit eliminasyonu, beyin ödemi, glial yara izi, fokal subaraknoid kanama ile birleştiğinde serebral korteks kanamalar ve artan geçirgenliği gibi beyin hasarı sonrası insan hastalarda gözlenen patolojik değişikliklerin bir spektrumunu üretir hayvan modeli tanımlamak Kan-beyin bariyeri. Birincil ve ikincil patogenezi yanı sıra, travma sonrası iyileşme incelemek için, bu yaralanma modeli iyi nöronal ve glial yapıların vivo görselleştirme uzunlamasına ile kombine edilmiştir. Transjenik fare hatları (Thy1-YFP-H) 7, astrositlerin (GFAP-EGFP) 8 nöronlarda floresan proteinleri ifade veya mikroglia (CX3CR1-EGFP) 9 bu kullanılmıştır. Ayrıca, Sulfarhodamine 101 10 ile ikinci harmonik üretimi (SHG) görüntüleme ve astrocyte yükleme kullanıldı.
Burada açıklanan model, pene tartışıldıBeyin hasarının işleyen türü. Bu nedenle, mevcut modelin bir sınırlama kapalı kafa yaralanma mekanizmaları hakkında bilgi vermek olmamasıdır. Son zamanlarda Kılıç ve yazarları pericontusional kortekste 6 hücre davranışı üzerine multiphoton görüntüleme sonuçlarını bildirdi. Kapalı kafa travması dikkate alınarak daha sık tıbbi vaka olduğu, yazarlar tarafından bildirilen metodolojik yaklaşımı son derece darbe beyin travması 11 alanında geleneksel araştırma yöntemlerini tamamlamak için umut vericidir.
Biz kronik kranial pencereyi 12 ve beyin yaşayan posttravmatik koşullarda hücre davranışlarını incelemek için 13 hazırlıklarını incelme kafatasını hem de kullanılmaktadır. Her iki yöntem de bazı avantajları ve sınırlamaları vardır. Böylece, kronik kafa penceresi daha iyi çözünürlük, beyin dokusu ve çoklu görüntüleme oturumları için kolaylık derinliklerine optik girmesini sağlar. Tersine, kafatası inceltme inci iltihaplanma neden daha az olasıdırbelki de daha önemlisi e görüntüleme sitesi, ve, uyuşturucu ve boyalar tekrarlayan uygulamaları sağlar. Deneyler bu tür uygulanacak farmakolojik maddelerin birkaç örnek, Tablo 1 'de verilmiştir.
| Ajan tipi | Enjekte ajan | Biyoloji / eczane araştırma alanları |
| Anti-enflamatuar | Siklosporin A | Travmatik beyin hasarı, sekonder hasarı, nörodejeneratif |
| Toksinler | Tetrodotoxin | TBI - ikincil hasarın, excytotoxicity |
| Bicuculline | TBI - İkincil hasar, klorür homeostasis | |
| Sinyal yollarının önleyicileri | PD98059 (MAPKK inhibitörü) | enflamasyon, ikincil hasar, travma sonrası hücre ölümü, sinir dejenerasyonu ve yenilenme mekanizmaları işaret |
| SU6656 (Src familyasına ait kinaz inhibitörü) | ||
| Nörotrofik faktörler | Beyin türevli nörotrofik faktör, BDNF | TBI - nöronal hayatta kalma ikincil travma sonrası beyin hasarı hasarı, nöro sonra |
| Virüsler | Protein ekspresyonu için lentiviral vektörler | travma sonrası nörodejenerasyon ve yenilenme moleküler mekanizmalar, in vivo görüntüleme için hasarlı beyin hücre tipleri ayırıcı etiketleme |
| Protein ekspresyonu için adenoviral vektörler | ||
| Ca 2 + floresan göstergeleri | Fluo-2, 4 | travma sonrası enflamasyon mekanizmalar sinyal, hücre ölümü, hücre göçü, aksonal / dendritik yenilenmesi |
Tablo 1. Prick yaralanması modelinde kortikal enjeksiyon için farmakolojik ajanlar ve boyalar.
Fizyolojik ve patolojik koşullar altında son derece önemli olan biyokimyasal olaylar bir yelpazede viral yapılar vasıtasıyla ilave kimyasal inhibitörleri, fluoresan göstergeler ve mutant protein ile problanabilir. Kafatası inceltme hazırlanması tarafından sağlanan belirli bir zaman penceresi seçimi için avantajları bu çalışmalar için çok uygun olabilir.
Bu çalışmada, biz yaralanma siteyi tanımlamak için ikinci harmonik üretimi sinyali kullanılır. Seçenek olarak ise, yaralanan sınırları Örneğin, yüksek molekül ağırlıklı dekstran floresan konjugatı (2.000.000 Dalton) için, zayıf bir difüzyon flüoresan boya ile belirtilen olabilir.
Son zamanlarda, Schaffer ve arkadaşları, 14, kronik hazırlık kullanmışfare korteks floresan boyaların tekrarlayan teslimat için reopenable kraniyal pencere. Bu kafa penceresi yeniden açılmasının olumsuz beyin dokusu şeffaflığı etkileyebilecek olasıdır. Ayrıca, bu bağ doku büyümesini etkileyebilir açılmasının neden olduğu iltihaplanma, zaman sürecini tahmin etmek zordur.
Inceltilmiş kafatası hazırlanması en büyük avantajlarından biri, terapötik bileşiklerin (ve beyin dokusu içine lokal enjeksiyon gerektiren diğer malzemeleri) (yeniden açılması kafatası pencere olmadan örneğin) eserler komplike olmadan, travma ilerlemesi sırasında birden çok kez teslim olasılığıdır.
Doğrudan yaralanma siteye tekrarlayan bileşik teslimat isteniyorsa, bir kafatası, kuru-out ve bakteriyel enfeksiyonu önlemek için özel araçlar düşünmelisiniz. Bu nedenle, steril koşullar (örneğin enrofloxacin gibi) antibiyotik uygulaması altında çalışan baş bölgede tutmak tavsiye edilir. T korumak içinkurutmadan kafatası bölgeyi hinned,% 1.5 agaroz ile metal tutucu doldurmak ve yuvarlak cam lamel ile örtün. Çoğu durumda bu 10 güne kadar olan süre boyunca, aynı asetat veya inceltilmiş kafatası muhafaza sağlayacaktır. Inceltilmiş kafatası hazırlanmasında birden fazla görüntüleme oturumları, uzun bir süre boyunca planlanmaktadır Bazı ek alınmalıdır. Hemen her bir görüntüleme oturumundan önce, yavaşça bir mikrocerrahi bıçak kullanarak inceltilmiş bölgeden yeni kurulan bağ dokusu kaldırmak. Görüntü kalitesi ve ölçü kemik kalınlığı doğrulamak için SHG TPEM görüntüleme kullanın. Doku büyütme eşiğe bir artış eşlik bulanıklık penetrasyon derinliğini ve neden görüntüyü bozabilir. Yüksek görüntü kalitesi yeniden kazanmak için bir mikrocerrahi bıçak ile hafifçe inceltilerek kafatası yenileyin.
Yaralanma siteye doğrudan erişim gerektirmeyen durumlarda, biz çok bir cam coversli ile kafatası inceltilmiş bölgesini kapsayan tavsiyecilalı ve güçlendirilmiş üzerindeki yazıda anlatılan gibi p Kleinfeld ve arkadaşları 15 tarafından kafatası hazırlık inceltilmiş. Bu, aşağıdaki prosedür kullanılarak isteğe göre yapılabilir. , Inceltilmiş kafatası bölgeye agaroz küçük bir damla (% 1.5) yerleştirin, bir jel olana kadar bekleyin, tüm gereksiz agaroz kaldırmak, yani sadece yaralanma sitede bırakın. Agaroz dış etkilerden yaralanma siteyi korumak gerekir. Sıkıştırılmış havayı kullanarak inceltilmiş kafatası bölgeyi kurutun. # 0 coverglass küçük bir parça poliakrilik tutkal küçük bir miktar düşüş ve inceltilmiş kafatası bölgeye yerleştirin. Poliakrilik tutkal, böylece korunmuş pencerenin altında inceltilmiş kafatası tutarak, kemik ve bağ dokusu büyütme önler.
Bu işlemlerin bir kombinasyonu, akut ve kronik travma sonrası süreçler üzerinde çalışılması topik ya da sistemik ilaç verilmesi ile ve direkt olarak tedavi etkileri izleme sağlar. İkili ya da üçlü transgenik fare hatları kullanımı da yararlı, parti olabilir,Böyle glial skar oluşumu ve nöronal şube yeniden büyümesi gibi çoklu travma sonrası süreçler, eş zamanlı görüntüleme için cularly. Biz akut beyin hasarı bizim modellerimiz uyuşturucu aday testi için verimli kanıtlamak için Intravital iki-foton mikroskopi ile çalıştı bekliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz GAFP-EGFP ve CX3CR1-EGFP fare suşları sağlamak için Dr Frank Kirchhoff derinden müteşekkiriz. Iş Finlandiya Uluslararası Hareketlilik Merkezi, Tekes, Neuroscience Fin Enstitüsü (FGSN) ve Finlandiya Akademisi hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L.
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
