Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

بطء الإفراج تسليم المخدرات من خلال Elvax 40W إلى الجرذ الشبكية: الآثار المترتبة على علاج الحالات المزمنة

Published: September 17, 2014 doi: 10.3791/51563
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1, 1,2, 2,3,4
1Biotechnology and Applied Clinical Sciences Department, University of L'Aquila, 2ARC Centre of Excellence in Vision Science, 3John Curtin School of Medical Research, Australian National University, 4ANU Medical School, Australian National University
* These authors contributed equally

Summary

تفاصيل هذه الورقة كيف Elvax 40W يمكن استخدامها كوسيلة من وسائل بطء الإفراج عن تسليم المخدرات إلى شبكية العين الفئران البالغين. يوصف بروتوكول لإعداد والتحميل، وتقديم مجمع المخدرات الراتنج للعين.

Abstract

أمراض شبكية العين هي صعبة لعلاج شبكية العين كما تكمن عميقا داخل العين. وغالبا ما يحتاج أساليب الغازية من تسليم المخدرات لعلاج هذه الأمراض. أمراض شبكية العين المزمنة مثل وذمة الشبكية أو اتساع الأوعية الدموية عادة ما تتطلب الحقن داخل العين متعددة لعلاج الحالة بشكل فعال. ومع ذلك، فإن المخاطر المرتبطة بهذه الحقن تزيد مع تسليم المتكررة من المخدرات. ولذلك، أساليب التوزيع البديلة يجب وضع من أجل تقليل مخاطر إعادة حقن. وقد وضعت عدة تحقيقات غيرها من وسائل لتوصيل الأدوية الموسعة مع مرور الوقت، من خلال مواد قادرة على إطلاق المواد الكيميائية ببطء في العين. في هذا التحقيق، ونحن الخطوط العريضة استخدام Elvax 40W، الراتنج كوبوليمر، ليكون بمثابة وسيلة لتوصيل الدواء إلى شبكية العين الفئران البالغين. يتم إجراء الراتنج وتحميلها مع المخدرات. ثم يتم زرع مجمع المخدرات الراتنج في تجويف الجسم الزجاجي، حيث انها ستفرج ببطء الدواء على منظمة الشفافية الدوليةلي. تم اختبار هذه الطريقة باستخدام 2-الأمينية-4-phosphonobutyrate (APB)، والتماثلية الغلوتامات الذي يمنع استجابة ضوء من شبكية العين. وقد تبين أن APB صدر ببطء من الراتنج، وكان قادرا على منع استجابة الشبكية بنسبة 7 أيام بعد غرس. هذا يدل على أن تسليم المخدرات بطء الإفراج استخدام هذا الراتنج كوبوليمر فعالة لعلاج شبكية العين، ويمكن استخدامها علاجيا مع إجراء مزيد من التجارب.

Introduction

علاج الأمراض المزمنة مثل السكري وارتفاع ضغط الدم ويعرض العديد من التحديات، وهذه الأمراض عموما تتطلب العلاج لفترات طويلة من الوقت، وغالبا ما للحياة. وقد دعا هذا لتطوير نظم لتقديم الأدوية الافراج بطيئة، والتي تقلل من الحاجة لجرعات متكررة. وقد أثبتت فعالية هذه الأساليب الافراج بطيئة من خلال تطوير مضخات الأنسولين، للحد من عدد من حقن الانسولين اللازمة لعلاج مرض السكري. الأمراض المزمنة للعين، وخاصة تلك التي تؤثر على طبقات الداخلية، يتطلب بالإدارة متكررة من المخدرات من خلال إجراءات الغازية. أحد هذه الأمراض المزمنة التي تؤثر على العين البشرية هو العمر المتعلقة التنكس البقعي (AMD). أنه يؤثر على الشبكية المركزية، وهي طبقة من الأنسجة العصبية تقع في الجزء الخلفي من العين المسؤولة عن الشروع في الرؤية. AMD هي السبب الرئيسي للعمى في العالم الغربي 1. وهناك تحد خاص مع علاج إعادةالأمراض tinal هي أن يطلب من المخدرات للوصول إلى هذه الطبقة العميقة في العين، والتي غالبا ما يتطلب أساليب الغازية التسليم. عادة تدار المخدرات إلى غرفة الزجاجي والشبكية باستخدام حقن intravitreal. ومع ذلك، مع كل حقنة هناك خطر حدوث مضاعفات تال للحقن، بما في ذلك التهاب باطن المقلة، انفصال الشبكية، المياه البيضاء ونزيف الجسم الزجاجي 2. يتم ضرب هذا الخطر مع كل إعادة حقن من الدواء.

ان الحد من الحاجة إلى حقن متعددة تكون ذات فائدة كبيرة في علاج AMD. لعلاج الشكل الرطب من AMD، حيث نمو الأوعية الجديدة هو السمة المميزة، واستراتيجية العلاجية أنشئت في استهداف عوامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) باستخدام مثبطات VEGF 3. في الوقت الحاضر، يتم تسليم هذه الحقن من خلال intravitreal المتكررة. وبالمثل، في علاج وذمة البقعة الصفراء، اختلاط شائع من اعتلال الشبكية السكري، ويتم تسليم القشرية من خلال تكرار الحقن

وقد وصفت مفهوم نظام تسليم المخدرات الافراج بطيئة أولا باستخدام سيارة مطاط السيليكون لتقديم جزيئات صغيرة في الأنسجة الحيوانية 5. منذ ذلك الحين، تم تطوير أساليب الافراج بطيئة أخرى لتقديم جزيئات أكبر، والعديد منها قد تم اختبارها في العين. ناقلات الجسيمات، مثل المجهرية القابلة للتحلل، بولي lactide-شارك في glycolide (PLGA) النانوية والحويصلات فوسفورية (الجسيمات الشحمية) يمكن أن تكون مفيدة كوسائل تسليم 6،7. وقد تم مقارنة PLGA النانوية والجسيمات الشحمية في بيئة المختبر لقدرتها على تقديم وكلاء المضادة للسرطان عبر الصلبة مع مرور الوقت 7. وكانت كل من المركبات الفعالة في الافراج ببطء المخدرات. ومع ذلك، أجريت الدراسة إلا في بيئة المختبر. Bochot وآخرون (2002) 8 اختبارفعالية الليبوزومات لتسليم الجزيئات لشبكية العين في الجسم الحي. وقد أثبت أنه الليبوزومات تقديم بنجاح أليغنوكليوتيد] صغيرة لشبكية العين أرنب. ويرى المؤلفون أن الجسيمات الشحمية يمكن أن تكون مفيدة في علاج أمراض الشبكية 8. ومع ذلك، فإن طبيعة هذه الحويصلات في التحرك في الجسم الزجاجي يعني أنها من المرجح أن يضعف الرؤية أو طمس 9.

اوكابي وآخرون (2003) 10 تستخدم أقراص غير القابلة للتحلل البوليمر يتكون من 33٪ الاثيلين فينيل اسيتات لتطبيق بيتا methasone في الأرانب. انهم مزروع في الجيب أقراص الصلبة وأظهرت الإفراج الفعلي للدواء في الجسم الزجاجي والشبكية لشهر واحد 10. ومع ذلك، في هذا البروتوكول معين، كان الزرع كبير نسبيا وجامدة، ويتطلب عملية جراحية أكثر تعقيدا بما في ذلك شق الصلبة كبيرة وخياطة.

حققت دراسة سابقة للTISSUاستجابة البريد للمركبات البوليمر المختلفة عن طريق زرعها في القرنية من عيون الأرانب، ووجدت أن بوليمرات الاثيلين خلات الفينيل غسلها في الكحول لا تسبب التهاب أو تهيج. عرضت هذه المجمعات للحفاظ على تسليم المركبات الكبيرة إلى الأنسجة الحيوانية لفترات طويلة من الوقت، وبعض تتجاوز ما يصل إلى 100 ​​أيام تعتمد على المخدرات 11. وقد وضعت واحدة هذا النوع من الراتنج كوبوليمر صناعيا في شكل Elvax 40W (40٪ من الوزن الإيثيلين فينيل أسيتات المحتوى comonomer مع 'W' أميد المضافة لتحسين معالجة بيليه). هذا الراتنج كوبوليمر هو مادة خاملة الذي هو مستقر في كل من الغرفة ودرجة حرارة الجسم. لم يظهر أن يسبب الحساسية أو السمية في الأنسجة البيولوجية. وقد القى هذا الراتنج فعال مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأدوية في النماذج التجريبية المختلفة التي تحقق وظائف نظم مختلفة، مثل نظام الأقنية الثديية 12، القشرة السمعية الأولية 13،14 </ سوب>، والضفدع النظام البصري 15. كما تم استخدام هذا الراتنج في العين لتوصيل الأدوية لتطوير سلحفاة 16،17، 18،19 الدجاج الجنين، والنمس الكبار شبكية العين 20. في الجهاز العصبي المركزي الفئران، تم فقط استخدام الراتنج في الدماغ 21-23، ولكن لم يتم توثيقها استخدامه في العين الفئران.

مزايا استخدام هذا الراتنج كوبوليمر لتوصيل الأدوية ببطء إلى الشبكية عبر طرق أخرى، هو أنه مركب مستقر لا يسبب التهاب أو تهيج في العين. خلافا لناقلات الجسيمات، فإن المجمع المخدرات الراتنج لا يضعف الرؤية بعد الزرع، لأنه لا يزال عادة في موقع التسليم بدلا من العائمة في الجسم الزجاجي. فإنه لا تتطلب سوى عملية زرع بسيطة في تجويف الجسم الزجاجي بالقرب من حوف العين، ولن تتطلب خياطة بعد الزرع. مؤخرا، كان هناك ظهور في عدة أنظمة تسليم جديدة، مثلتكنولوجيا خلايا مغلفة (ECT) 24،25، 26 الهلاميات المائية، والميكروفيلم 27. ومع ذلك، فإن الطريقة المستخدمة في الدراسة الحالية لإعداد وتسليم مجمع المخدرات الراتنج على حد سواء سهلة لمتابعة وغير مكلفة، وبالتالي يكون أكثر فائدة للاستخدام في بيئة البحوث الأساسية. التحدي المتمثل في استخدام هذا المجمع لتقديم العلاج بالعقاقير طويل المدى هو تحديد تركيز الأمثل للدواء من شأنها تحقيق أقصى قدر من الفوائد العلاجية من وجود عدد أقل من الحقن intravitreal.

تهدف هذه الورقة إلى شرح استخدام المجمع المخدرات الراتنج لعلاج طويل الأجل للشبكية الفئران الكبار. يتم اختبار فعالية هذا النمط من تسليم باستخدام الغلوتامات التناظرية 2-الأمينية-4-phosphonobutyrate (APB) مثل المخدرات. كتل APB الاستجابة الخفيفة للخلايا القطبين على طريق محاكاة الغلوتامات، وهو ناقل عصبي الذاتية في شبكية العين 28. عندما تتنافس APB مع مستقبلات الغلوتامات ل، فإنه يمنع من lighر الاستجابة. وقد استخدم الأساليب المحاسبية في الدراسات الفسيولوجية للسيطرة على وظيفة الشبكية وقياس أثره باستخدام أساليب الكهربية مثل تخطيط كهربية الشبكية (أرج). في الدراسات السابقة، وقد استخدمت الأساليب المحاسبية لكلا قصيرة الأجل 29 و علاج طويل الأجل من شبكية العين النامية؛ يشارك هذا الأخير إعطاء جرعة واحدة يوميا عن طريق الحقن داخل العين لمدة 30 يوما 30. تم استخدام نفس الكمية من APB (0.092 ملغ في المياه المالحة عقيمة، بتركيز 50 ميكرومتر) لجميع الحقن كما هو مقترح في 28،29،31 الأعمال السابقة. اخترنا APB لاختبار المجمع المخدرات الراتنج وسيلة بطيئة الافراج لتسليم المخدرات إلى العين. الطرق الموضحة في هذه الدراسة مشابهة لأساليب الموصوفة سابقا تتضمن إعداد الدواء الراتنج معقدة 16،32. ولكن نحن أيضا التفاصيل استخدامه تحديدا في العين الفئران البالغين. بعد الزرع الجراحية من الراتنج APB تحميلها في العين، أجريت أرج لتحديد ما إذا APB يلغي صاستجابة ضوء etinal، وبالتالي ما إذا كان قد تم الافراج عن APB بنجاح في الجسم الزجاجي والشبكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكانت جميع التجارب التي أجريت وفقا للبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية، وبموافقة من جامعة لاكويلا جنة الأخلاقيات الحيوانية ولجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات الجامعة الوطنية الاسترالية. واستخدمت الجرذان الكبار (P100-200) طوال هذه الدراسة.

1. إعداد الكريات كوبوليمر الراتنج

  1. وضع 20 الكريات Elvax 40W في كوب زجاجي صغير في خزانة الدخان.
  2. ملء كوب مع الإيثانول بنسبة 100٪ ضمان لتغطية جميع الكريات.
  3. تغطية الكأس مع parafilm، ونقع الكريات في الإيثانول بنسبة 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 7-10 أيام. ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، لا تستخدم المعدن أو البلاستيك لمعالجة أو تخزين الراتنج.

2. إعداد محلول الدواء للتحميل

  1. حل العقار المفضل في 0.1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). جعل محلول الدواء تصل إلى 40 ميكرولتر في الحجم.تحميل الراتنج مع ثلاثة أضعاف تركيز الدواء التي من شأنها أن تعطى في جرعة واحدة.

3. إعداد وتحميل مجمع المخدرات الراتنج

  1. نقل 20 الكريات غسلها إلى دورق زجاجي صغير آخر. حل الكريات في 4 مل ثنائي كلورو ميثان لحوالي 45 دقيقة. تغطية الكأس مع parafilm بينما الكريات تم إلغاؤها.
  2. يعد حل سريع الخضراء FCF عن طريق إذابة في 0.1٪ DMSO إلى تركيز 0.001 ملغ / مل.
  3. اتخاذ ماصة واحدة، ووضع 40 ميكرولتر من محلول الدواء أعدت في وقت سابق. تحميل ماصة أخرى مع 40 ميكرولتر من الحل الأخضر سريع.
  4. إضافة حلول اثنين في وقت واحد في الكأس. مزيج بسرعة باستخدام كوب اثارة قضيب حتى يتم توزيع الصبغة الخضراء بشكل موحد في جميع أنحاء الخليط.
  5. على الفور نقل الكأس على الجليد الجاف لمدة 10 دقيقة على الصيام تجميد الراتنج.
  6. انشاء "غرفة التبخر" لتتبخر المذيبات. ملءتصل الحاوية أكبر لثلث مع الحصى كبريتات الكالسيوم. إنشاء جيدا في الحصى، ووضع بعناية الكأس في البئر بحيث الحصى تصل إلى نصف الكأس، لتحقيق الاستقرار في الدورق في الغرفة.
  7. تغطية الحاويات خارج أكبر مع parafilm.
  8. نقل غرفة التبخر إلى الثلاجة. تبقي في -20 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع.

4. إعداد مجمع المخدرات الراتنج لزرع جراحة

  1. إزالة غرفة التبخر من الفريزر. نقل كتلة صلبة المخدرات الراتنج إلى صحن الزجاج أبقى على الجليد.
  2. مع المعونة من مجهر أو مكبرة، وقطع قطعة حوالي 0.05 ملم وقطرها 0.1 ملم في الطول من كتلة باستخدام أداة منقب أو لكمة.
  3. التفاف تبقى من كتلة في مواد واقية من تجميد (مثل رقائق الألومنيوم) والاحتفاظ في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.

5. جراحيا مجمع زراعة المخدرات الراتنج في الجرذ العين

  • إعداد الحيوان للجراحة. تخدير باستخدام حقن داخل الصفاق من خليط من الكيتامين (100 ملغ / كغ من وزن الجسم) وزيلازين (12 ملغم / كغم من وزن الجسم). مراقبة الحيوانات حتى يتحقق التخدير الكامل. ملاحظة: يجب أن يكون للحيوان فقدان الحركات (باستثناء التنفس)، وفقدان ردود الفعل قرصة القرنية وأخمص قدميه.
  • نقل الحيوانات تخدير كامل إلى طاولة الجراحة. استخدام mydriaticum (مثل الأتروبين سلفات)، ومخدر موضعي (على سبيل المثال، تتراكائين هيدروكلوريد) يسقط على العين (ق) خضوعه لعملية جراحية. تطبيق الدموع الاصطناعية للحفاظ على القرنية رطبة أثناء الجراحة. استخدام الإبر والأدوات المعقمة المتاح طوال الجراحة.
  • استقرار العين باستخدام زوج من ملقط منحنية حادة بعد المتوسعة التلميذ بالكامل. استخدام المجهر التشغيل لجعل كامل عمق ثقب الجرح للوصول إلى زجاجي، حوالي 2 مم من حوف باستخدام إبرة 25 G.
  • إدراج قطعة من استعداد رانه مجمع المخدرات الراتنج في ثقب الجرح باستخدام زوج من غرامة، ملقط مدبب (على سبيل المثال، ملاقط) القادرة على اختراق الموقع ثقب.
  • كوقاية لعدوى بكتيرية، وتطبيق مرهم مضاد حيوي للعين، لمنع الالتهاب، وكذلك منع جفاف القرنية في حين أن الحيوان يتعافى.
  • مراقبة الحيوان حتى الشفاء التام. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه عليه. لا عودة الحيوان إلى الشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. إذا يظهر الحيوان علامات الإجهاد أو عدم الراحة، والمسكنات وينبغي أن تستخدم وفقا لبروتوكول الأخلاق المعتمدة.
  • اتبع الإجراءات المعتادة تجريبية لجمع وتحليل الأنسجة.
  • عند الانتهاء من التجارب، الموت ببطء الحيوان مع حقنة داخل الصفاق من بنتوباربيتال (60 ملغم / كغم من وزن الجسم) 2٪ ليدوكائين هيدروكلوريد حل.

    • ملاحظة: يجنوكائين هيدروكلوريد دقيقةimizes الانزعاج المحلي.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    تم استخدام تخطيط كهربية الشبكية الميدان الكامل (أرج) للكشف عن تأثير APB على شبكية العين. للحصول على تفاصيل حول كيفية تم إجراء أرج، الرجوع إلى الدراسات التالية 33،34. باختصار، بعد التخدير الحيوان، وضعت قطب الذهب على قرنية العين، ووضعت الإلكترود المرجعي في فروة الرأس الأمامية بين العينين، لتسجيل النشاط الكهربائي للشبكية. تم إنشاء المحفزات باستخدام وحدة فلاش الإلكترونية وتراوحت الكثافة بين 10-10 يونيو الايزوميرة الضوئية، والتي يمثل عدد الجزيئات حساس تفعيلها في قضيب. في هذه التجارب، اتخذت تسجيلات أرج في 1 و 7 أيام إجراء آخر. تم زرع العين اليمنى كل حيوان مع مجمع المخدرات الراتنج، في حين غادر زميل كان يستخدم كعنصر تحكم العين الداخلية غير المعالجة.

    ويبين الشكل 1 التغيرات في اتساع الموجة ب مع زيادة في الايزوميرة الضوئية في قضيب(φ). في العين السيطرة، واتساع الموجة ب يزيد مع زيادة كثافة فلاش. في الشكل 1A، يتم إعطاء التسجيلات استجابة شبكية العين 1 يوم بعد الزرع. وأظهرت العين مزروع نمط مماثل لاتساع العين السيطرة. أصبح الفرق السعة بين عينيه اختلافا كبيرا في 10 6 φ (P <0.0001). هذا يدل على أن في هذه المرحلة المبكرة، لم يكن للمجمع المخدرات الراتنج تأثير على استجابة الشبكية حتى تصل أعلى كثافة فلاش الشكل 1B يوضح التغيرات في الاستجابة أرج في 7 أيام بعد الزرع. وألغت ب الموجة على جميع مستويات كثافة فلاش في العين مزروع، بالمقارنة مع العين السيطرة، التي لديها سعة تضاهي التسجيلات 1 يوم. وهذا يختلف إلى حد كبير عن سعة للعين مزروع في 1 يوم (P <0.0001). هذا يدل على أن استجابة شبكية العين قد ألغيت من قبل (أسبوع واحد) بعد implantatiعلى المجمع المخدرات الراتنج في العين.

    الشكل 1
    الشكل 1. اتساع الموجة ب في 1 يوم 1 أسبوع بعد وغرس مجمع المخدرات الراتنج. لكلا الفريقين، ويظهر العين السيطرة في البرتقال (المربعات)، في حين يظهر العين مزروع في الأخضر ( الدوائر). * رمز يمثل أهمية عند هذه النقطة بين عينيه، حيث p <0.0001. لجميع الفئات، ن = 5. (A) السعة اليوم ب الموجة 1 بعد غرس مجمع المخدرات الراتنج في العين. اتساع الموجة ب فيما يتعلق كثافة فلاش (الايزوميرة الضوئية في قضيب φ) مؤشرا على استجابة الشبكية. لا يوجد فرق كبير في السعة ب الموجة بين عينيه في كل شدة فلاش إلا في 10 6 φ، حيث العين مزروعلديه سعة أقل. (B) واتساع الأسبوع ب الموجة 1 (7 أيام) بعد الزرع. السعات المسجلة من كلتا العينين تختلف اختلافا كبيرا في كل شدة فلاش. زرع في الشبكية، وكان اتساع موجة B-لا يمكن قياسها في أي شدة التحفيز.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    وأظهرت هذه الدراسة استخدام مجمع المخدرات الراتنج لبطء التسليم النشر من المخدرات إلى شبكية العين. نحن تهدف إلى تقديم الطريقة التي هي غير مكلفة نسبيا وسهلة التطبيق في نموذج حيوان صغير.

    وبالنظر إلى أن وظيفة APB هي بمثابة التناظرية الغلوتامات، فإنه سيتم منع استجابة الشبكية في العين. بينت النتائج أن APB تسبب في انسداد استجابة الشبكية بواسطة postimplantation أسبوع واحد. هذا يشير إلى أن APB صدر بنجاح في الجسم الزجاجي وشبكية العين، والتي تأثيره كان محدودا للعين أن المجمع المخدرات الراتنج كان مزروع في. أصبح التأثير الكامل للدواء واضح أسبوع واحد بعد زرع (الشكل 1B). يبين الشكل 1A أنه في 1 يوم بعد الزرع، كان انخفاض كبير للب الموجة موجودة فقط في كثافة 10 6 φ في العين مزروع. قد يشير هذا إلى أنه عند هذه النقطة وقت مبكر، إلا أنمخروط الطريق، الذي يستجيب   لشدة الضوء أعلى، تأثر. لتحديد طول الفترة الزمنية التي الراتنج يمكن تسليم APB لشبكية العين، وينبغي التحقيق في مزيد من النقاط الزمنية. يقترح أن التسجيلات في مزيد من النقاط الزمنية ضمن فترة 0-7 يوم يجب أن تؤخذ على سبيل المثال، في 3 و 5 أيام بعد غرس، لتحديد بالضبط عندما ألغت استجابة الشبكية تماما. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تؤخذ التسجيلات بعد 7 أيام، لتحديد متى يتم تحرير APB ل. وهذا سيكون واضحا واستجابة الشبكية ستواصل إلغاؤها إذا تم الإفراج عنهم باستمرار APB ببطء في الجسم الزجاجي.

    في هذه الدراسة، تم العثور على مجمع المخدرات الراتنج لتكون آمنة لتسليمها إلى شبكية العين. تم حله في APB 0.1٪ DMSO. في تركيزات تساوي أو أعلى من 0.6٪، ويمكن DMSO تسبب سمية الشبكية. ومع ذلك، 0.1٪ وقد وجد DMSO أن يكون وسيلة آمنة لإيصال مركبات للتم استخدام الفئران العين 35، وهذا التركيز في جميع التجارب في هذه الدراسة. أدرجت يزرع transclerally في تجويف الجسم الزجاجي في أورا مشرشر. وقد لوحظت يزرع على البقاء في مشرشر أورا في cryosections من العين الفئران، والتي تم جمعها بعد إجراء التسجيلات أرج. هذه المواقع من زرع يضمن أن المجمع المخدرات الراتنج لا يسبب ضعف الرؤية. هذه الطريقة تنطوي على مجمع المخدرات راتنج وقد تم اختبار مع المركبات الأخرى (منشورات قيد الإعداد)، وتبين أن لا ضرر هيكلي أو وظيفي للعين وحظ تصل إلى شهرين بعد الزرع. تم زرع ما مجموعه 60 الحيوانات، وفي 90٪ من الحالات ظلت دون تغيير موقف الزرع.

    ويمكن إجراء عدة تعديلات على التقنية إذا لزم الأمر. في هذه التجارب، تم تحميل ثلاث مرات تركيز جرعة واحدة من الأساليب المحاسبية في الراتنج (50 ميكرومتر × 3 = 150 ميكرومتر)، وهذا SHOيونيتبول أن تستخدم كدليل لإعداد محلول الدواء للتحميل. ومع ذلك، فإن التركيز الفعال للدواء في الراتنج هو متغير، وينبغي اختبارها وتعديلها وفقا لذلك. النقاط الوقت حيث يتم إجراء تحليل يمكن أيضا تعديل، لتحديد متى الراتنج فعال في الإفراج عن المخدرات. في هذه التجارب، تبين أن يتم تسليم جرعة فعالة مستقرة من المخدرات من خلال مجمع المخدرات الراتنج لمدة أسبوع واحد على الأقل، لذلك فمن المستحسن أن تحليل الأنسجة يتم تنفيذ بعد أسبوع واحد على الأقل زرع. خلال الخطوة تحميل المخدرات، استخدمت الأخضر سريع للتأكد من أن الخليط قد يتجانس الخليط. غيرها من الأصباغ اللون آمنة بيولوجيا يمكن استخدامها كبديل للالأخضر السريع، لتصور التوحيد من المخدرات داخل الراتنج. وجود قيود على هذا الأسلوب هو أن الصبغة الخضراء السريع هو المقياس الوحيد للخلط موحد. ويمكن أيضا أن يتم اختبار هذه التقنية باستخدام نماذج حيوانية بديلة والمخدرات، مع إعلان بسيط فقطتسويات لهذه الطريقة. إذا كمية أعلى من الدواء يحتاج ليتم تسليمها، قد يكون من الضروري على أكبر حجم الزرع. إذا نجحت في هذه النماذج، يمكن اعتبار هذا الراتنج كوبوليمر كخيار علاجي لإيصال المخدرات ببطء لشبكية العين أن يكون لها تأثير مستمر على مر الزمن.

    هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول حيث ينبغي اتخاذ مزيد من الحذر. لا ينبغي أن تستخدم الأدوات البلاستيكية والمعدنية في جميع أنحاء التوليف والتعامل مع الراتنج. هذا يمنع تلوث البوليمر، كما يمكن حل ثنائي كلورو ميثان البلاستيك وتآكل المعادن. يجب أن يتحقق جفاف السليم للكتلة المخدرات الراتنج قبل استخدامه لزرع جراحية. ضمان الكأس التي تحتوي على المخدرات والراتنج يتعرض تماما لكبريتات الكالسيوم من أجل تتبخر المذيبات. بدلا من ذلك، مجفاد يمكن استخدامها لتجميد تجفيف الراتنج المخدرات. كتلة المخدرات الراتنج جاهز للاستخدام عند المذيب تبخرت تماما، ويبقى فقط كتلة مزرق الصلبة في الدورق. عندما قطع قطعة من كتلة لزرع، ولا ينبغي إعداد كل قطعة على الفور قبل الجراحة مثل قطع صغيرة جدا وصعبة لتخزين. ينبغي استخدام منقب أو لكمة أداة لقطع قطع متساوية في الحجم، وضمان أن كل قطعة تحتوي على ما يقرب من نفس الكمية من المخدرات. أخيرا، عند إدخال قطعة في ثقب الجرح الذي أحرزته G إبرة 25، استخدم غرامة، ملاقط مدبب لتوجيه بعناية قطعة في الجرح. مجهر التشغيل أو ارتفاع العدسة القوة يجب أن تستخدم المساعدات البصرية.

    فقط وقد تم اختبار المخدرات المائية والمركبات باستخدام هذا الأسلوب. لم تظهر المجمعات المخدرات راتنج أي هطول أو تشكيل ثانوية غير مرغوب فيه، عندما تم خلط المخدرات مع البوليمر وثنائي كلورو ميثان. يقترح أن مع كل دواء جديد، والتركيز، وعمر النصف من التأثير، وأي ردود فعل محتملة مع خليط الراتنج ينبغيفحصها من قبل المستخدم لتحديد ما إذا كان الأسلوب هو مناسبة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب ليس لديهم ما الإفصاح.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Elvax 40W Pellets Du Pont, DE, USA
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
    2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB) Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA A1910
    Dichloromethane Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA 34856
    Fast Green FCF Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
    Drierite, calcium sulfate Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA 238910
    Ketamine, Ilium Ketamil Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Xylazine, Ilium Xylazil-20 Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Atropine sulphate, Minims eye drops Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
    Tetracaine hydrochloride, Minims eye drops Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
    Chloramphenicol, Chlorsig ointment Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia
    Pentobarbital, Lethabarb Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia
    Lidocaine hydrochloride, Ilium Lignocaine-20 Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
    Uni-Core Punch Tool World Precision Instruments Inc., FL, USA
    Curved Forceps World Precision Instruments Inc., FL, USA
    Operating Microscope, Zeiss OPMI 99 Zeiss, West Germany
    25 G Insulin needle Terumo Corp., Tokyo, Japan
    Dumont tweezers World Precision Instruments Inc., FL, USA

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Access Economics, The global economic cost of visual impairment. AMD Alliance International. , 26-27 (2010).
    2. Jager, R., Aiello, L., Patel, S., Cunningham, E. Risks of intravitreous injection: A comprehensive review. Retina. 24 (5), 676-698 (2004).
    3. Rosenfeld, P. J., et al. Ranibizumab for neovascular age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 355 (14), 1419-1431 (2006).
    4. Cunningham, M. A., Edelman, J. L., Kaushal, S. Intravitreal steroids for macular edema: The past, the present, and the future. Survey of Ophthalmology. 53 (2), 139-149 (2008).
    5. Folkman, J., Long, D. M. The use of silicone rubber as a carrier for prolonged drug therapy. Journal of Surgical Research. 4 (3), 139-142 (1964).
    6. Herrero-Vanrell, R., Refojo, M. F. Biodegradable microspheres for vitreoretinal drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 52 (1), 5-16 (2001).
    7. Kim, E., et al. Human scleral diffusion of anticancer drugs from solution and nanoparticle formulation. Pharmaceutical Research. 26 (5), 1155-1161 (2009).
    8. Bochot, A., et al. Intravitreal delivery of oligonucleotides by sterically stabilized liposomes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (1), 253-259 (2002).
    9. Bochot, A., Fattal, E. Liposomes for intravitreal drug delivery: A state of the art. Journal of Controlled Release. 161 (2), 628-634 (2012).
    10. Okabe, K., Kimura, H., Okabe, J., Kato, A., Kunou, N., Ogura, Y. Intraocular tissue distribution of betamethasone after intrascleral administration using a non-biodegradable sustained drug delivery device. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2702-2707 (2003).
    11. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
    12. Silberstein, G. B., Daniel, C. W. Elvax 40P implants: Sustained, local release of bioactive molecules influencing mammary ductal development. Developmental Biology. 93 (1), 272-278 (1982).
    13. Smith, A. L., et al. An investigation of the role of auditory cortex in sound localization using muscimol-releasing Elvax. European Journal of Neuroscience. 19 (11), 3059-3072 (2004).
    14. Anomal, R., De Villers-Sidani, E., Merzenich, M. M., Panizzutti, R. Manipulation of BDNF signaling modifies the experience-dependent plasticity induced by pure tone exposure during the critical period in the primary auditory cortex. PloS one. 8 (5), e64208 (2013).
    15. Tu, S., Butt, C. M., Pauly, J. R., Debski, E. A. Activity-dependent regulation of substance P expression and topographic map maintenance by a cholinergic pathway. The Journal of Neuroscience. 20 (14), 5346-5357 (2000).
    16. Sernagor, E., Grzywacz, N. M. Influence of spontaneous activity and visual experience on developing retinal receptive fields. Current Biology. 6 (11), 1503-1508 (1996).
    17. Leitch, E., Coaker, J., Young, C., Mehta, V., Sernagor, E. GABA type-A activity controls its own developmental polarity switch in the maturing retina. The Journal of Neuroscience. 25 (19), 4801-4805 (2005).
    18. Park, C. M., Hollenberg, M. J. Basic fibroblast growth factor induces retinal regeneration in vivo. Developmental Biology. 134 (1), 201-205 (1989).
    19. Whitsel, A. I., Johnson, C. B., Forehand, C. J. An in ovo chicken model to study the systemic and localized teratogenic effects of valproic acid. Teratology. 66 (4), 153-163 (2002).
    20. Prusky, G. T., Ramoa, A. S. Novel method of chronically blocking retinal activity. Journal of Neuroscience Methods. 87 (1), 105-110 (1999).
    21. Colonnese, M. T., Constantine-Paton, M. Chronic NMDA receptor blockade from birth increases the sprouting capacity of ipsilateral retinocollicular axons without disrupting their early segregation. The Journal of Neuroscience. 21 (5), 1557-1568 (2001).
    22. Oliveira-Silva, P., et al. Matrix metalloproteinase-9 is involved in the development and plasticity of retinotectal projections in rats. Neuroimmunomodulation. 14 (3-4), 144-149 (2007).
    23. Trindade, P., et al. Evidence for a role of calcineurin in the development of retinocollicular fine topography. Neuroscience Letters. 487 (1), 47-52 (2011).
    24. Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).
    25. Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. Randomized of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).
    26. Rauck, B. M., et al. Biocompatible reverse thermal gel sustains the release of intravitreal bevacizumab in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (1), 469-476 (2014).
    27. Liu, Y. C., Peng, Y., Lwin, N. C., Venkatraman, S. S., Wong, T. T., Mehta, J. S. A biodegradable, sustained-released, prednisolone acetate microfilm drug delivery system effectively prolongs corneal allograft survival in the rat keratoplasty model. PloS one. 8 (8), e70419 (2013).
    28. Slaughter, M. M., Miller, R. F. 2-amino-4-phosphonobutyric acid: a new pharmacological tool for retina research. Science. 211 (4478), 182-185 (1981).
    29. Bodnarenko, S., Jeyarasasingam, G., Chalupa, L. Development and regulation of dendritic stratification in retinal ganglion cells by glutamate-mediated afferent activity. The Journal of Neuroscience. 15 (11), 7037-7045 (1995).
    30. Deplano, S., Gargini, C., Maccarone, R., Chalupa, L. M., Bisti, S. Long-term treatment of the developing retina with the metabotropic glutamate agonist APB induces long-term changes in the stratification of retinal ganglion cell dendrites. Dev Neurosci. 26 (5-6), 396-405 (2004).
    31. Horton, J., Sherk, H. Receptive field properties in the cat's lateral geniculate nucleus in the absence of on-center retinal input. The Journal of Neuroscience. 4 (2), 374-380 (1984).
    32. Smith, A. L., Cordery, P. M., Thompson, I. D. Manufacture and release characteristics of Elvax polymers containing glutamate receptor antagonists. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1), 211-217 (1995).
    33. Gargini, C., Bisti, S., Demontis, G. C., Valter, K., Stone, J., Cervetto, L. Electroretinogram changes associated with retinal upregulation of trophic factors: observations following optic nerve section. Neuroscience. 126 (3), 775-783 (2004).
    34. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (3), 1254-1261 (2008).
    35. Tsai, T., Bui, B., Vingrys, A. Dimethyl sulphoxide dose-response on rat retinal function. Documenta Ophthalmologica. 119 (3), 199-207 (2009).

    Tags

    الطب، العدد 91، تسليم المخدرات بطء الإفراج، Elvax 40W، الراتنج شارك في البوليمر والعين والشبكية، الفئران، APB، تنكس الشبكية، علاج الحالات المزمنة الشبكية
    بطء الإفراج تسليم المخدرات من خلال Elvax 40W إلى الجرذ الشبكية: الآثار المترتبة على علاج الحالات المزمنة
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Fiorani, L., Maccarone, R.,… More

    Fiorani, L., Maccarone, R., Fernando, N., Colecchi, L., Bisti, S., Valter, K. Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions. J. Vis. Exp. (91), e51563, doi:10.3791/51563 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter