通过40W的Elvax缓释给药的大鼠视网膜：对慢性疾病的治疗

Summary

本文详细介绍了如何的Elvax 40W，可作为药物输送到成年大鼠视网膜缓释方法。该协议的制备，装载和输送的药物 - 树脂复合物对眼睛进行说明。

Abstract

视网膜疾病是难以治疗的视网膜深藏在眼内。通常需要药物递送的侵入性的方法来治疗这些疾病。慢性视网膜疾病，如视网膜水肿或新血管形成通常需要多眼内注射，以有效治疗该病症。然而，与这些注射相关的风险增加具有重复输送药物。因此，替代交付方式需要建立以尽量减少回注的风险。几个其他研究已开发的方法来递送药物在延长的时间，通过能够释放的化学物质慢慢进入眼睛的材料。在本次调查中，我们概述了使用的Elvax 40W，共聚物树脂，以充当药物输送到成年大鼠视网膜的车辆。的树脂制成，并装入该药物。该药物 - 树脂复合物，然后注入到玻璃体腔，在那里它会慢慢地释放药物比TI我。使用2 - 氨基-4 - 膦酰（APB），谷氨酸类似物阻止视网膜的光响应这种方法进行了测试。由此表明了该APB慢慢从树脂释放，并且能够阻止在植入后7天的视网膜响应。这表明，使用缓释药物递送该共聚物树脂可有效治疗视网膜上，并且可以用于治疗与进一步的测试。

Introduction

慢性疾病如糖尿病和高血压的治疗中提出了许多挑战，因为这些疾病通常需要治疗延长的时期，常常为生活。这叫做缓慢释放的药物递送系统，其减少需要频繁给药的发展。这些缓慢释放方法的有效性已经通过胰岛素泵的发展已经证明，减少治疗糖尿病需要胰岛素注射的次数。眼睛的慢性疾病，尤其是影响其内层，需要通过药物侵入性操作频繁给药。一个这样的慢性疾病，影响人的眼睛是年龄相关性黄斑变性（AMD）。它影响到中央视网膜，这是一个层位于负责发起视力的眼睛后面的神经组织。 AMD是导致失明的西方^世界第一的主要原因。与治疗真是个特别的挑战tinal疾病是该药物是需要达到的眼睛，这经常需要递送的侵入性方法本深层。药物通常是给药于使用玻璃体内注射玻璃体腔和视网膜。然而，每次注射有一种postinjection并发症，包括眼内炎，视网膜脱离，白内障和玻璃体出血²的风险。这种风险被乘以与药物的每一个回注。

减少需要多次注射会在AMD的治疗的一个主要好处。治疗AMD，在新的血管生长是一个标志性的湿形式，既定的治疗策略是针对使用VEGF抑制剂³的血管内皮生长因子（VEGF）。目前，这是通过重复的玻璃体内注射递送。同样，在黄斑水肿，糖尿病性视网膜病变的常见并发症的治疗，皮质类固醇激素是通过反复注射交付

使用有机硅类橡胶车辆提供小分子进入动物组织⁵首次被描述缓慢释放的药物递送系统的概念。自那时以来，其他的缓慢释放的方法已被开发来提供更大的分子，其中一些在眼睛进行了测试。粒子的载体，如可生物降解的微球，聚交酯-共-乙交酯共聚物（PLGA）纳米颗粒和磷脂小泡（脂质体）可以作为运载工具^6,7有用。 PLGA纳米颗粒和脂质体进行了比较， 在体外环境中为它们随着时间的推移⁷穿过巩膜递送抗癌剂的能力。这两款车均有效缓慢释放的药物。然而，该研究只在体外环境下进行。 Bochot 等人 ^（2002）8测试脂质体的效能，提供分子在体内的视网膜。他们已经证明，脂质体成功递送小的寡核苷酸对兔视网膜。作者认为脂质体可能是有益的视网膜疾病⁸的治疗。然而，这些小泡的性质在玻璃体漂浮装置，它们很可能会变得模糊或损害视力^9。

冈部等人^（2003）10中使用由33％的乙烯-乙酸乙烯酯的非生物可降解的聚合物的光盘适用的β-塞米松兔。它们植入光盘插入巩膜袋和演示的有效释放药物进入玻璃体和视网膜的长达一个月^10。然而，在这种特定的协议中​​，植入物是相对大的和刚性的，并且需要更复杂的外科手术，包括一个大的巩膜切口和缝合。

早先的研究中调查了Tissu酒店ë响应于各种聚合物的车辆通过注入成兔眼的角膜，并发现，在醇洗涤的乙烯 - 乙酸乙烯酯共聚物并没有引起炎症或刺激。这些配合物显示出持续的递送较大的化合物的成动物组织为延长的时期，某些超过高达100天依赖于药物^11。一个这种类型的共聚物树脂已开发工业中的Elvax 40W的形式（40％（重量）的乙烯 - 乙酸乙烯酯共聚单体含量用“W”酰胺添加剂以改善沉淀处理）。此共聚物树脂是一种惰性物质，其是稳定的，在室温和体温。它并没有被证明可导致在生物组织中的过敏或毒性。此树脂，有效地传递大量的各种药物在不同的实验模型，探讨各种系统，如乳腺导管系统¹²中，初级听觉皮层^{13,14 <}功能/ SUP>，青蛙视觉系统^15。这种树脂也被用于在眼睛将药物递送到显影龟^16,17，鸡胚^18,19，和成人鼬视网膜^20。在大鼠中枢神经系统中，树脂仅被用于在大脑^21-23，但其在大鼠眼用尚未记录。

使用该共聚物树脂慢慢将药物递送至视网膜方法比其他方法的优点是，它是一种不引起炎症或刺激的眼睛稳定的化合物。不同于粒子的载体，该药物 - 树脂复合物就不会在植入后损害视力的，因为它通常保持在输送，而不是浮在玻璃体的部位。这将只需要一个简单的植入过程进入玻璃体腔内靠近眼睛的角膜缘，并在植入后不会需要缝合。最近，出现了几种新颖的递送系统的出现，如封装的电池技术^{（ECT）24,25，}水凝胶²⁶和缩微胶片^27。然而，在目前的研究中制备和输送的药物 - 树脂复合物所用的方法是既容易跟踪和便宜的，由此用于在基础研究环境中使用的更有利的。使用这种复合物能够提供长期的药物治疗的挑战是确定该药物，这将最大限度地具有较少的玻璃体内注射的治疗益处的最佳浓度。

本文旨在演示使用的药物 - 树脂复合物的长期治疗的成年大鼠视网膜。交付该模式的效果是用谷氨酸类似物2 - 氨基-4 - 膦酰（APB）作为药物测试。 APB块的ON双极细胞通过模仿谷氨酸，内源性神经递质在视网膜²⁸的光响应。当建业竞争与谷氨酸受体，它会阻止二极管灯吨的回应。 APB已用于生理研究，以控制视网膜功能和使用电生理学方法，如电图（ERG）测量它的效果。在以前的研究中，APB已被用于短期²⁹和长期治疗显影视网膜;后者所涉及的日常给予通过眼内注射单剂量为30天^30。用APB的相同量（0.092毫克，无菌盐水，以50μM的浓度）为所有注射如以前的工作^28,29,31建议。我们选择了APB以测试药物 - 树脂复合物作为缓释载体将药物递送到眼睛。在本研究中所述的方法类似的涉及药物-树脂复合物^16,32的制备以前描述的方法;然而，我们也详细的使用特别是在成年大鼠的眼睛。后的APB-装载树脂进入眼睛的手术植入，ERG进行建立APB是否废除第retinal光响应，并且因此是否APB已经成功地释放到玻璃体和视网膜。

Protocol

进行的所有实验均按照ARVO声明眼科及视觉研究用动物，并与阿奎拉动物伦理委员会的大学和澳大利亚国立大学动物实验伦理委员会的批准。成年大鼠（P100-200）用于在本研究中。

1，准备共聚树脂颗粒

1. 将20的Elvax 40W的小球进入在通风橱内的小玻璃烧杯中。
2. 填用100％乙醇确保覆盖所有粒料的烧杯中。
3. 用封口膜封住烧杯中，并将其浸泡在100％乙醇中的粒料在室温下搅拌7-10天。注：从这个步骤开始，不要用金属或塑料来处理或储存的树脂。

2，准备好药液的加载

1. 溶解所选择的药物中的0.1％二甲亚砜（DMSO）中。使药液达到体积40微升。装入树脂用，将在单剂量给予的药物的三倍的浓度。

3，准备和装入药物 - 树脂复合

1. 转移20洗涤粒料到另一个小玻璃烧杯中。溶解在4ml二氯甲烷中的丸粒约45分钟。用封口膜封住烧杯中，而颗粒溶解。
2. 通过在0.1％DMSO中溶解至0.001毫克/毫升的浓度制备坚牢绿FCF的溶液。
3. 取一吸管，并拟定40微升提前准备药液。加载另一个吸管40微升的快速绿色解决方案。
4. 同时添加两种溶液放入烧杯中。驴友迅速用玻璃搅拌棒，直到绿色染料在整个混合物均匀分布。
5. 将烧杯迅速转移到干冰10分钟快速冻结的树脂。
6. 设立“蒸发室”，以使溶剂蒸发。补较大的容器到三分之一以硫酸钙卵石。在卵石创建好，并小心地将烧杯中的井，使得卵石高达一半的烧杯中，以稳定腔室中的烧杯中。
7. 覆盖更大的外部容器的封口膜。
8. 蒸发室转移到冰柜。保持在-20℃下持续2-3周。

4，准备手术植入的药物 - 树脂复合

1. 从冰箱中取出的蒸发室。固体药物树脂块转移至玻璃盘放在冰上。
2. 用显微镜或放大镜的帮助下，切下一块0.05mm左右的直径和0.1mm的长度从块使用环钻或冲压工具。
3. 包住块的剩余部分中防冻材料（ 如铝箔），并保持在-20℃直到需要。

5，通过手术植入的药物 - 树脂复合成鼠眼

准备动物进行手术。麻醉用腹膜内注射氯胺酮（100毫克/千克体重）和赛拉嗪（12毫克/公斤体重）的混合物。观察动物直到全身麻醉的实现。注：动物应该有动作（呼吸除外）的损失，以及角膜和脚趾捏反射损失。

在完全麻醉的动物转移到手术台。使用mydriaticum（ 如硫酸阿托品）和局部麻醉剂（ 如盐酸丁卡因）滴在眼睛上（S）接受手术。应用人工泪液手术过程中，保持角膜湿润。使用一次性针头和消毒器械在整个手术。

稳定使用双钝弯钳后瞳孔完全散大的眼睛。使用手术显微镜进行全面深入的穿刺伤口，以达到玻璃体，约2从角膜缘使用将25g针头毫米。

将准备好的一件的T他的药物-树脂复合成使用一对细，尖镊子（ 例如镊子），其能够穿透穿刺部位的穿刺伤口。

作为预防细菌感染，应用抗生素软膏至眼睛，以防止炎症以及防止角膜干燥而动物正在恢复。

观察动物，直到完全康复。不要让动物无人看管，直到它恢复意识。不要将动物返回到其他动物的公司直至完全康复。如果动物显示压力或不适的迹象，镇痛药，应按照批准的职业道德协议中使用。

按照通常的实验方法收集和组织的分析。

在完成的试验中，实施安乐死的动物通过腹膜内注射戊巴比妥钠（60毫克/公斤体重）的2％利多卡因盐酸盐溶液。

注：盐酸利多卡因分钟imizes局部不适。

Representative Results

全视野视网膜电图（ERG）被用于检测APB的视网膜上的效果。有关如何在ERG进行详细说明，请参阅下面的研究^33,34。简言之，麻醉动物后，金电极被放置在眼睛的角膜上，和参考电极放置在两眼之间的前头皮，以记录视网膜的电活动。使用电子闪光灯单元中产生的刺激和10的强度不等，以10 ⁶个光异构化反应，其表示每根棒的活化光敏分子的数目。在这些实验中，ERG记录采取了在1和后7天过程。每只动物的右眼被植入的药物 - 树脂复合物，而对侧左眼用作未处理的内部控制。

图1示出了具有增加每根棒的光异构化反应的变化，b波的振幅（φ）。在对照眼的b波的振幅增大的闪光强度增加。在图1A中，视网膜响应录音给出1天植入后。植入眼显示了类似幅度的模式来控制眼球。两眼之间的振幅差成为显著不同在10 ^6φ（P <0.0001）。这表明，在早期阶段，该药物-树脂复合物不会对视网膜响应的效果，直至达到更高闪光强度， 图1B显示出变化，在第7天植入后的ERG响应。的b波被取消的各级闪光强度在植入眼睛中，当与对照相比，眼，其具有幅值可比第1天的记录。这是显著不同，以在第1天（P <0.0001），所有的振幅和植入眼睛。这表明，该视网膜响应的implantati之后被废除（一周）上的药物 - 树脂复合物进入眼睛的。

图1中的b波在第1天，1周的药物-树脂复合物的植入后的振幅，对于两个面板，控制眼睛显示为橙色（正方形），而植入眼睛中示出的绿色（圆）。符号*表示在两个眼睛之间这点上，其中，p <0.0001意义。对于所有的组中，n = 5，（A）中的b波的1天的药物-树脂复合物的植入到眼睛中之后的幅度。的b波相对于闪光强度（每杆φ光异构化反应）的振幅是视网膜反应的指标。有在所有闪光强度在两眼之间的b波振幅没有显著差除以10 ^6φ，其中植入眼具有较低的幅度。 （B）中的B-1波一周（7天）在植入后的振幅。从双眼记录的振幅显著不同在所有闪光强度。在植入的视网膜，b波的振幅是不能测定在任何刺激强度。

Discussion

本文证明了使用的药物 - 树脂复合物的药物缓释递送至视网膜。我们的目的是提出一种方法，它是相对便宜和容易在小动物模型适用。

鉴于APB的功能是作为一种谷氨酸类似物，它会阻止在眼睛的视网膜响应。结果表明，APB引起一个星期着床后的视网膜响应的堵塞。这表明，APB成功释放到玻璃体和视网膜，并且其作用仅限于眼睛的药物 - 树脂复合物注入。药物的全面影响变得越来越明显1周植入（ 图1B）之后。 图1A显示，第1天植入后，显著减少了b波的只存在于在植入眼10 ^6φ强度。这可能表明，在这个早期时间点，仅锥途径，这是为了响应 至更高的光强度，受影响。以确定的时间，该树脂能够提供APB到视网膜的长度，进一步的时间点应进行调查。所以建议记录在0-7天范围内的进一步的时间点应注意，例如，在3至5天植入后，准确地确定在视网膜响应被完全取消。此外，录音应采取超出7天，以确定多长时间建业被释放。这将是明显的，因为视网膜的反应将继续予以取消，如果建业在不断地缓慢释放进入玻璃体。

在这项研究中，药物 - 树脂复合物被认为是安全的用于递送至视网膜。 APB溶解在0.1％DMSO中。在浓度等于或高于0.6％，DMSO可引起视网膜毒性。然而，0.1％DMSO的已被发现是用于递送化合物至一个安全的车辆鼠眼^35，和该浓度被用于整个本研究的所有实验。该植入物插入transclerally入玻璃体腔，在锯齿缘。该植入物被发现留在大鼠的眼睛，这是收集的ERG的录音被制成后的冰冻切片锯齿缘。植入物的该定位保证了药物 - 树脂复合物不引起视力障碍。此方法涉及的药物 - 树脂复合物进行了测试，与其它化合物（公开在制备），并发现对眼睛没有结构或功能损伤，观察达两个月后植入。共有60动物植入，而在90％的情况下植入位置保持不变。

若干修改可以由该技术，如果有必要的。在这些实验中，APB的单一剂量的3倍的浓度加载到树脂（50微米×3 = 150微米），并且该笑ULD作为指引准备装药的解决方案。然而，在树脂中的药物的有效浓度是可变的，并且应该被测试，并相应地修改。的时间点，其中被进行了分析，还可以进行修改，以确定多长时间的树脂是在释放药物有效。在这些实验中，它表明，在稳定的有效剂量的药物通过药物 - 树脂复合物递送的所述至少一个星期，因此建议在植入后至少一周进行组织分析。在药物装载步骤，坚牢绿被用来确保该混合物均匀。其它生物安全色染料，可作为一种替代坚牢绿，以可视化的树脂内的药物的均匀性。这种方法的一个限制是，坚牢绿染料是均匀混合的唯一标准。此技术也可使用替代性的动物模型和药物测试，只有轻微的广告justments的方法。如果需要较高量的药物被输送，较大尺寸的植入物可能是必要的。如果成功，则在这些模型中，该共聚物树脂可作为一种治疗选择用于递送药物慢慢地向视网膜有随时间的持续作用。

在有些情况下要特别注意采取协议中的几个关键步骤。塑料和金属的仪器不应使用在整个树脂的合成和处理。这防止了聚合物的污染，如二氯甲烷可以溶解塑料和腐蚀金属。适当的干燥药物树脂块应该使用它手术植入前实现。确保含有药物和树脂的烧杯被完全暴露于硫酸钙，以使溶剂蒸发。可选择地，冷冻干燥可用于冷冻干燥的药物 - 树脂。该药物 - 树脂块准备使用时溶剂完全蒸发，并只有坚实的蓝色块留在烧杯中。当从切断植入块一件，每件只应立即准备手术前的作品都非常小，难以储存。甲环钻或冲压工具应该用来切割大小相等的块，以确保每片包含约药物的量相同。最后，插入一块进入刺伤了地下25针做的时候，用精，尖镊子小心地引导片进入伤口。在手术显微镜或高功率放大镜应作为视觉辅助。

只有亲水性药物和化合物已经使用这种方法进行测试。该药物 - 树脂复合物并没有表现出任何不希望的沉淀或副产物的形成，当将药物与聚合物的二氯甲烷混合。有人建议，在每个新的药物，浓度，作用半衰期，以及与树脂的混合物的任何可能的反应应可以由用户进行测试，以确定该方法是否合适。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elvax 40W Pellets	Du Pont, DE, USA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB)	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	A1910
Dichloromethane	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	34856
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA
Drierite, calcium sulfate	Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA	238910
Ketamine, Ilium Ketamil	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Xylazine, Ilium Xylazil-20	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Atropine sulphate, Minims eye drops	Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
Tetracaine hydrochloride, Minims eye drops	Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia
Chloramphenicol, Chlorsig ointment	Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia
Pentobarbital, Lethabarb	Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia
Lidocaine hydrochloride, Ilium Lignocaine-20	Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia
Uni-Core Punch Tool	World Precision Instruments Inc., FL, USA
Curved Forceps	World Precision Instruments Inc., FL, USA
Operating Microscope, Zeiss OPMI 99	Zeiss, West Germany
25 G Insulin needle	Terumo Corp., Tokyo, Japan
Dumont tweezers	World Precision Instruments Inc., FL, USA