siRNA Screening at identificere Ubiquitin og ubiquitinlignende System Regulators Biologisk Pathways i dyrkede pattedyrceller

Summary

Her beskriver vi en metode til at udføre en målrettet siRNA "ubiquitome" skærmen for at identificere nye ubiquitin og ubiquitin-lignende regulatorer af HIF1A-medierede cellulære respons på hypoxi. Dette kan tilpasses enhver biologisk sti, hvor en robust læse ud af reporter aktivitet er tilgængelige.

Abstract

Post-translationel modifikation af proteiner med ubiquitin og ubiquitin-lignende molekyler (UBLs) fremstår som en dynamisk cellulær signalering netværk, der regulerer forskellige biologiske veje, herunder hypoxi reaktion proteostasis, DNA beskadigelse respons og transkription. For bedre at forstå hvordan UBLs regulere veje relevante for sygdom hos mennesker, har vi samlet en menneskelig siRNA "ubiquitome" bibliotek bestående af 1.186 siRNA duplex puljer rettet mod alle kendte og forventede komponenter af UBL systemets veje. Dette bibliotek kan screenes mod en række cellelinjer, der udtrykker reportere af forskellige biologiske veje til at bestemme, hvilke UBL komponenter virker som positive eller negative regulatorer af vejen pågældende. Her beskriver vi en protokol udnytter dette bibliotek at identificere ubiquitome-regulatorer af HIF1A cellulær respons på hypoxi ved anvendelse af en transkription-baseret luciferase reporter. En indledende analyse udviklingsfaseer udført for at etablere passende screening parametre af den cellelinje, før du udfører skærmen i tre faser: primær, sekundær og tertiær / deconvolution screening. Brugen af ​​målrettet i hele genomet siRNA bibliotekerne bliver mere og mere populært, da det giver den fordel for rapportering kun medlemmer af vejen, som efterforskerne er mest interesseret. Trods iboende begrænsninger af siRNA screening, falsk-positive især forårsaget af siRNA ikke-tilsigtede effekter, identifikation af ægte nye regulatorer af veje pågældende opveje disse mangler, som kan overvindes ved at udføre en række omhyggeligt gennemført kontrol eksperimenter.

Introduction

Ændring af proteiner med ubiquitin og ubiquitin-lignende molekyler (UBLs) repræsenterer en ekspansiv biokemisk system, der regulerer forskellige biologiske veje og stressreaktioner. Den kovalente binding af UBLs til deres mål-proteiner kan have forskellige resultater regulerer stabilitet, lokalisering, funktion eller interactome af substratet ^1. De enzymatiske trin underliggende UBL modifikation blev først etableret for ubiquitin, og nu tjener som et paradigme for modifikation med de fleste UBLs, herunder SUMO, NEDD8, ISG15 og FAT10. For ændring optræder, carboxylatgruppen af ​​UBL diglycine motiv første aktiveres af en E1-aktiverende enzym til dannelse af en høj-energi thiol, der overføres til det aktive sted cystein af et E2-konjugerende enzym. E2 derefter interagerer med et substrat-bundne E3 ligase at mægle overførsel af UBL på (normalt) et mål lysin rest skabe en forgrenet kæde (isopeptide) kobling ². Successive runder af modifikation kan forekomme at opbygge isopeptide kæder på substratet, som for ubiquitin kan ske via en af ​​dens syv lysiner eller gennem dets N-terminale methionin til at skabe lineære ubiquitin kæder. Disse ændringer danner diskrete topologier med forskellige formål, såsom at skabe nye interaktion motiver og målretning proteiner til nedbrydning forud for UBL fjernelse af specialiserede proteaser. I tilfælde af ubiquitin er der to E1 enzymer, 30-40 E2 konjugerende enzymer, mindst 600 E3 ligaser og ca 100 deubiquitylating enzymer (DUBs). Mens veje er mindre ekspansiv for de andre 10 eller deromkring UBLs den samlede ubiquitome kompleksitet giver enorm mangfoldighed i den biologiske resultat af en bestemt UBL modifikation. Men mens store fremskridt i UBL biologi er blevet gjort, de præcise cellulære roller de fleste af disse ubiquitome komponenter forbliver ukendt.

Brugen af ​​korte interfering ribonukleinsyre (siRNAs) har vist sig som et stærkt værktøj i reverse genetik på grund af den evne siRNAs at målrette cellulære mRNA'er til destruktion, så den rolle de enkelte gener, der skal undersøges i forskellige biologiske ³ sammenhænge. Hele genomet skærme er blevet brugt til at identificere og validere nye regulatorer af mange cellulære processer, og har skabt et væld af nyttige data tilgængelige for den bredere videnskabelige samfund. Men mens hele genomet skærme har vist sig særdeles nyttig, er målrettet skærme bliver mere og mere populære, da de er billigere, hurtigere, indebærer mindre data management og kun rapportere om medlemmer af genomet, hvori den forsøgsansvarlige er mest interesseret. Derfor bedre at forstå hvilke cellulære processer UBL familien komponenter er involveret i, har vi samlet en menneskelig siRNA bibliotek rettet mod alle kendte og forventede komponenter i ubiquitome. Dette omfatter UBLs, E1 aktiverende enzymer, E2 konjugerendeenzymer, E3-ligaser, ubiquitin-bindende domæne (UBD)-holdige proteiner og DUBs. Dette bibliotek kan anvendes til screening af en lang række reporter cellelinjer af forskellige biologiske problemer, således at det objektiv identifikation af hidtil ukendte UBL komponenter for disse veje.

Følgende protokol beskriver, hvordan man udfører en streng målrettet siRNA ubiquitome skærmen for at identificere nye regulatorer af HIF1A-afhængige respons på hypoxi. Under normal oxygenspændingen, HIF1A er underlagt prolyl hydroxylering, der får den til at blive anerkendt og målrettet for nedbrydningen af Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligase kompleks ^4. Hypoxia hæmmer prolyl hydroxylering fører til stabilisering af HIF1A og den efterfølgende binding til hypoxi respons elementer (hRes) til at drive genekspression. Her beskriver vi en skærm ved hjælp U20S osteosarkomceller stabilt udtrykker ildflueluciferase under kontrol af tre tandemkopier af Hypoxia Respons Element (U20S-HRE celler) ^5.. Denne protokol kan tilpasses til enhver biologisk vej, hvis en robust udlæsning af reporter aktivitet er opnåeligt, og kan kobles med relevante positive og negative kontroller.

Protocol

1.. Assay Development Stage

Bemærk: Forud for siRNA skærmen et assay udviklingstrin er afgørende at opstille vigtige parametre for screening med reporter cellelinje. Det er vigtigt at investere en betydelig indsats på dette stadium, da dette vil understøtte den fremtidige succes af skærmen.

1. For at karakterisere den hypoxi-reaktionsevne U20S-HRE reporter cellelinie vokse 2 x 75 ^cm2 kolber i U20S-HRE celler til 80-90% konfluens i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS.
2. Aspirer medier fra en kolbe af celler vaskes to gange med 10 ml PBS og frigøre celler ved tilsætning af 2 ml 0,05% trypsin-EDTA-opløsning og inkubering ved 37 ° C i 5 min. Resuspender celler i 8 ml DMEM 10% FBS og pipette op og ned for at skabe en homogen cellesuspension.
3. Pipette udtages 20 ul af suspensionen til en celletælling kammer i to eksemplarer, og indsæt kammeret i en automatiseret celle counter. Klik på "Vis billede" på cellen tæller software og sikre cellerne er i fokus. Klik på "Count" og gøre et notat af cellen tæthed. Gentag dette for den anden duplo, og beregne den gennemsnitlige celletæthed. Fortynd cellerne med DMEM 10% FBS til en koncentration på 60.000 celler / ml.
4. Ved hjælp af en multikanal pipette tilsættes 100 ul (6.000 celler) af de fortyndede celler til de samme tre kolonner (f.eks A5-H5, A6-H6 og A7-H7) af 5 sterile hvide vægge 96-brønds assayplader, og overførsel til en befugtet 37 ° C inkubator med 5% CO ₂ natten over. Bemærk: disse plader vil blive anvendt til at bestemme hypoxi-afhængige luciferase udgang for en række hypoxi bestråling: 0 timer, 2 timer, 6 timer, 10 timer og 24 timer.
5. Ved slutningen af ​​den følgende dag, skal du notere tiden og tilføje 24 hr hypoxi pladen til hypoxi arbejdsstation sæt til 1% ilt. Den følgende morgen, beregne den tid 10 timer, 6 timer og 2 timer før 24 hr plade forventes at blive fjernet frabout hypoxi arbejdsstation. På disse tidspunkter, tilsæt 10 timer, 6 timer og 2 timer plader hypoxi arbejdsstation.
6. Forbered 30 ml 2x kombineret luciferase lysis / assaypuffer (50 mM Tris, pH 7,8, 16 mM _MgCl2, 2 mM DTT, 2% Triton-X-100, 30% glycerol, 1 mM ATP, 1% BSA; 0,25 mM luciferin og 8 uM Na ₄ P ₂ O _7). Bemærk: tilføje komponenter i nævnte rækkefølge og lade BSA mindst 30 minutter for at opløse inden tilsætningen af luciferin og Na ₄ P ₂ O _7.
7. Fjern alle plader fra hypoxi arbejdsstation på et passende tidspunkt. Tilsæt 100 ul 2x luciferase lysis / assaypuffer til de relevante brønde assaypladen og dækkes med klar film. Ryst pladerne på en pladeryster i 10 minutter ved 500 omdrejninger til grundigt at lysere cellerne.
8. Overfør pladestabelen til en automatiseret 96 brønds plade luminometer rack. Under "Protokoller" menuen, vælg "abs 595", og fremhæve alle wells skal læses i på skærmen pladediagram under "godt valg" menuen. Klik på "run" for at måle luminescens af hver brønd derefter beregne den gennemsnitlige læsning af hver plade. Beregn hypoxi-afhængige fold-stigning på reporter aktivitet ved at dividere den gennemsnitlige læsning af hver hypoxi plade med den gennemsnitlige læsning af normoxi (0 hr hypoxi) kontrol plade. Bemærk: Det er vigtigt at overholde en robust hypoxi-afhængig luciferaserespons at være egnet til screening. Et fem-ti gange stigning i reporter aktivitet betragtes fremragende.
9. Opret en master kontrol plade, der indeholder fire høj kontrol (HIF1A siRNA) gentagelser (brønde A1-D1), fire ringe kontrol (FIH1 siRNA) replikater (brønde A12-D12), kun fire buffer styrer gentagelser (brønde E1-H1) og fire non-target siRNA kontrol gentagelser (E12-H12), hvor alle siRNA pools er ved en koncentration på 200 Nm. Bemærk: Høje og lave kontroller er etableret baseret på kendte pathway regulatorer, der øger og DECRlette hypoxi reaktion hhv. Alternativt kan assayudvikling ved hjælp af en delmængde af biblioteket anvendes til at identificere passende kontrol.
10. Ved hjælp af en multikanal pipette 10 ul af hver kontrol siRNA til en steril hvid walled assayplade. Forbered transfektion blanding af 0,1 pi transfektionsreagens i 10 pi nedsat serum medium (1:100) pr godt, og overførsel 10 ul Transfektionsblandingen til hver kontrol godt. Pipettere op og ned kortvarigt at blande og lade pladen hvile i 20-60 minutter for at tillade transfektion kompleksdannelse.
11. Forbered en celle suspension på 75.000 celler / ml med den anden kolbe af U20S-HRE celler. Hjælp af en multikanalpipette, tilsættes 80 pi (6.000 celler) af cellesuspension til hver transfektion mix. Overfør pladen til en befugtet 37 ° C inkubator med 5% _CO2 i 24 timer, og derefter overføres til en hypoxi arbejdsstation til yderligere 24 timer og udfører luciferaseassays som beskrevet i trin 1.6-1.8.
12. Beregn Z-faktor for de høje og lave kontrol ved hjælp af formlen Z = 1 - [3 x (standardafvigelse af høj kontrol + standardafvigelsen for lav kontrol) / (gennemsnit af høj kontrol - gennemsnit af lav kontrol)]. Bemærk: en værdi på mellem 0,5-1 angiver en fremragende analyse og bør stræbes efter.

2.. Primary Screen

Bemærk: Når disse grundlæggende betingelser fra assayudvikling fase er på plads, kan den primære screening udføres in triplo i 96-brønds-plade-format ved hjælp af følgende protokol.

1. Grow 7 x 75 ^cm2 kolber i U20S-HRE celler til 80-90% konfluens i DMEM suppleret med 10% v / v føtalt bovint serum (FCS).
   Bemærk: Følgende trin 2,2-2,13 bør foretages på dag 1..
2. Indled replikat 1 ved at forberede en master kontrol plade indeholdende 200 pi hver kontrol som beskrevet i trin 1,9 og optøning en fortyndingsrække af siRNA ubiquitome library i mindst 30 min. Bemærk: Hver brønd indeholder en pulje på 4 siRNAs samlet i 17 x 96-brønds plader med kolonne 1 og 12 tomme, for kontrol.
3. I en laminar flow hætte, etiket (eller bar-kode) 17 sterile hvide walled assayplader med låg fra numre 1-17, svarende til hver plade af siRNA biblioteket serien.
4. Centrifugér master-pladen og siRNA ubiquitome biblioteket kort (1 min ved 2000 xg) for at sikre, at alle siRNAs akkumuleres ved bunden af ​​brønden.
5. Brug en automatiseret væske dispenser til robotersvejsede "frimærke" 10 ul af hver kontrol fra master kontrol plade på de 17 assayplader, ved hjælp af den samme 96-godt tip stak for hver plade.
6. Ved hjælp af en frisk 96-brønds spids stakken for hver af de 17 Bibliotek plader, overførsel 10 ul af hver ubiquitome siRNA til den tilsvarende assayplade anvendelse af en automatiseret væskedispenser.
7. Forbered 40 ml transfektionsreagens for 17 assayplader anvendelse af forholdet established i 1.10. Bemærk: Dette omfatter yderligere 20 ml prøver at forklare den "døde volumen" i cellen dispenser. De "døde volumen" henviser til omfanget af væske til stadighed er til stede i slangen netværk i cellen dispenser.
8. Brug en automatiseret celle dispenser til at overføre 10 pi transfektionsreagens til hver brønd i de 17 assayplader. Kort ryste assaypladerne på et rysteapparat (1 min ved 500 rpm) for at tillade grundig blanding af siRNA og transfektionsreagens, derefter forlade stadig ved stuetemperatur i 20-60 minutter for at tillade siRNA: transfektionsreagens kompleksdannelse.
9. Vask to 75 ^cm2 kolber i U20S-HRE cellerne to gange med 10 ml PBS og tag med 2 ml trypsin-EDTA ved 37 ° C i 5 min. Tilsæt 8 ml DMEM 10% FBS til hver kolbe og pipette op og ned flere gange for at skabe en homogen cellesuspension. Kombiner celler fra begge kolber og overføres til en steril 50 ml plastrør.
10. Beregn koncentrationen celle ved pipettering20 celler ul i duplikat til en celle tællekammer og beregn den gennemsnitlige koncentration celle fra to aflæsninger af en automatiseret celletæller som beskrevet i trin 1.3.
11. Forbered 155 ml cellesuspension ved fortynding med DMEM 10% FBS til en koncentration på 75.000 celler per ml i en steril plastbeholder. Bemærk: denne mængde er tilstrækkelig til 17 plader og indeholder yderligere 25 ml til dødvolumenet i cellen dispenser.
12. Tilføj en steril magnetomrører til cellesuspensionen og sted på en omrører sat op inde i laminar flow hætte at begrænse celle sammenklumpning. Ækvilibrer automatiseret celle dispenser med cellesuspensionen og sæt den til at dispensere 80 pi celler per brønd (6.000 celler).
13. Placer hver af de 17 plader, til gengæld ind i det automatiserede celle dispenser og dispensere celler. Registrere den tid og stak plader i grupper på 5 og derefter placere stakke i en fugtig 37 ° C inkubator med 5% _CO2 i 24 timer. Bemærk: den endelige koncentration afsiRNA puljen vil være 20 nM i 100 pi den samlede volumen.
    Bemærk: Følgende trin 2,14-2,15 skal udføres på dag 2..
14. Indlede anden replikere på dag 2, efter proceduren i Dag 1 for replikat 1 (2,2-2,13).
15. Efter 24 timer af transfektion, transfer plader fra replikat 1 i et sterilt miljø til en hypoxi arbejdsstation fastsat til 1% ilt og orlov til 24 timer for at inducere HRE reporter.
    Bemærk: Følgende trin 2,16-2,20 skal udføres på dag 3.
16. Indled tredje replikat, efter proceduren i Dag 1 for replikat 1 (2,2-2,13).
17. Efter 24 timer af transfektion, transfer plader fra replikat 2 i et sterilt miljø til en hypoxi arbejdsstation fastsat til 1% ilt og orlov til 24 timer for at inducere HRE reporter.
18. To timer før replikere 1 plader, der skal fjernes fra hypoxi arbejdsstation, forberede 200 ml 2x luciferase lysis / assaypuffer som beskrevet i 1.6. Bemærk: denne mængde ifatter yderligere 20 ml for at sikre stødpudebeholderen stadig godt dækket.
19. Fjern replikere 1 assayplader fra hypoxi arbejdsstationen efter 24 timer hypoxi eksponering og anvendelse af en automatiseret væskedispenser, tilsættes 100 pi 2x luciferase lysis / assaypuffer til hvert assay plade og dækkes med klar film.
20. Ryst pladerne på en celle-ryster i 10 minutter ved 500 omdrejninger til grundigt at lysere cellerne. Overfør hver plade i tur til et luminometer pladelæser og optage luminescens som beskrevet i trin 1.8.
    Bemærk: Følgende trin 2,21-2,22 skal udføres på Dag 4.
21. Efter 24 timer af transfektion, transfer plader fra replikat 3 i et sterilt miljø til en hypoxi arbejdsstation fastsat til 1% ilt og orlov til 24 timer for at inducere HRE reporter.
22. Læs replikat 2 plader ved følgende trin 2,18-2,20 anvendes til replikat 1.
    Bemærk: Følgende trin 2.23 skal udføres på dag 5.
23. Læs replikere 3 plader ved at følgetrin 2,18-2,20 anvendes til replikat 1.
24. Kompiler alle 3 eksemplarer af den primære skærm, og beregne Z faktor for hver plade ved hjælp af formlen givet i 1.12. Bemærk: Hvis nogen plade har en Z-faktor på mindre end 0,5, overveje at gentage denne plade for at forbedre datakvaliteten.
25. Beregn varianskoefficient (CV) for den høje og den lave kontrol ved hjælp af følgende formel: 100 x standardafvigelse af kontrol / gennemsnit af kontrol. Bemærk: CV skal være så lavt som muligt, er det rimeligt at forvente 10-15% variation. Hvis variationen er betydeligt højere, overveje at gentage pladen.
26. Beregn procent aktivering af hver siRNA per plade ved hjælp af følgende formel: [(gennemsnit af høj kontrol - siRNA score) / (gennemsnit af høj kontrol - gennemsnit af lav kontrol)] x 100 Desuden beregne den ikke-target (NT. )-fold hver siRNA ved hjælp af formlen [Demodata / gennemsnit af NT]. For både procent aktivering og NT-fold, beregner gennemsnittet af de tre replicates og kompilere værdierne.
27. Brug de rå data, beregne Spearman rang Korrelationskoefficient (SRCC) for at afgøre, hvor tæt de tre replikatplader korrelerer ved hjælp af formlen:
    
    hvor r = SRCC; d = forskellen mellem de to tal i hvert par af rækker, og n = antallet af par af data. Bemærk: en god korrelation mellem plade gentagelser vil give værdier tæt på 1. Hvis en gentagelse viser lav SRCC mod de andre 2 plader, yderligere undersøge og overveje at gentage, at pladen..
28. Beslut hvilke siRNAs er af tilstrækkelig interesse for sekundær screening (op til 80). Ansæt brugerdefinerede cut offs (f.eks Valg af alle siRNAs viser mindre end 5% eller over 95% procent aktivering, eller mindre end 0,5 NT-fold eller over 1,5 NT-fold) eller anvende bioinformatik eller videnbaseret begrundelse for at søge efter klynger af rammer, der henhører under samme UBL vej. Bemærk:normalt en kombination af disse metoder bestemmer, hvilke siRNA tages sekundær screening.

3.. Sekundære skærm

Bemærk: en bekræftende sekundær skærm udføres baseret på højst 80 siRNAs af interesse fra den primære skærm. Dette nummer kan hensigtsmæssigt udføres med hver gentagelse belagt på en enkelt plade med 96 brønde med fuld kontrol som pr primære screening (se 2.2). Det er meget nyttigt at bekræfte, at de regulerende myndigheder er identificeret i den primære skærm reproducerbart fremkalde den samme fænotype, og dette vil hjælpe med at forfine triage beslutninger der rammer skal gennemføres til den endelige tertiære / deconvolution skærm.

1. Grow 1 x 75 ^cm2 kolbe U20S-HRE celler til 80-90% konfluens i DMEM med 10% FBS.
2. Bemærk pladen antallet og placeringen af ​​de primære skærm hits, og planlægge deres nye placering på den sekundære skærm kirsebær plukket mester plade, der forlader kolonne 1 end 12 gratis for kontrol. Forbered kontrol mester plade som i 1.9, men med en samlet volumen på hver kontrol på 50 pl.
3. Optø en anden fortyndingsrække af ubiquitome bibliotek (afsat til cherry-picking enkelte siRNA puljer) i mindst 30 min. Centrifugeres pladerne kortvarigt (1 min ved 2.000 xg) tilsæt derefter 50 pi de sekundære skærm siRNAs til deres nye plade placeringer på kirsebær plukket mester plade.
4. Udføre den sekundære skærm ved hjælp af den samme grundlæggende protokol skitseret for den primære skærm med følgende ændringer: (a) at køre alle tre gentagelser på samme dag i en assayplade pr replikere og (b) i mængder reagenser i overensstemmelse hermed.

4.. Tertiær / Deconvolution Screen

Bemærk: videregående eller deconvolution screening udføres på maksimalt 20 siRNAs fra den sekundære skærm. Dette skridt er at undersøge effekten af ​​knockdown hjælp af hvert enkelt siRNA fra den oprindelige pool fire. Normalt skal mindst to individuelle siRNA dobbelthuse fra hver pulje ulovlig samme fænotype til at have en rimelig grad af tillid til, at den observerede fænotype skyldes ikke siRNA off-target effekter. For yderligere at øge tilliden på dette tidspunkt, kan yderligere individuelle siRNA dobbelthuse målrettet det pågældende gen være konstrueret og testet for deres evne til at fremkalde den givne fænotype. Resultater fra disse forsøg kan derefter bruges til at beregne H score, hvor H = 0,6 eller derover (dvs. hvor mindst 3 ud af 5 individuelle siRNAs fremkalde fænotype) betragtes som acceptabelt ^6.

1. Grow en 75 ^cm2 kolbe U20S-HRE celler til 80-90% konfluens i DMEM med 10% FBS.
2. Opret en plade kort for den tertiære skærm ved at planlægge placeringen af ​​de fire individuelle siRNA dobbelthuse i hvert hit på den tertiære skærm mester plade, der forlader kolonne 1 og 12 gratis for kontrol. Forbered kontrol mester plade som i 1.9, men med en samletmængde af hver kontrol på 50 pl.
3. Optø dekonvolution / individuel siRNA plader og der tilsættes 50 ul af de enkelte siRNAs (200 nM) i hver brønd af den tertiære skærmen trykplade ifølge pladens (4.2) for at muliggøre tre x 10 gentagelser pi og en behagelig 20 pi overskydende .
4. Udføre den tertiære skærmen ved hjælp af samme grundlæggende protokol skitseret for den primære skærm med følgende ændringer: (a) kører alle tre gentagelser på samme dag i en assayplade pr replikere og (b) Juster mængder reagenser i overensstemmelse hermed

Bemærk: Ideelt tærsklen for individuelle siRNA dobbelthuse bør fastsættes på samme stringens cut-off som for puljen. Dog kan det være acceptabelt at slappe af tærsklen med 10-20% for individuelle siRNAs, især hvor mindst én anden duplex falder inden for den fastsatte tærskel. Det er værd i betragtning af at den individuelle virkning af siRNAs kan være mindre endpuljen, og omvendt, i nogle tilfælde individuelle siRNAs kan vise en stærkere effekt på det cellulære fænotype i isolation, end når det findes i puljen (selv når koncentrationen tegnede sig for).

Representative Results

Forud for screening, er hypoxi-reaktionsevne U20S-HRE celler etableret. U20S-HRE celler udtrykker en reporter konstruktion bestående af ildflueluciferase smeltet nedstrøms tre tandem kopier af hypoxi respons element, som er bundet af HIF1A/HIF1B heterodimeren ved udsættelse for hypoxi (figur 1A). Cellerne er placeret i en hypoxi arbejdsstation for en række gange for at fastslå, hvilke hypoxi eksponering producerer de mest effektive reaktion til screening. U20S celler udtrykker lave niveauer af HIF2A derfor luciferase aflæsninger er i høj grad afhængig hypoxiamedieret HIF1A stabilisering ^7.. Eksponering af U20S-HRE celler til hypoxi til 0 timer, 2 timer, 4 timer, 6 timer og 24 timers resulterer i en hypoxi-afhængig induktion af luciferaseaktivitet (figur 1B). Eksponering af U20S-HRE celler til hypoxi i 24 timer resulterer i en ~ 10 fold induktion af aktivitet (figur 1B), hvorfor dette udgør etn fremragende svar for siRNA screening.

At etablere passende høje og lave kontroller, der siRNAs til HIF1A og FIH1 bruges til at vende transfektion U20S-HRE celler. Celler transficeret med kontrol i 24 timer og udsat for hypoxi i yderligere 24 timer, før luciferase-assays udført. HIF1A siRNA mindsker hypoxi signal til omkring 10%, mens FIH1 siRNA forbedrer hypoxi signal til omkring 170% i forhold til ikke-target siRNA (Figur 2). Disse kontroller føre til en gennemsnitlig Z faktor på 0,8, hvilket er en fremragende score for screening. Screeningsparametre er nu succesfuldt oprettet for en robust skærm.

Den primære skærm er udført i 96-brønds plade format ved hjælp af arbejdsprocessen demonstreret i figur 3.. Kontrol og bibliotek siRNAs er stemplet på assayplader (figur 3A), og U20S-HRE celler omvendt transficeret så jegncubated ved 37 ° C i 24 timer. Assaypladerne derefter udsat for hypoxi i 24 timer (figur 3B), før luciferase-assays udføres, og dataene analyseres (figur 3C). Kvalitetskontrol analyse af skærmen omfatter bestemmelse af Z-faktor for hver plade, hvor en Z-faktor over 0,5 er ønskeligt ^{8, 9.} Z faktor beregnes for hver plade i tre eksemplarer primære screening ved hjælp af formlen i figur 4A. Z faktorer for hver plade er visualiseret under anvendelse af et punktdiagram, hvor det kan ses hver plade har en Z-faktor er større end 0,5 (figur 4B). Beregning af Z-faktor er vigtig, da den fortæller om, hvor god en adskillelse vindue eksisterer mellem kontrol og kan fremhæve potentielle problemer med individuel skærm assaypladerne. CV af de høje og lave kontroller er også beregnet, og gennemsnittene er 5,95% + / - 0,4 og 8,04% + / - 1,2 hhv. Den primære screeningresulterer i en fordeling af siRNA dobbelthuse danner et kontinuum mellem de lave og høje kontroller. Typisk vil der være omtrent lige store antal af positive og negative regulatorer, med størstedelen af siRNAs har ingen virkning på reporteren (figur 5). Regulatorer af interesse er taget igennem til sekundær derefter tertiær screening for at opstille en liste over yderst overbevisende regulatorer til opfølgning analyse og validering.

Figur 1. Hypoxi eksponeringen inducerer U20S-HRE luciferase reporter. (A) Skematisk repræsenterer hypoxi reporter konstrukt i U20S-HRE celler anvendt til siRNA screening. Tre tandem kopier af hypoxi respons elementet (HRE) er bundet af HIF1A/HIF1B heterodimeren at drive eXpression af ildflueluciferase. (B) Øget eksponering af U20S-HRE celler til 2 timer, 6 timer, 10 timer og 24 timer til hypoxi resulterer i stigende mængder reporter luciferaseaktivitet. 24 timers hypoxi eksponeringsresultater med ~ 10 gange stigning i luciferaseaktivitet i forhold til 0 hr kontrol (normoxi). Skala søjler repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien.

Figur 2.. Etablering høje og lave siRNA styringer til screening. U20S-HRE celler omvendt transficeret med siRNA til HIF1A (lav kontrol) og FIH1 (høj kontrol) reducere og forøge respons på 24 hr hypoxi eksponering hhv. Disse kontroller giver en Z-faktor på 0,8, der betragtes som en fremragende score for screening. Konsekvenserne af ikke-target (NT) siRNA er vist forsammenligning. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelserne af middelværdien.

Figur 3.. Screening workflow til at identificere regulatorer af HIF1A hypoxi respons. (A) Placering af plader med 96 brønde til siRNA screening. Kontrol siRNAs er stemplet på ydersiden kolonner som angivet og den ubiquitome siRNA biblioteket er stemplet på de indre søjler, fordelt på 17 plader. U20S-HRE celler reverse-transficerede og inkuberet ved normoxi i 24 timer. (B) stakke af assaypladerne overføres i et sterilt miljø til en hypoxi arbejdsstation til 1% oxygen i 24 timer. (C) Pladerne fjernes fra hypoxi arbejdsstation og luciferaseaktivitet assays udføres på alle assaypladerne. Luminescensregistreret på et luminometer og dataanalyse udføres for at fastslå reporter aktiviteten af ​​celler transficeret med hvert bibliotek siRNA.

Figur 4.. Kvalitetskontrol udføres ved at beregne Z faktor hver plade. (A) Z-faktor for hver plade er beregnet ved hjælp af formlen, hvor s repræsenterer standardafvigelsen, m repræsenterer middelværdien, s. positiv kontrol og n den negative kontrol. (B) Scatter plot viser den beregnede Z-faktor af hver plade fra de tre eksemplarer af den ubiquitome skærmen. En cut-off på 0,5 anvendes, og i dette tilfælde alle plader vise et Z-faktor> 0,5 og derfor passere kvalitetskontrol.

Figur 5. Figur viser fordelingen af siRNA bibliotek figur viser hyppigheden af siRNAs fra tre eksemplarer ubiquitome siRNA skærm, der resulterer i den tilsvarende procent aktivering.. Lave og høje kontroller er sat til 0% og 100%. SiRNA-biblioteket fordeles jævnt mellem den høje og lave kontrol, hvorved størstedelen af ​​siRNAs har ingen indvirkning på den cellulære fænotype. En lille del af siRNAs observeret at hæve og sænke respons, og derfor repræsenterer de potentielle nye regulatorer af vejen.

Discussion

Brugen af ​​genom-dækkende siRNA skærme i pattedyrceller har vist sig at være yderst værdifuldt at identificere nye regulatorer af forskellige biologiske veje. Her har vi beskrevet anvendelsen af ​​en målrettet ubiquitome siRNA skærmen for at identificere regulatorer af HIF1A cellulær respons på hypoxi. Målrettede skærme bliver mere og mere attraktive som de generelt er billigere, hurtigere, nemmere at administrere og aflægger kun rapport om de pathway komponenter, som efterforskerne er interesseret ^{7, 10, 11.}

Det er afgørende at sætte en stor indsats i assayet udviklingsstadiet sikre grundlæggende celle reporter er egnet til screening, og at reproducerbarhed og lav variabilitet kan opnås. Det er også vigtigt at vælge robuste positive og negative kontroller til at skabe et vindue af adskillelse inden for hvilken bibliotekets regulatorer vil falde. Desuden disse fungere som en intern kontrol i hvert assay plade afskærmen giver mulighed for hurtig identifikation af eventuelle problemer med enkelte plader.

Et almindeligt problem i high throughput screening, er forekomsten af ​​pladen randeffekter, som kan være forårsaget af en lokal forskel i fugtighed ved de udvendige brønde af pladen i forhold til de interne brønde. At have den fornødne kontrol på plads og skabe et zonekort af pladen output kan hjælpe med at identificere problemet. Vi har fundet, at randeffekter kan overvindes ved hjælp af fugtigt filtrerpapir på bunden af ​​pladerne, og anbringe et stift, transparent plastpose over stakken af ​​plader til at mikromiljø hver plade inde i inkubatoren mere jævn.

En begrænsning af siRNA screening er tilstedeværelsen af ​​falske positiver og falske negativer. Falske negativer kan opstå på grund af en række faktorer, herunder utilstrækkelige knockdown af den tilsvarende mRNA, eller evnen af ​​resterende mRNA til at producere tilstrækkeligt handlingive protein til effektivt at udføre sin funktion. Falsk-positiver er mere problematiske, da de kan forårsage en efterforsker til at investere en betydelig mængde tid at følge op et hit, der kan faktisk ikke regere vejen pågældende. Falsk-positiver kan genereres gennem en række mekanismer, herunder via siRNA off-target effekter. Dette er, hvor siRNA vælter ikke kun mRNA i spørgsmålet, men også andre, uidentificerede mål, er de sande pathway regulatorer ^{12, 13.} En række metoder er almindeligt anvendt og accepteret som bekræftelse på, at den observerede fænotype er et sandt resultat af banker ned målet genet i spørgsmål ^14. For eksempel kan problemet med off-target effekter overvindes delvist ved tertiær screening, hvorved sandsynligheden for mere end en enkelt siRNA fra udgangsmaterialet pulje af fire med samme off-target virkning nedsættes. Desuden lykkedes at udføre redningsaktioner eksperimenter med siRNA-resistentecDNA'er, der svarer til hittet vil også udelukke ikke-tilsigtede effekter. Det skal bemærkes, at denne fremgangsmåde er i sig selv ikke uden forbehold, for eksempel eksogent overudtrykt proteiner vil ikke nødvendigvis fungere identisk med det endogene modstykke skyldes ændret støkiometrien af de relevante komplekser eller perturbed posttranslationelle modifikationer osv. En alternativ fremgangsmåde til at ramme validering derfor er at generere eller erhverve knockout eller knock-i cellelinjer svarende til de hits, og afgøre, om disse cellelinjer vise den samme fænotype som siRNA knockdown. Således kan begrænsninger af siRNA screening overvindes med omhyggelig eksperimentel opfølgning. Endvidere objektiv identifikation af ægte modifikatorer af veje under kontrol langt opvejer de problemer, der er forbundet med potentielt identificere falske positiver.

Sammenfattende siRNA screening med en målrettet "ubiquitome" siRNA Biblioteket er et powerful metode til at identificere hidtil ukendte medlemmer af ubiquitin og ubiquitin-lignende modificerende regulerer forskellige biologiske veje. Protokollen beskrevet her kan anvendes på ethvert biologisk problem, hvis der er en robust udlæsning af reporter aktivitet. Den endelige liste over høj tillid hits fra skærmen repræsenterer udgangspunktet, hvorfra at etablere det mekanistiske grundlag for, hvordan hver enkelt hit regulerer vej pågældende. I sidste ende vil denne tilføjelse til den voksende viden om, hvordan ubiquitin og ubiquitin-lignende modifikatorer regulere forskellige biologiske veje.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated Liquid Dispenser	Fluid-X	XPP-721	http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html
White Walled Assay Plate	Greiner Bio One	655083	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/
Clear Plate Film	Perkin Elmer	1450-461	http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461
siRNA library	Thermo Scientific	On-Target Plus	http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/
Transfection reagent	Invitrogen	Lipofectamine RNAimax	http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html
Reduced Serum Medium	Invitrogen	Optimem	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product
DMEM	Invitrogen	41965-039	http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#
FBS	Invitrogen	16000-044	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#
Tryspin-EDTA	Invitrogen	25300-054	https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#