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Biology

EPR की Cofactors की रिडॉक्स अनुमापन निगरानी Published: November 26, 2014 doi: 10.3791/51611
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology

Abstract

इलेक्ट्रॉन समचुंबक अनुनाद (EPR) रेडॉक्स अनुमापन एक शक्तिशाली तरीका प्रोटीन में सहकारकों के मध्य क्षमता का निर्धारण करने के लिए और उनके पहचाने जाने रेडॉक्स राज्य में सहकारकों की पहचान करने और यों तो कर रहे हैं पर नजर रखी।

तकनीक यह इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण की दरों के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है के रूप में, दृष्टिकोण, लेकिन अध्ययन के तहत प्रोटीन में सहकारकों की पहचान और रेडॉक्स राज्य स्थापित करता प्रत्यक्ष electrochemistry (Voltammetry) का पूरक है। तकनीक एक इलेक्ट्रॉन समचुंबक अनुनाद (EPR) से detectable cofactor युक्त किसी भी प्रोटीन के लिए व्यापक रूप से लागू होता है।

एक ठेठ अनुमापन 1-100 माइक्रोन की रेंज में एक cofactor एकाग्रता के साथ 2 मिलीलीटर प्रोटीन की आवश्यकता है। प्रोटीन एक निश्चित क्षमता से कम नमूना संतुलन के क्रम में एक रासायनिक reductant (सोडियम dithionite) या ऑक्सीडेंट (पोटेशियम ferricyanide) के साथ titrated है। एक प्लैटिनम तार और एक एजी / AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड एक वाल्ट से जुड़े हैंमीटर प्रोटीन समाधान की क्षमता को मापने के लिए। 13 विभिन्न रेडॉक्स मध्यस्थों का एक सेट प्रोटीन की रेडॉक्स सहकारकों और इलेक्ट्रोड के बीच संतुलित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। नमूने प्रोटीन में अलग रेडॉक्स सहकारकों के लिए विशेषता विभिन्न क्षमता और इलेक्ट्रॉन समचुंबक अनुनाद स्पेक्ट्रा, पर तैयार कर रहे हैं, मापा जाता है। नमूना संभावित बनाम संकेत तीव्रता की साजिश cofactor के मध्य क्षमता का निर्धारण करने के क्रम में नेर्न्स्ट समीकरण का उपयोग कर विश्लेषण किया है।

Introduction

यह इस ग्रह, प्रकाश संश्लेषण, नाइट्रोजन स्थिरीकरण और श्वसन पर जीवन को बनाए रखने के सबसे मौलिक रासायनिक प्रक्रियाओं, कार्बनिक और अकार्बनिक रेडॉक्स सहकारकों की एक विस्तृत श्रृंखला से युक्त बड़े प्रोटीन परिसरों द्वारा उत्प्रेरित कर रहे हैं कि हड़ताली है। यह सभी प्रोटीन का लगभग 30% एक या एक से अधिक धातु सहकारकों होते हैं कि अनुमान लगाया गया है। 1,2 की पहचान करना और रेडॉक्स सहकारकों प्रत्यक्ष electrochemistry (जैसे, प्रोटीन फिल्म Voltammetry) या रेडॉक्स अनुमापन का उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है निस्र्पक। दो तकनीकों उनके स्वभाव और प्रयोज्यता में पूरक हैं। Voltammetry एक इलेक्ट्रोड सतह के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं कि मध्य क्षमता और सहकारकों की इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण कैनेटीक्स के तेजी से दृढ़ संकल्प प्रदान करता है। 3,4 आमतौर पर इस तरह के साइटोक्रोम ग या ferredoxin के रूप में इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण प्रोटीन, के लिए अच्छी तरह से काम करता है। और यह कभी कभी एक इलेक्ट्रोड सतह को स्थिर कर दिया गया है कि और अधिक जटिल प्रोटीन के लिए काम करता है। का विस्तृत ज्ञानप्रोटीन में सहकारकों की प्रकृति voltammogram cofactor की पहचान पर कोई सीधी जानकारी नहीं देंगे, के रूप में उपलब्ध हो गया है। रिडॉक्स अनुमापन निष्पादित करने के लिए और अधिक श्रमसाध्य हैं और प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा में आवश्यकता होती है। हालांकि, वे मध्य क्षमता और cofactor की पहचान के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। 5 इसके अलावा एक प्रोटीन में कई सहकारकों नजर रखी जा सकती है एक एकल अनुमापन में।

एक redox अनुमापन के सिद्धांत रेडॉक्स सक्रिय प्रोटीन या एंजाइम रासायनिक या कम ऑक्सीकरण हो जाता है कि है। आदेश में सहकारकों उपयोग किया जाता है reductant या ऑक्सीडेंट रेडॉक्स मध्यस्थों के साथ प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए। ये रेडॉक्स मध्यस्थों भी समाधान की क्षमता से मापा जा सकता है, ताकि एक इलेक्ट्रोड के साथ प्रतिक्रिया। मध्यस्थों एक redox बफर के रूप में कार्य और प्रोटीन और इलेक्ट्रोड में सहकारकों के बीच संतुलित करना। रासायनिक वांछित मूल्य के लिए संभावित poising के बाद, एक नमूना ओ को तरल नाइट्रोजन में जमे हुए जल्दी से तैयार की गई है औरस्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक के साथ आगे के विश्लेषण के AIT। EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी यह मात्रात्मक समचुंबक धातु केन्द्रों या जैविक कण को ​​मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में इस संबंध में विशेष रूप से उपयोगी है।

रेडॉक्स अनुमापन दो दिशाओं में प्रदर्शन किया जा सकता है: कम से उच्च करने के लिए या उच्च से कम मध्य क्षमता के लिए। चुनाव अध्ययन के तहत सहकारकों की स्थिरता पर निर्भर है। अक्सर यह कम क्षमता पर शुरू करने और क्षमता में वृद्धि stepwise को ऑक्सीडेंट जोड़ने के लिए बुद्धिमान है। यह एक ऑक्सीडेटिव अनुमापन कहा जाता है और यहाँ वर्णित है। यहाँ हम Saccharomyces cerevisiae से प्रोटीन Nar1 युक्त लोहे सल्फर क्लस्टर के रेडॉक्स अनुमापन दिखा। इस प्रोटीन साइटोसोलिक लोहे सल्फर क्लस्टर biosynthetic मशीनरी (सीआईए मार्ग) में, एक पाड़ प्रोटीन के रूप में होने की संभावना शामिल है। 6,7

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Protocol

सेटअप और समाधान के 1. तैयारी

  1. 100 मिमी Tris, पीएच 8.5 से कम 250 मिमी NaCl और 10% ग्लिसरॉल युक्त बफर समाधान तैयार है। आर्गन साथ निस्तब्धता द्वारा बफर Deaerate। एक anaerobic चेंबर में बफर का परिचय।
  2. दो भागों में बफर फूट डालो। एक हिस्से (बफर ए) 1 मिमी डीएल-dithiothreitol जोड़ने के लिए और 1 मिमी एल सिस्टीन (डीटीटी, एम 154.25 छ / मोल आर)। अन्य भाग (बफर बी) के एजेंटों को कम करने में नहीं है।
  3. ऑक्सीडेंट और reductant समाधान तैयार करें। 1 मिलीलीटर 2 का समाधान, 20, और 200 मिमी पोटेशियम ferricyanide बनाओ (FIC, एम 329.26 छ / मोल आर) और anaerobic बफर बी में सोडियम dithionite (एसडी, एम 174.11 छ / मोल आर) की
  4. इस प्रकार के रूप मध्यस्थ मिश्रण तैयार करें:
    1. बी बफर के लिए निम्न रेडॉक्स मध्यस्थों और 50 मिमी NaCl में से प्रत्येक के 160 माइक्रोन जोड़ें: एन, एन, एन ',' एन -tetramethyl-P-phenylendediamine (TMPD, एम 237.17 छ / mol r, 'ई 0 .276 वी) , 2,6-dichlorophenol indophenol(DCIP, एम 290.08 छ / मोल, ई आर, Methylene नीले (एम आर '(0 .055 वी, phenazine ethosulphate 0 .217 वी) पी इ एस, एम 334.4 छ / मोल, ई आर') 319.85 / छ Mol, ई ' 0 .011 वी), Resorufin (एम आर 235.17 छ / मोल, 'ई 0 -0.051 वी), Indigodisulphonate (एम आर 466.35 छ / मोल,' ई 0 -0.125 वी), 2-हाइड्रोक्सी-1,4-naphtaquinone ( एम आर 174.15 छ / मोल, 'ई 0 -0.145 वी), Anthraquinone-2-सल्फ़ोनेट (एम आर 328.28 छ / मोल,' ई 0 -0.225 वी), Phenosafranin (एम आर 322.8 छ / मोल, 'ई 0 -0.252 वी), Safranin हे (एम आर 350.84 छ / मोल, 'ई 0 -0.280 वी), तटस्थ लाल (एम आर 288.8 छ / मोल,' ई 0 -0.340 वी), लोबान viologen (एम आर 409.4 छ / मोल, ई '0 -0.350 वी), और मिथाइल viologen (एम 257.16 छ / मोल, ई आर' 0 -0.440 वी)।
    2. मध्यस्थ की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में बोतल लपेटेंप्रकाश से एस।
  5. तैयार करें 10 मिलीग्राम / एमएल एस cerevisiae स्ट्रेप टैग Nar1 प्रोटीन बफर ए एक्सप्रेस एस में (181 माइक्रोन, एम 55.2 केडीए R) ई में cerevisiae Nar1 कोलाई एक स्ट्रेप टैग प्रोटीन के रूप में एक pET24A अभिव्यक्ति सदिश का उपयोग। Strep-tactin क्रोमैटोग्राफी मीडिया (आईबीए) का उपयोग कर एक anaerobic कक्ष में प्रोटीन शुद्ध और ऐसे AKTA शोधक (जीई हेल्थकेयर) के रूप में एक प्रोटीन शोधन प्रणाली का उपयोग कर शुद्ध।
  6. के रूप में निम्नानुसार एक anaerobic कक्ष में रेडॉक्स अनुमापन सेटअप तैयार:
    1. एक एजी / AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड और अनुमापन पोत के लिए एक प्लैटिनम तार इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें। वी अप करने के लिए एम वी से उपाय कर सकते हैं कि एक वाल्टमीटर करने के लिए दोनों इलेक्ट्रोड कनेक्ट
    2. एक छोटे से सरगर्मी बार डालें।
    3. एक चुंबकीय दोषी के ऊपर अनुमापन पोत रखें।
    4. बफर बी, यानी 72 माइक्रोन प्रोटीन के अंतिम सांद्रता के लिए अप करने के लिए 2 मिलीलीटर, और प्रत्येक के 38 माइक्रोन के लिए मध्यस्थ मिश्रण समाधान और प्रोटीन समाधान के साथ अनुमापन पोत भरेंमध्यस्थ। नोट: प्रोटीन एकाग्रता पर निर्भर करता है और आवश्यक मध्यस्थ समायोजित किया जाना चाहिए तीन समाधान की मात्रा में सांद्रता।
    5. 30 मिनट के लिए हलचल और वाल्टमीटर पर स्विच।
  7. 10 स्वच्छ क्वार्ट्ज ग्लास EPR ट्यूब तैयार करें। अवायवीय कक्ष में ट्यूबों का परिचय।
  8. तरल नाइट्रोजन के साथ एक छोटी सी (200 मिलीलीटर लगभग) तरल नाइट्रोजन देवर भरें।

2. रिडॉक्स अनुमापन सम्पन्न

  1. समाधान की क्षमता स्थिर है जब तक प्रतीक्षा करें। नोट: व्यवहार में इस क्षमता प्रति मिनट से कम एक एम वी drifts कि इसका मतलब है।
  2. वोल्टमीटर द्वारा दिए गए संभावित नीचे ध्यान दें।
  3. 200 μl का पहला नमूना ड्रा और एक EPR ट्यूब में इंजेक्षन।
  4. एक रबड़ डाट के साथ ट्यूब टोपी और anaerobic कक्ष से ट्यूब को हटा दें।
  5. इस प्रकार के रूप में तरल नाइट्रोजन में ट्यूब रुक: सावधानी! इस अन्यथा ट्यूब टूट जाएगा, धीरे से किया जाना है।
    1. पहले टी डालनेतरल नाइट्रोजन में ट्यूब के आईपी।
    2. एक सिसकी सुना जा सकता है जब तक प्रतीक्षा करें। नोट: यह 10 सेकंड तक का समय लग सकता है।
    3. नमूना हिस्सा पूरी तरह से जलमग्न है कि तो धीरे धीरे ट्यूब के बाकी डालें।
  6. -0.6 वी का हल करने की क्षमता को कम करने के लिए अनुमापन पोत में समाधान के लिए 2 मिमी एसडी समाधान के एक छोटे से विभाज्य 1-2 μl जोड़ें
    नोट: अधिक से अधिक 10 μl जोड़ा जाना आवश्यक है, तो 20 मिमी समाधान करने के लिए स्विच। यह एक विशिष्ट संभावित मूल्य के लिए संतुलन के लिए बहुत मुश्किल है, वाल्टमीटर पर दर्ज वास्तविक मूल्यों को नीचे लिखा है और अनुमापन वक्र का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
  7. कदम 2.3-2.5 में वर्णित के रूप में एक नमूना ड्रा।
  8. वोल्टमीटर द्वारा दिए गए वास्तविक क्षमता के नीचे ध्यान दें।
  9. संभावित लगभग 50 एम वी की वृद्धि हुई है जब तक ऑक्सीडेंट जोड़ें। 2 मिमी FIC के समाधान के एक छोटे से विभाज्य 1-2 μl जोड़कर शुरू करो। 10 से अधिक μl जोड़ा जाना आवश्यक है, तो 20 मिमी समाधान करने के लिए स्विच।
  10. Ho नीचे नोटडब्ल्यू समाधान के ज्यादा जोड़ा गया है। नोट: इस अनुमापन दौरान नमूना कमजोर पड़ने के लिए सही करने के लिए आवश्यक है।
  11. चरणों 2.3-2.5 में वर्णित के रूप में एक नमूना ड्रा।
  12. वोल्टमीटर द्वारा दिए गए वास्तविक क्षमता के नीचे ध्यान दें।
  13. दोहराएँ कवर किया गया है -0.6 वी 0.2 वी से संभावित सीमा तक 2.9 और 2.12 कदम है और सभी 10 EPR ट्यूब 200 μl के साथ प्रत्येक भर रहे हैं।
    नोट: हर वापसी के साथ मात्रा कम हो जाता है के रूप में इलेक्ट्रोड की स्थिति समायोजित करने की आवश्यकता सरगर्मी के हस्तक्षेप के बिना समाधान के साथ अच्छे संपर्क हो सकता है। यह पिछले नमूना की वापसी और इसलिए है कि नमूना की क्षमता कम सटीक हो सकता है के बाद क्षमता को मापने के लिए मुश्किल हो सकता है।
  14. EPR माप जगह नहीं ले सकता जब तक वैकल्पिक रूप से, तरल नाइट्रोजन में जमे हुए EPR नमूनों की दुकान।

EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी और डेटा विश्लेषण का उपयोग 3. उपाय अनुमापन नमूने

  1. अलग से रिकॉर्ड EPR स्पेक्ट्राअनुमापन नमूने इस प्रकार है:
    1. <10 -5 पट्टी करने के लिए एक क्वार्ट्ज cryostat खाली करने के लिए एक उच्च वैक्यूम पंप का प्रयोग करें।
    2. EPR चुंबक का पानी ठंडा करने पर स्विच करें। EPR गुहा के माध्यम से शुष्क हवा के प्रवाह को खोलें।
    3. चुंबक करने के लिए बिजली की आपूर्ति और EPR के कंप्यूटर पर स्विच करें।
    4. एक आवृत्ति अंशांकन प्रोग्राम चलाएँ। EPR माप मानकों सेट करें। तरल हीलियम देवर को cryostat कनेक्ट करें। 16/09 के लिए गुहा कूल
    5. गुहा में EPR नमूना परिचय। EPR स्पेक्ट्रम रिकार्ड।
  2. अलग EPR प्रजातियों की पहचान और संकेत यों के लिए सबसे अच्छा स्पेक्ट्रा का उपयोग करें। एक बाहरी तांबा मानक समाधान के स्पेक्ट्रम के साथ स्पेक्ट्रा और तुलना के दोहरे एकीकरण द्वारा EPR मात्रा का ठहराव पाना 10 मिमी CuSO / 2 एम NaClO 4 4/10 मिमी एचसीएल। 8
  3. इस प्रकार के रूप अनुमापन वक्र बनाओ:
    1. पैरा के लिए विशेषता है कि एक छ मूल्य पर EPR संकेत आयाम प्लॉटसंभावित खिलाफ हित के चुंबकीय प्रजातियों।
    2. एक spins को EPR संकेत आयाम पैमाने पर परिवर्तन / अणु पैमाने 3.2 कदम से EPR मात्रा का ठहराव का उपयोग करके।
    3. ऑक्सीकरण या एजेंट को कम करने के जोड़ की वजह से हुआ है कि कमजोर पड़ने के लिए प्रत्येक नमूने के संकेत आयाम ठीक कर लें।
    4. एजी / AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के मध्य क्षमता के लिए संभावित ठीक कर लें।
      नोट: (संतृप्त KCl के साथ) एजी / AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड 25 डिग्री सेल्सियस पर स्टैंडर्ड हाइड्रोजन इलेक्ट्रोड (वह) बनाम 0.194 वी के मध्य की क्षमता है। वोल्टमीटर पर संभावित -0.6 वी लगभग पढ़ता है, तो इसलिए, वह करने के लिए संदर्भ के साथ संभावित -0.4 वी है
  4. इस प्रकार के रूप नेर्न्स्ट समीकरण के संकेत फिट:
    एक प्रजाति के लिए कि कम राज्य में समचुंबक है:
    1 समीकरण
    समचुंबक ओ में है कि एक प्रजाति के लिएxidized राज्य:
    2 समीकरण
    एक मध्यवर्ती राज्य में समचुंबक है कि एक प्रजाति के लिए:
    3 समीकरण
    इन समीकरणों एक इलेक्ट्रॉन स्थानांतरित कर रहा है, जिसमें redox प्रतिक्रियाओं के लिए मान्य हैं, इसलिए N = 1।
    वाल्ट में ई = संभावित
    ई एम = वाल्ट में मध्य संभावित
    एफ = फैराडे निरंतर = 96,480 सी · मोल -1
    आर = गैस निरंतर = 8.314 जम्मू · कश्मीर -1 · मोल -1
    केल्विन में टी = तापमान

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Representative Results

Nar1: Saccharomyces cerevisiae से प्रोटीन Nar1 युक्त लोहे सल्फर क्लस्टर के रेडॉक्स अनुमापन तीन अलग अलग सहकारकों की पहचान में हुई एक [3Fe-4S] क्लस्टर, एक [4Fe-4S] क्लस्टर और एक मोनोन्यूक्लियर फ़े केंद्र (चित्रा 1) । EPR संकेतों उनकी जी-मूल्यों की विशेषता है: के लिए [3Fe-4S] + जी Z 2.01, जी क्रॉसओवर 2.00 (चित्रा 1 बी); के लिए [4Fe-4S], जी Z 2.02 छ Y 1.93, जी एक्स 1.82 (चित्रा सी), और मोनोन्यूक्लियर फ़े 3+ जी 4.3 और 9.7 (चित्रा 1 ए) के लिए। [4Fe-4S] क्लस्टर के EPR संकेत Nar1 के लिए सूचित किया गया है कि क्या करने के लिए इसी तरह की है कि पहले। 6,9 मोनोन्यूक्लियर लोहे की EPR संकेत एक विषमकोण उच्च स्पिन फेरिक प्रजातियों (चित्रा 1 ए) के लिए विशेषता है।

EPR संकेतों की मात्रा संकेत दिया [4Fe-4S] किक्लस्टर और मोनोन्यूक्लियर फ़े में लगभग प्रोटीन एकाग्रता का 60% equimolar हैं, और [3Fe-4S] क्लस्टर सामग्री केवल 5% (चित्रा 1) है। [3Fe-4S] क्लस्टर सबसे अधिक संभावना एक गिरावट उत्पाद और अधूरा समूह है। [3Fe-4S] क्लस्टर संकेत संभवतः कारण ऑक्सीडेटिव क्षरण करने के लिए, 0.05 वी के ऊपर गायब हो गया।

निम्न मध्य क्षमता अलग सहकारकों के लिए निर्धारित किया गया है:

मोनोन्यूक्लियर फ़े केंद्र की फ़े 3+ / फ़े 2 + जोड़ी (2A चित्रा) के लिए 0.003 वी, -0.125 [3Fe-4S] के लिए वी / [3Fe-4S] 0 जोड़ी (चित्रा 2 बी) और -0.45 बीच और [4Fe-4S] 2 + / [4Fe-4S] जोड़ी (चित्रा -2) के लिए -0.50 वी। कारण [4Fe-4S] के कम मूल्य कोई सटीक मध्य संभावित क्लस्टर के लिए निर्धारित किया जा सकता है। [4Fe-4S] क्लस्टर की कम क्षमता में यह एक redox भूमिका नहीं है जो इंगित करता हैप्रोटीन यह क्लस्टर कम करने के लिए बहुत मुश्किल हो जाएगा। मोनोन्यूक्लियर लोहे केंद्र कम या कोशिका द्रव्य में ऑक्सीकरण जा सकता है। इस केंद्र के एक redox भूमिका इसलिए संभव है।

शुद्ध Nar1 प्रोटीन पर स्वतंत्र लोहे के दृढ़ संकल्प ferene विधि का उपयोग किया गया था। 10 यह 3.2 फ़े / अणु afforded। मोनोन्यूक्लियर फ़े संकेत अणु प्रति 0.6 फ़े का प्रतिनिधित्व करता है, और [3Fe-4S] क्लस्टर केवल 0.05 प्रति अणु है। यह 2.45 फ़े / अणु, और प्रोटीन अणु प्रति इसलिए 0.61 [4Fe-4S] क्लस्टर छोड़ देता है। -0.45V पर [4Fe-4S] क्लस्टर के EPR संकेत की मात्रा का ठहराव 0.26 spins के / अणु में हुई। तो [4Fe-4S] क्लस्टर इन quantifications के आधार पर -0.45 वी में कम किया जा सकता है [4Fe-4S] के मध्य संभावित 2 + / [4Fe-4S] जोड़ी की -0.46 वी निर्धारित किया गया था की केवल 42% ।

चित्रा 1
चित्रा 1: EPR Nar1 के विभिन्न सहकारकों के स्पेक्ट्रा। (ए) मोनोन्यूक्लियर उच्च स्पिन फेरिक एस .031 वी EPR शर्तों पर तैयार Nar1 के = 5/2 संकेत: माइक्रोवेव आवृत्ति, 9.386 गीगा; माइक्रोवेव शक्ति, 20 डीबी; मॉडुलन आवृत्ति, 100 किलोहर्ट्ज़; मॉडुलन आयाम, 12.5 जी; -0.004 वी EPR शर्तों पर तैयार Nar1 का तापमान 16 लालकृष्ण (बी) [3Fe-4S] क्लस्टर एस = 1/2 संकेत: माइक्रोवेव आवृत्ति, 9.386 गीगा; माइक्रोवेव शक्ति, 16 डीबी; मॉडुलन आवृत्ति, 100 किलोहर्ट्ज़; मॉडुलन आयाम, 12.5 जी; तापमान 9.5 लालकृष्ण (सी) [4Fe-4S] -0.45 वी EPR शर्तों पर तैयार Nar1 के क्लस्टर एस = 1/2 संकेत: माइक्रोवेव आवृत्ति, 9.385 गीगा; माइक्रोवेव शक्ति, 16 डीबी; मॉडुलन आवृत्ति, 100 किलोहर्ट्ज़; मॉडुलन आयाम, 12.5 जी; तापमान -0.25 वी नीचे 9.2 लालकृष्ण मिथाइल viologen और लोबान viologen की कटियन कट्टरपंथी प्रजातियों की वजह से है जो एक तेज एस = 1/2 संकेत (*) दिखाई दिया।

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चित्रा 2: Nar1 की सहकारकों की रिडॉक्स अनुमापन। (ए) जी = 4.3 पर नजर रखी मोनोन्यूक्लियर उच्च स्पिन फेरिक संकेत का अनुमापन वक्र;। जी पर नजर रखी (बी) अनुमापन [3Fe-4S] की वक्र + संकेत = [4Fe-4S] के 2.01 (सी) अनुमापन वक्र + संकेत जी = 1.82 पर नजर रखी। ठोस लाइनों मध्य क्षमता मोनोन्यूक्लियर फ़े केंद्र की फ़े 3+ / फ़े 2 + जोड़ी के लिए 0.003 वी, [3Fe-4S] / [3Fe-4S के लिए -0.125 वी के साथ N = 1 रेडॉक्स बदलाव के लिए फिट बैठता हैं ] [4Fe-4S] 2 + / [4Fe-4S] जोड़ी के लिए शून्य जोड़े -0.46 वी।

चित्रा 3
चित्रा 3:। मध्यस्थ मिश्रण का गठन कि विभिन्न रेडॉक्स मध्यस्थों की नेर्न्स्ट घटता आदेश giv के रूप में छोड़ दिया सही से हैएन प्रोटोकॉल में और 1 टेबल में।

नाम कैस संख्या वह बनाम 'ई 0 (वी) डब्ल्यू एम (छ / मोल)
एन, एन, एन ',' एन -tetramethyl-P-phenylendediamine (TMPD) · (एचसीएल) 2 637-01-4 0.276 237.17
2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), सोडियम नमक 620-45-1 0.217 290.08 *
Phenazine ethosulfate (पी इ एस) 10510-77-7 0.055 334.4
Methylene नीले 122965-43-9 0.011 319.85 *
Resorufin, सोडियम नमक 34994-50-8 -0.051 235.17
Indigodisulfonate (इंडिगो कारमाइन) 860-22-0 -0.125 466.35
2-हाइड्रोक्सी-1,4-naphtaquinone 83-72-7 -0.145 174.15
Anthraquinone-2-सल्फ़ोनेट ना + एच 2 ओ 153277-35-1 -0.225 328.28
Phenosafranin 81-93-6 -0.252 322.8
Safranin हे 477-73-6 -0.280 350.84
तटस्थ लाल 553-24-2 -0.340 288.8
लोबान viologen 1102-19-8 -0.350 409.4
मिथाइल viologen 1910-42-5 -0.440 257.16 *

* निर्जल

तालिका 1: मध्यस्थ मिश्रण का गठन कि रिडॉक्स मध्यस्थों।

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Discussion

13 रेडॉक्स मध्यस्थों की श्रृंखला -0.45 से वह बनाम 0.3 वी (1 टेबल और चित्रा 3) को सीमा में समाधान में एक redox संतुलन की अनुमति देता है। अच्छी तरह से ऊपर है और इन क्षमता से नीचे के सभी मध्यस्थों या तो पूरी तरह से कम या पूरी तरह से ऑक्सीकरण और इसलिए प्रोटीन की रेडॉक्स सक्रिय केन्द्रों के साथ आगे नहीं संतुलन हो सकता है कर रहे हैं। कभी कभी रेडॉक्स अनुमापन केवल एक संकीर्ण सीमा 11 से मापा जा करने की इजाजत दी है, केवल दो या तीन मध्यस्थों के साथ प्रदर्शन कर रहे साहित्य के रूप में यह एक महत्वपूर्ण धारणा है। रेडॉक्स cofactor के मध्यस्थों के मध्य क्षमता का 50 एम वी ± लगभग की एक सीमा के भीतर एक मध्य क्षमता है अगर इस तरह के रेडॉक्स अनुमापन केवल विश्वसनीय परिणाम दे देंगे। विभिन्न मध्यस्थों के मध्य क्षमता का तापमान निर्भरता निर्धारित किया गया है और यह कि रेडॉक्स अनुमापन तैसा का 80 डिग्री सेल्सियस। 12 वाष्पीकरण के रूप में उच्च तापमान पर प्रदर्शन किया जा सकता दिखाया गया थाराशन समाधान सबसे अधिक प्रोटीन युक्त समाधान के साथ संगत है जो न्युजोल खनिज तेल की एक परत जोड़ने से रोका जा सकता है।

समाधान और अनुमापन पोत के anaerobicity बहुत महत्वपूर्ण है। अनुमापन अधिमानतः एक anaerobic glovebox में प्रदर्शन किया जाना चाहिए। हालांकि, यह एक आर्गन गैस की आपूर्ति से जुड़ा एक मोहरबंद अनुमापन पोत का उपयोग करना संभव है। EPR ट्यूब रबर टयूबिंग के छोटे टुकड़े का उपयोग कर एक आर्गन / वैक्यूम कई गुना करने के लिए जोड़ा जा सकता है। अनुमापन नमूने 13 सेमी लंबे सुइयों के साथ gastight सीरिंज का उपयोग कर रबर टयूबिंग के माध्यम से ट्यूब में इंजेक्ट किया जा सकता है।

प्रोटीन एरोबिक शर्तों के तहत precipitates रूप Nar1 anaerobicity का अनुमापन के दौरान बहुत महत्वपूर्ण था () नहीं दिखाया। कोई वर्षा अनुमापन के दौरान हुई।

EPR दोनों दृष्टिकोणों मध्य पीओ निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि रेडॉक्स अनुमापन, प्रत्यक्ष electrochemistry (Voltammetry) के पूरक हैं नजर रखी सहकारकों की tentials। पहले एक उनके EPR से detectable रेडॉक्स राज्य में cofactor (एस) की पहचान और मात्रा का ठहराव प्रदान करता है। उत्तरार्द्ध इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण कैनेटीक्स के बारे में जानकारी प्रदान करता है और प्रोटीन की छोटी मात्रा की आवश्यकता है। अक्सर प्रत्यक्ष विद्युत दृष्टिकोण के लिए आवश्यक है के रूप में रेडॉक्स अनुमापन के लिए प्रोटीन के नमूने, एक सतह पर विशेष पूर्व उपचार या स्थिरीकरण की आवश्यकता नहीं है।

डायरेक्ट electrochemistry केवल विशिष्ट मामलों में सफल रहे और इष्टतम स्थितियों को खोजने के लिए गहन प्रयोग की आवश्यकता है। EPR रेडॉक्स अनुमापन की परवाह किए बिना एंजाइम प्रणाली की जटिलता के कारण, रेडॉक्स सहकारकों चिह्नित करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल दृष्टिकोण प्रदान करते नजर रखी। इस तकनीक को कई सहकारकों के साथ बड़े प्रोटीन परिसरों के लक्षण वर्णन में अपरिहार्य है। संरचनात्मक जानकारी और एंजाइम कैनेटीक्स के लक्षण वर्णन के साथ संयोजन में, उत्प्रेरक तंत्र महान विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है।

jove_content "> इस अध्ययन में एस cerevisiae Nar1p की सहकारकों विशेषता थे लोहे सहकारकों के तीन अलग अलग प्रकार पाया गया:।। मोनोन्यूक्लियर लोहा, एक [3Fe-4S] क्लस्टर और एक [4Fe-4S] क्लस्टर [3Fe की मात्रा -4S] क्लस्टर प्रोटीन एकाग्रता का केवल 5% थी और संभावना [4Fe-4S] क्लस्टर के एक oxidative गिरावट उत्पाद का प्रतिनिधित्व करता है। मोनोन्यूक्लियर लोहा और [4Fe-4S] क्लस्टर दोनों stoichiometric मात्रा में मौजूद थे। के मध्य संभावित [4Fe-4S] क्लस्टर क्लस्टर के शारीरिक ऑक्सीकरण राज्य है कि 2 + और यह क्लस्टर एक redox समारोह है कि संभावना नहीं है कि जो इंगित करता है, बहुत कम है। मोनोन्यूक्लियर लोहा, हालांकि, एक मध्यवर्ती मध्य क्षमता है और संभवतः शारीरिक शर्तों के तहत एक redox बदलाव आए।

रेडॉक्स एंजाइमों के Biocatalytic अनुप्रयोगों के अक्षय स्रोतों से अधिक टिकाऊ सिंथेटिक मार्गों के लिए मांग के जवाब में उभर रहे हैं। रेडॉक्स पी की विशेषताइन एंजाइमों की roperties इन एंजाइमों का तंत्र और उत्प्रेरक गुंजाइश को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, laccase की T1 के तांबे के केंद्र के मध्य संभावित इन एंजाइमों का एक महत्वपूर्ण विशेषता माना जाता है। laccases का उत्प्रेरक दक्षता T1 के तांबे केंद्र और सब्सट्रेट 13 के मध्य संभावित में अंतर यानी, इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण के thermodynamic ड्राइविंग बल पर सीधे निर्भर होना दिखाया गया है। रिडॉक्स अनुमापन एंजाइम और प्रोटीन में अलग रेडॉक्स सक्रिय सहकारकों के मध्य क्षमता प्राप्त करने के लिए एक बहुत मजबूत तरीका प्रदान करते हैं। तकनीक अपेक्षाकृत आम तौर पर प्रोटीन के कुछ मिलीग्राम की आवश्यकता होती है, प्रोटीन के मामले में मांग की है, लेकिन यह बहुत संभावना सफल हो जाएगा।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के लिए आर्थिक रूप से रासायनिक डिजाइन (एनआरएससी कटैलिसीस) के द्वारा नियंत्रित डच नेशनल रिसर्च स्कूल युग्म, कटैलिसीस से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। डॉ हरियाणा Steensma और लीडेन विश्वविद्यालय से डॉ GPH वैन Heusden एस के संयोजक अभिव्यक्ति के साथ उनके समर्थन के लिए स्वीकार कर रहे हैं cerevisiae Nar1।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reference electrode (Ag/AgCl) Radiometer
Chemicals Sigma-Aldrich
EPR spectrometer Bruker
N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) · (HCl)2 637-01-4
2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt 620-45-1
Phenazine ethosulfate (PES) 10510-77-7
Methylene blue 122965-43-9
Resorufin, sodium salt 34994-50-8
Indigodisulfonate (indigo carmine) 860-22-0
2-hydroxy-1,4-naphtaquinone 83-72-7
Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O 153277-35-1
Phenosafranin 81-93-6
Safranin O 477-73-6
Neutral red 553-24-2
Benzyl viologen 1102-19-8
Methyl viologen 1910-42-5

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 93 redox अनुमापन इलेक्ट्रॉन समचुंबक गूंज Nar1 cofactor लोहे सल्फर क्लस्टर मोनोन्यूक्लियर लोहा मध्य संभावित
EPR की Cofactors की रिडॉक्स अनुमापन निगरानी<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1
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Hagedoorn, P. L., van der Weel, L.,… More

Hagedoorn, P. L., van der Weel, L., Hagen, W. R. EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. J. Vis. Exp. (93), e51611, doi:10.3791/51611 (2014).

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