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Immunology and Infection

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T Published: June 19, 2014 doi: 10.3791/51627
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Summary

A capacidade de monitorar as respostas das células T em detalhe, in vivo é importante para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta imune. Aqui nós descrevemos o uso de matrizes alvo fluorescentes (ACL) em um ensaio in vivo de células T em que avalia> 250 parâmetros simultaneamente por citometria de fluxo.

Abstract

A capacidade de monitorar as respostas das células T in vivo é importante para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta imune e da criação de imunoterapias. Aqui nós descrevemos o uso de tecnologia de matriz alvo fluorescente (FTA), que utiliza corantes vitais, tais como éster carboxifluoresceína succinimidyl (CFSE), corantes excitáveis ​​a laser violeta (violeta CellTrace: CTV) e corantes excitáveis ​​de laser vermelho (celular Proliferação Dye eFluor 670: CPD ) para combinatorialmente linfócitos etiqueta rato em> 250 agrupamentos de células fluorescentes discerníveis. Aglomerados de células dentro dessas ACL pode ser pulsada com histocompatibilidade principal (MHC) de péptidos de ligação de classe I e MHC de classe II e assim actuar como células-alvo para as células CD8 + e células T CD4 +, respectivamente. Estas células FTA permanecer viável e totalmente funcional, e pode, portanto, ser administrado em ratos para permitir a avaliação de CD8 + T mediada por células morte de células alvo FTA e CD4 + T hel meditado-cellp de TLC células B alvo de células em tempo real in vivo, por citometria de fluxo. Desde> 250 células alvo pode ser avaliada de uma só vez, a técnica permite o monitoramento de respostas de células T contra vários epítopos de antígeno em várias concentrações e em múltiplas repetições. Como tal, a técnica pode medir as respostas das células T, tanto a um (por exemplo, a magnitude da resposta cumulativa) quantitativa e um (por exemplo, avidez funcional. Eo epitopo de reactividade cruzada da resposta) qualitativa nível. Aqui, nós descrevemos como esses TLCs são construídos e dar um exemplo de como eles podem ser aplicados para avaliar as respostas de células T induzidas por uma vacina de vírus da varíola recombinante.

Introduction

As células T desempenham um papel central na resposta imune adaptativa e são frequentemente alvo de manipulação em imunoterapia. As células CD4 + T efectoras responder ao antigénio estranho pela secreção de citocinas que regulam muitos aspectos da imunidade e também podem ajudar directamente as células B para fabricar anticorpos. As células T citotóxicas CD8 + (CTLs) podem também responder ao antigénio estranho pela secreção de citocinas, bem como desempenha um papel central em matar directamente as células que expressam um antigénio estranho. A interacção fundamental que inicia estas funções efectoras de células T envolve a interacção do receptor de células T (TCR) com peptídeos estranhos apresentados em moléculas de MHC na superfície das células. As células CD4 + T reconhecem péptidos apresentados em moléculas de MHC de classe II nas células que apresentam os antigénios e células T CD8 + reconhecem péptidos apresentados em moléculas de MHC de classe I que são normalmente apresentadas em células microbianas infectado.

Em ordempara avaliar o papel de células T desempenham na resposta imune, é essencial que as suas funções efectoras são medidos por técnicas fiáveis ​​e sensíveis. Os métodos comuns de avaliação de resposta das células T incluem; MHC class-I/II/peptide tetramer reatividade; produção de citocinas por ELISPOT e coloração de citocinas intracelulares; e matando a capacidade em 51 ensaios de Cr-lançamento. Estes ensaios, no entanto, são tipicamente realizados ex vivo com estimulação in vitro, ou fornecer uma visão limitada em função das células T. Idealmente, ao medir as respostas das células T, seria benéfico para os avaliar in situ, in vivo à medida que ocorrem, sem a manipulação de células T, de modo a evitar alterações nos parâmetros funcionais que podem ocorrer através de estimulação in vitro. Alguns dos mais vulgarmente usados ​​em células T ensaios funcionais in vivo são baseados na medição de morte por CTL mediada de células alvo pulsadas com péptidos do MHC de classe I de ligação, que são enumerados in vivovia sua detecção através de marcação fluorescente com corantes vitais como CFSE. Embora estes tipos de ensaios podem monitorar morte mediada por CTL de metas quando acontecem in vivo, eles já tinham uma capacidade relativamente limitada para avaliar a morte de múltiplos alvos que apresentam diferentes concentrações e tipos diferentes de epítopos peptídicos, que é necessário para permitir que os parâmetros qualitativos, tais avidez tão funcional e variante epítopo reatividade cruzada a ser avaliado. Estes ensaios também não fornece nenhuma informação sobre as respostas mediadas por células T CD4 +.

Para superar muitas das limitações com os métodos atuais usados ​​para avaliar as respostas das células T, que recentemente desenvolveu um ensaio multiplex com base em matrizes fluorescentes alvo (ACL), que permite o monitoramento de respostas de células T contra> 250 células alvo simultaneamente em um animal por citometria de fluxo 1, 2. FTAs são compostas de linfócitos marcados com SEVeral concentrações e combinações de corantes vitais como CFSE, CTV e CPD permitindo> 250 grupos de células de fluorescência único a ser gerado. Uma vez que estas células permanecem viáveis ​​e completamente funcional, que pode ser injectado no animal para permitir a monitorização da sua interacção com células T efectoras in vivo 3. Por exemplo, os agregados de células FTA podem ser pulsadas com péptidos do MHC-I de ligação à classe para permitir a avaliação de morte por CTL específica de antigénio mediada por células-alvo 1. Além disso, os agregados de células FTA também podem ser pulsadas com péptidos de MHC de classe II de ligação, permitindo a avaliação do antigénio específico para a célula T auxiliar (T H), avaliando a actividade de activação (por avaliação de marcadores de activação, como CD69, CD44 e / ou CD62L) de células B dentro do FTA rolamento peptídeo cognato 2. Uma vez que mais de 250 alvos pode ser detectado em simultâneo, é possível medir as respostas de CTL e de T H contra muitos grupos de células alvo pulsadas com npeptídeos umerous em diferentes concentrações ea inclusão de muitas repetições. Por isso, o ensaio FTA fornece um nível sem precedentes de avaliação da resposta das células T efetoras in vivo.

Aqui, descrevemos em pormenor a construção de um FTA e mostram como podem ser aplicados para avaliar as respostas de células T in vivo. O processo descreve a construção de um FTA composta de 252 agrupamentos de células discerníveis por meio da utilização de três corantes vitais, composta de seis repetições de 42 conjuntos de células pulsadas com o MHC de classe I e II, os péptidos de ligação. A rotulagem de 42 conjuntos de células ocorre em 10 ml de fundo cónico de tubos e que é útil para colocar estes em um suporte para tubos, conforme ilustrado na Tabela 1. Esse método pode ser ajustado para um número menor de aglomerados discerníveis como requerido ao reduzir a quantidade de rotulagem de cada corante realizada 1.

Destaca-se a utilidade do ensaio, mostrando como ele pode medir responses geradas pela vacinação pox-vírus recombinante contra múltiplos epitopos em um pequeno grupo de ratos. Isto mostra como o ensaio de TLC pode ser usado para medir as respostas cumulativas e avidez funcional através de, respectivamente, o uso da área sob a curva (AUC) de avaliações e medições da concentração de péptido eficaz necessária para produzir respostas máximas metade (EC 50).

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Protocol

Nota: Os ratos utilizados no âmbito deste protocolo foram manipulados de acordo com as orientações do Comitê de Australian National University Experimentação Animal Ética e ratos foram sacrificados por deslocamento cervical.

1. Dye e Peptide Preparação

  1. Preparação de corante
    Nota: Os corantes são pré-diluído em diferentes concentrações para permitir marcação das células com intensidade de fluorescência discretas. CFSE é usado em sete concentrações feitas através de diluições em série de 3,5 vezes, e CTV e CPD são usados ​​em seis concentrações diferentes feitos por meio de diluições em série de 3,7 vezes (ver Tabelas 2-4). As concentrações de estoque de corantes listados nas Tabelas 2-4 será usado para marcar as células-alvo para as concentrações finais de corantes listados nas Tabelas 2-4. Corantes reagir após a exposição à solução aquosa. Por conseguinte, é importante que os frascos ser equilibrada para a temperatura ambiente antes de abrir a minimizar a exposição de corantes para a condensação.
    1. CFSE
      Nota: CFSE é adquirido como éster diacetato de carboxifluoresceína succinimidilo (CFDA, SE; MW 557,47), tipicamente em 25 mg / frasco.
      1. Ressuspender 25 mg de CFSE em 4,48 mL de DMSO para se obter uma solução de estoque de 10 mM.
      2. Diluir em série CFSE: Adicionar 35 ul de 10 mM de estoque CFSE em 87,5 mL de DMSO e repetir esta com solução de estoque diluído para dar a cada concentração do corante na Tabela 3.
    2. CTV
      Nota: CTV é tipicamente adquirido em embalagens de nove frascos, cada um dos quais pode ser reconstituído com 10 ul de DMSO para gerar uma solução 10 mM do corante.
      1. Reconstituir e reunir todos os 9 frascos de CTV com 90 mL de DMSO para dar uma solução a 10 mM.
      2. Diluir em série CTV: Adicionar 11 mL de 10 mM em estoque CTV 29,7 mL de DMSO e repetir isso com solução estoque diluída para dar a cada concentração de corante na Tabela 2.
    3. CPD
      Nota: CPD (MW 792,6) é típicoly comprado como 0,5 mg / frasco.
      1. Ressuspender 0,5 mg de CPD, em 63 ml de DMSO para obter uma solução 10 mM.
      2. Diluir em série DPC: ​​Adicionar 11 ul de 10 mM de estoque de CPD em 29,7 mL de DMSO e repetir esta com solução de estoque diluído para dar a cada concentração do corante na Tabela 4.
        Nota: Os estoques de corante pode ser armazenada a -20 ° C durante vários meses e pode ser descongelada e refrozen várias vezes sem perda significativa da função.
  2. Preparação peptídica
    Nota: os péptidos do MHC de classe I de ligação são geralmente utilizados para pulsar as células alvo em seis concentrações diferentes realizados utilizando 10 diluições a partir de uma concentração inicial de 1 uM (Tabela 5). De MHC de classe II de ligação de peptídeos são geralmente utilizados para pulsar as células alvo em seis concentrações diferentes feito utilizando três diluições a partir de uma concentração inicial de 400 uM (Tabela 5). Cada péptido é efectuada a concentração final de 2 x em PBS tal that cada concentração de péptido tem um volume mínimo de 250 ul. Estoques peptídicas podem ser preparadas antes de TLC construção e armazenado a -20 ° C sem perda significativa da função.
    1. Peptídeos estoque Preparando MHC classe I de ligação
    2. Prepare a maior concentração de cada péptido epitopo a 2 soluções de uM (2x 1 uM)
    3. Diluir em série de MHC-I peptídeos de ligação de classe: adicionar 44,4 mL de solução estoque 2 mM peptídeo em 400 mL de PBS. Repetir este com uma solução de estoque diluído para dar a cada concentração de péptido na Tabela 5.
    4. Peptídeos estoque Preparando MHC classe II de ligação
    5. Prepare a maior concentração de cada péptido epitopo a 800 uM soluções stock (2x 400 uM).
    6. Diluir em série péptidos de classe II-ligação do CPH: adicionar 150 uL de solução de 800 uM de péptido em 300 ul de PBS. Repetir este com uma solução de estoque diluído para dar a cada concentração de péptido na Tabela 5

2. FTA Preparação

Nota: O procedimento seguinte descreve a construção de um composto de TLC células pulsadas com 7 diferentes epitopos peptídicos a 6 concentrações diferentes (ou seja, 42 grupos de células.) Repetida 6 vezes para gerar 252 conjuntos de células discerníveis. Dentro de cada repetição, um grupo de células não pulsadas com qualquer epitopo (zero), é incluída como um controlo. É útil para TLCs ter uma diferença de CD45 alotipo de animais hospedeiros para permitir a sua discriminação de células recipientes por rotulagem de anticorpos no momento da análise. Caso contrário ACL pode ser marcado com outros corantes, tais como PKH-26, para este fim (descrito no passo 2.6). Normalmente, o procedimento de preparação da FTA é realizado do início ao fim durante uma sessão.

  1. Rótulo 42, 10 ml de fundo cónico de tubos de plástico 1-42 (como na Tabela 1, por exemplo).
  2. Preparação de células
    1. Isolar baço e / ou LINFhnodes de ratinhos. Prepare suspensão única célula de tecidos por esmagou através de 70 mM debruçaram crivo com 5 ml êmbolo da seringa e contagem de células usando um hemocitômetro.
    2. Ressuspender linfócitos em até 200 x 10 6 células / ml em 11,5 ml de Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI, ou equivalente), contendo 5% de soro fetal de vitelo (FCS). Nota: É importante a utilização de um tampão com elevado teor de amina para minimizar a toxicidade do corante para as células 3.
  3. Rotulagem CTV
    Nota: As células são inicialmente marcado com 6 concentrações de CTV.
    1. Completamente ressuspender as células invertendo o tubo várias vezes. Adicionar 1,9 ml de suspensão de células a 6 dos tubos de 10 ml rotulados 37-42, tomando cuidado para não molhar a metade superior dos tubos.
    2. Para identificar as células com CTV, retire a tampa do tubo e colocar o tubo horizontalmente.
    3. Adicionar 83 ul de PBS, para a porção não molhado na parte superior do tubo, e para isso adiciona 17 ul de estoque CTV (ver Table 2 para a qual solução estoque é atribuído a qual tubo). Nota: Um tubo não humedecida é importante para evitar o movimento de suspensão de células e mistura prematura da solução de células com a solução de corante.
    4. Tapar o tubo e misturar a suspensão de células com o corante rapidamente e completamente em vortex.
    5. Repetir passos 2.3.2-2.3.4 para as soluções estoque de CTV nos tubos designados descritos na Tabela 2.
    6. Incubar as células por um período mínimo de 5 min à temperatura ambiente (20 ° C).
  4. Rotulagem CFSE
    1. Após marcação CTV, adicionam-se 5 ml de meio RPMI contendo 5% de FCS a cada tubo e completamente ressuspender as células por centrifugação.
      1. A partir do tubo 37 de transferência de 1 ml de suspensão de células para tubos de 31, 25, 19, 13, 7, e 1.
      2. A partir do tubo 38 de transferência de 1 ml de suspensão de células para tubos de 32, 26, 20, 14, 8 e 2.
      3. A partir do tubo 39 de transferência de 1 ml de suspensão de células para tubos de 33, 27, 21, 15, 9 e 3.
      4. A partir de tubo de 40 ml de uma transferência de célulasuspensão para tubos de 34, 28, 22, 16, 10 e 4.
      5. A partir do tubo 41 de transferência de 1 ml de suspensão de células para tubos de 35, 29, 23, 17, 11, e 5.
      6. Do tubo de 42 transferências 1 ml de suspensão de células para tubos de 36, 30, 24, 18, 12 e 6
        Nota: Tenha cuidado para não molhar a metade superior dos tubos durante as etapas 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. Para identificar as células com CFSE, retire a tampa do tubo e colocar o tubo horizontalmente.
    3. Adicionar 103 ml de PBS para a porção não molhado no topo do tubo, e para este adicionar 7 ml de estoque de CFSE (ver Tabela 3 para o qual a solução estoque é atribuído ao qual tubo).
    4. Tapar o tubo e misturar a suspensão de células com o corante rapidamente e completamente em vortex.
    5. Do passos 2.4.2-2.4.4 para as soluções estoque de CFSE nos tubos designados descritos na Tabela 3.
    6. Incubar as células por um período mínimo de 5 min à temperatura ambiente (20 ° C).
    7. Lavar as células: Diluir a suspensão de células com 9 ml de 20 ° CRPMI contendo 5% de FCS, de sedimento por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 20 ° C e remover os sobrenadantes por aspiração com uma pipeta.
  5. Pulsante Peptide e lavagem celular
    Nota: Após as células foram marcadas com CFSE e CTV, eles são pulsadas com MHC de classe I e / ou MHC de classe II, os péptidos de ligação (1,2) em preparados. Uma das populações de células não devem também ser pulsadas com péptido (p. ex. Nil na Tabela 1) e utilizado como um controlo negativo para o cálculo de respostas de células T.
    1. Peptide pulsante
      1. Ressuspender as células em um volume total de 250 ul de RPMI contendo FCS a 5%. Nota: Tipicamente 50 ul de suspensão de célula permanece após a aspiração do sobrenadante, no final do passo 2.4.7, portanto, adicionar 200 mL de meio de sedimento celular.
      2. Adicionar 250 uL de unidades de péptido pré preparados (como na Tabela 5), para os tubos apropriadamente designada (como na Tabela 1) e ser sure para incluir um tubo de controle adicionado PBS sozinho sem peptídeo como um controle de Nil.
      3. Misture suspensões de células com um vórtice. Nota: É crítico que cada um péptido epitopo e cada concentração de péptido é atribuído a um único tubo e este registada claramente com base na fluorescência esperado das células deste tubo, uma vez que a assinatura de fluorescência deste conjunto irá definir este péptido (como na Tabela 1, por exemplo).
      4. Incubar as células a 37 ° C durante 1 hora.
    2. Lavagem celular
      1. Adicionar 5 mL de gelo frio (4 ° C), meio RPMI contendo 5% de FCS para a suspensão de células e ressuspender as células por inversão do tubo. Underlay cuidadosamente a suspensão de células com 3 ml de gelo frio (4 ° C) de FCS.
      2. Sedimentar as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Use aceleração lenta e de travagem para garantir a interface de FCS e a solução de suspensão de células é mantida.
      3. Aspirar cuidadosamente a RPMI e depoisos FCS com uma pipeta de transferência, deixando as pelotas de células lavadas imperturbável. Nota: O uso de um forro de FCS para lavar as células ajuda a assegurar uma solução de péptido tanto é removida das células quanto possível, e limitando assim a exposição de populações de células em vários péptidos livres, quando as células são reunidas.
      4. Lavar as células novamente: Ressuspender as pelotas de células em 10 ml de 4 ° C de RPMI contendo 5% de FCS. Sedimentar as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Deitar fora sobrenadantes.
      5. Piscina todas as populações de células em um único tubo com uma pipeta com 6 ml de 4 ° C RPMI contendo 5% de FCS. O sedimento de células reunidas por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de transferência.
  6. Rotulagem celular CPD
    Nota: Neste ponto seis repetições do ensaio intra podem ser gerados por células pulsadas marcação de péptidos com seis concentrações diferentes de CPD.
    1. Adicionar 11,4 ml de 20 ° CRPMI contendo 5% de FCS para a pelete de células reunidas e ressuspender cuidadosamente usando uma pipeta.
    2. Adicionar 1,9 ml de suspensão de células de 6, 10 mL de tubos marcados AF, tendo o cuidado para não molhar a metade superior dos tubos.
    3. Para identificar as células com CPD, retire a tampa do tubo e colocar o tubo horizontalmente.
    4. Adicionar 92 ul de PBS, para a porção não molhado na parte superior do tubo, e para isso adiciona estoque CPD (ver Tabela 4 para a quantidade de solução de estoque atribuído a cada tubo).
    5. Tapar o tubo e misturar a suspensão de células com o corante rapidamente e completamente em vortex.
    6. Não etapas. 2.6.3-2.6.5 para as soluções estoque de CPD nos tubos designados descritos na Tabela 4 Nota: Ao contrário CFSE e CTV, a concentração de rotulagem CPD não é precisamente linearmente relacionado com a intensidade de fluorescência resultante de células marcadas, e de modo que a concentração de rotulagem utilizado para obter picos fluorescentes equidistantes de várias populações marcadas foideterminado empiricamente (ver Tabela 4).
    7. Incubar as células por um período mínimo de 5 min à temperatura ambiente (20 ° C).
    8. Lave as células duas vezes: Suspenda as células para 10 ml com 20 ° C RPMI contendo 5% de FCS. Sedimentar as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 20 ° C. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de transferência. Repetir.
    9. Piscina todas as células em um único tubo usando 8 ml 4 ° C RPMI contendo 5% de FCS com uma pipeta. O sedimento de células reunidas por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante com uma pipeta de transferência.
  7. (Opcional) rotulagem celular PKH-26
    Nota: Se TLCs não pode ser construído com células que expressam uma diferença alotípico CD45 para acolher os ratos, que podem ser marcados com PKH-26, para permitir a sua capacidade de discriminação de células receptoras.
    1. Adicionar 2,9 ml de 20 ° C de PBS para o sedimento de células em pool e ressuspender cuidadosamente com uma pipeta.
    2. Adicionar a suspensão de células para um nãon molhado 10 ml tubo, tomando cuidado para não molhar a metade superior do tubo.
    3. Retire a tampa do tubo e colocar o tubo horizontalmente.
    4. Adicionar 58 ul de diluente C (no kit corante PKH-26) para a porção não molhado na parte superior do tubo, e para isso adiciona 42 ul de estoque 1 mM PKH-26.
    5. Tapar o tubo e misturar a solução de células com o corante completamente em vortex.
    6. Incubar as células por um período mínimo de 10 min à temperatura ambiente (20 ° C).
    7. Lave as células duas vezes: Suspenda as células para 10 ml com 20 ° C RPMI contendo 5% de FCS. Sedimentar as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 20 ° C. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de transferência. Repetir.
  8. Injetando ALCs em animais hospedeiros
    Nota: Para medir as respostas das células T in vivo, ACL são injectadas em animais que têm uma resposta imunitária activa e deixados no local durante até 24 horas. É fundamental que os acordos de livre comércio também são injetadas em um animal ingênuo como controle negativo.
    1. Contagem e ressuspender as células em 2,5 x 10 8 culas por mL em PBS. Injectar 200 ul de células por via intravenosa em ratinhos hospedeiros, incluindo um animal ingénuo como um controlo.

3. Citometria de Fluxo

  1. 18-24 horas após a injeção FTA colheita de sangue ou do baço (ou outros tecidos de interesse) de camundongos hospedeiros.
  2. Prepare suspensão única célula de tecidos por triturar através de uma peneira de 70 mM debruçaram com 5 ml êmbolo da seringa.
  3. Ressuspender as células em até 65 x 10 6 células / ml em PBS contendo 0,1% de BSA.
  4. Distribuir aliquotas de 100 ul de suspensão de células em cavidades de uma placa de microtitulação para marcação de anticorpos.
  5. Células etiqueta com anticorpos fluorocromo rotulado e sondas fluorescentes de viabilidade com fluorescência espectro compatível com CFSE, CTV e CPD. Nota: Os anticorpos para marcadores de células B, como B220 e marcadores de ativação, como a CD69 são essenciais para medir a ativação de células B se estiver usando o FTUm para medir as respostas de células T H 2. Incluir um anticorpo para CD45.1 e / ou CD45.2 se os acordos de livre comércio e camundongos de acolhimento têm uma diferença alotípico CD45.
  6. Adicionar 100 ul de solução de estoque de corantes de anticorpos 2x / viabilidade (em PBS contendo BSA a 0,1%) para 100 mL alíquotas de células, misturar bem e incubar em gelo (4 ° C) durante 30 min.
  7. Lavar as células: células de sedimento por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 200 ul de PBS contendo BSA a 0,1%, as células de sedimento por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.
  8. Suspenda as células num volume total de 400 ul de PBS contendo BSA a 0,1%, as células através de um filtro de malha de 70 ^ m e analisam por citometria de fluxo num citómetro de fluxo capaz de detectar os corantes e os conjugados fluorescentes relevantes. Obter até 3 x 10 6 eventos de linfócitos, a fim de resolver cada cluster célula FTA e ganhar células suficientes para estatísticaanálise cal. Nota: Certifique-se de todos os controles típicos (como controles manchadas de solteiro) para citometria de fluxo são empregadas. Normalmente, CFSE requer excitação de uma fonte de laser azul (normalmente a 488 nm) e detecção com filtros passa banda centrado mais de 520 nm; CTV requer excitação de uma fonte de laser violeta (normalmente a 405 nm) e detecção com filtros passa banda centrado mais de 450 nm; e CPD requer excitação de uma fonte de laser vermelho (normalmente a 633 nm ou 640 nm) e detecção com filtros passa banda centrado mais de 670 nm.

4. Análise de Dados

  1. Analisar dados de citometria de fluxo, utilizando software citometria de fluxo padrão (ver resultado representativo para um exemplo do tipo de estratégia de gating empregados).
  2. Para matar específica%, calcular o número de células em cada grupo de células FTA pulsava com MHC-I peptídeos de ligação de classe e os clusters FTA que não foram peptídeo pulsado ("Zero") e usando a seguinte fórmula para calcular% Killing específica.
    % Killing Specific Fórmula
    Nota: Na fórmula acima "preparado" refere-se às metas de animais que são pensados ​​para ter uma resposta imune contra os peptídeos-alvo, "ingênuo" refere-se às metas de animais ingênuos, "peptídeo" refere-se a alvos pulsadas com peptídeos e "nulo" refere-se a metas não pulsadas com quaisquer peptídeos.
  3. Para a activação de células B, tal como uma medida da actividade da H T, calcular a média geométrica da intensidade de fluorescência (GMFI) de CD69 de anticorpo de fluorescência em células B pulsadas com TLC péptidos de MHC de classe II-ligação nos animais "activadas" e a partir deste o subtrair de GMFI expressão de CD69 nas células correspondentes FTA B em animais "ingênua" para dar uma medida da atividade H T.
  4. A partir das estatísticas geradas nos passos 4.2 e 4.3, de usosoftware de planilha matemática como GraphPad Prism para calcular outros parâmetros quantitativos e qualitativos, tais como área sob a curva e EC 50 (uma descrição detalhada de como esses cálculos são realizados para a AUC pode ser encontrada em
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, e por CE50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

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Representative Results

Como um exemplo da utilização do ensaio de TLC, um ratinho BALB / c foi imunizado com vírus vaccinia recombinante (VV) expressando epítopos de HIV-I (VV-HIV) e as respostas aos epítopos de CTL de VIH-I, Gag, mut Gag Env e Pol, o VV epitopos CTL F2L e F2L mut, e o epitopo de célula T de HIV-I H, Gag Th (tal como descrito em 2) foram avaliados utilizando um ensaio de TLC parâmetro 252 (Figura 1B). Variantes de epitopos de mordaça (mut Gag) e F2L (F2L mut) não são expressos no vector VV-HIV e, portanto, respostas contra estes epitopos são um reflexo de epitopo variante transversais respostas de células T reactivas. Camundongos normais foram também injectados com o TLC como um controlo negativo. O TLC foi discriminado a partir de células de rato hospedeiro por PKH-26 de rotulagem e as células B FTA discriminados pelo anticorpo coloração B220 via citometria de fluxo (Figuras 1A e 1B). Cada uma das 6 réplicas animais intra foi fechado com base na DPC fluorescência (Figura 1C (Figura 1D). % Killing específica de cada repetição foi avaliada comparando FTA morte celular aglomerado em animais imunizados em relação ao correspondente aglomerados FTA em animais ingênuos (Figura 1D). Atividade H T foi avaliada comparando FTA B regulação positiva de células de CD69 em animais imunizados em relação aos grupos de células B FTA em animais ingênuos (Figura 1E) correspondente.

A partir desta análise, a infecção por HIV-VV geraram respostas fortes de CTL contra o epitopo imunodominante F2L VV, com 100% das células alvo pulsadas com o FTA 0,001 mM ou mais do epitopo a ser removido a partir do baço (Figura 2A). Houve também uma forte resposta gerada contra a variante de F2L, F2L mut, com 100% das células alvo pulsadas com o FTA 0,01 mM ou mais de epitopo a ser removido a partir do baço. DesdeF2L mut não está presente no vírus infectante, esta resposta indica uma resposta cruzada reactivo variante epitopo. Houve também uma resposta relativamente moderada gerado contra alvos que expressam o epitopo HIV Gag e uma ligeira resposta cruzada contra a forma variante deste epitopo, HIV Gag mut. Pareceu haver respostas insignificantes gerados para os epitopos do HIV Pol e Env do HIV CTL.

Além de respostas de CTL, o ensaio de TLC exemplo mostrado também mediram as respostas H T avaliando a activação de células B expressando TLC o epitopo de classe II de ligação ao MHC de HIV HIV Gag Th (Figura 2B). Isso mostrou ocorreu a ativação de células B antígeno específico em animais imunizados, sugerindo geração de HIV Gag efetores Th específicos de células T H.

Estas medidas de intensidade de resposta de células T podem ser resumidos pela área sob os valores da curva (AUC) para a geração de cada um dos epitopos (Figura 2C), que meamede a magnitude da resposta cumulativa.

Além disso a magnitude das respostas de reactividade cruzada e de variantes específicas de epítopo do antigénio, o ensaio de TLC permite medições de avidez funcional a ser feito. Por exemplo, as concentrações de péptido eficazes utilizados para pulsar as células alvo FTA necessários para dar as respostas máximas metade (EC 50), é mostrado para os efectores de CTL (Figura 2D). Isso mostrou a avidez funcional para o epítopos mut F2L, HIV Gag e Gag do HIV mut, foram, aproximadamente, 10, 100 e 4000 vezes mais baixa, respectivamente, do que as respostas geradas para o F2L VV epitopo dominante.

Tabela 1
Tabela 1. Layout de um layout de 252 parâmetro FTA. Típica de uma réplica de um 252 FTA composta de 42 amostras / tubos pulsadas com 7 diferentes epítopos peptídicos às 6 diferencialconcentrações t e incluindo uma pulsada (Nil) amostra un. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Número de metro Volume (uL) Estoque Dye (CTV mM) A concentração final (M)
37 0 0 0
38 17 0,053 0,451
39 17 0,197 1,48
40 17 0,73 6.21
41 17 2,7 23
42 17 10 85

Estoques CTV Tabela 2. Usado para rotular células. Volume de listadoEstoque CTV usado para marcar as células de 2 ml para dar a concentração final de corante de rotulagem.

Número de metro Volume (uL) Estoque Dye (CFSE mM) A concentração final (M)
37-42 0 0 0
31-36 7 0,022 0,139
25 - 30 7 0,078 0,492
19-24 7 0,23 1.45
13-18 7 0,82 5.17
7 - 12 7 2,9 18,3
1-6 7 10 63,1

Estoques CFSE Tabela 3. Usado para rotular células. Volume de estoque CFSE listados nosed para marcar as células em 1,11 ml para dar a concentração final de corante de rotulagem.

Número de metro Volume (uL) Estoque Dye (CPD mM) A concentração final (M)
A 0 0 0
B 4 0,053 0,106
C 6.3 0,197 0,62
D 7.5 0,73 2.74
E 7.3 2,7 9.86
F 7.7 10 38,5

Estoques CPD Tabela 4. Usado para marcar as células. Volume de estoque CPD listados utilizado para células em 2 ml de etiquetas para dar o Labelin definitivog concentração de corante.

Concentração de péptido (^ M)
Peptídeos MHC classe de ligação I 0 0,00002 0,0002 0.002 0,012 0,2 2
De MHC de classe II de ligação de péptidos 0 3.29 9.88 29,6 88,9 266 800

Tabela 5. Classe MHC I e II vinculativos concentrações de ações peptídicas. Concentrações de ações típicas 1 de epítopos peptídicos usados ​​para construir um FTA 1. Estas concentrações são 2x as concentrações finais utilizados para pulsar as células alvo.

Figura 1 Fluxo Figura 1. Típica análise de citometria de ACL. Esplenócitos de ratinhos BALB / c foram utilizados para construir um parâmetro 252 TLC como descrito no texto. Aglomerados FTA foram pulsadas com seis concentrações (como listado na Tabela 5) de 7 epitopos virais diferentes, incluindo os epítopos de MHC classe I de ligação, F2L (SPYAAGYDL, uma L-restritos d vírus vaccinia (VV) epitopo); F2L mut (SP G AAGYDL, uma variante do F2L), Mordaça (AMQMLKETI, um K restrição d HIV Gag epitopo 4), mut Gag (AMQMLK D TI, uma variante do HIV Gag 5), Pol (VGPTPVNII, uma D d -restrito pol epitopo HIV 6), Env (RGPGRAFVTI, uma D-d restrito HIV env epitopo 7); eo MHC classe II de ligação peptídeo Gag T H (PVGEIYKRWIILGLN, um H-2 restringe-d HIV Gag epitopo 4). ALCs foram injetados iv. num ratinho BALB / c que tinham sido infectados intranasalmente (in.) 6 dias mais cedo com recombinant VV expressando epítopos de HIV (VV-HIV, em animais sensibilizados). O TLC também foi injectado em ratinhos naive como controlo. Depois de 18 horas in vivo, as células FTA presentes em suspensões esplenócitos de camundongos hospedeiros foram analisadas por citometria de fluxo. A) estratégia de propagação progressiva típica para identificar as células FTA mostrando portões para linfócitos, camisolas interiores e PKH-26 + células FTA (ele também é útil para resolver células vivas usando um corante de viabilidade como Hoechst 33258, não apresentado). B) enredo 3D mostrando todos os clusters FTA de rato anfitrião ingênuo. c) parcelas histograma mostrando FTA CPD fluorescência marcando cada um dos 6 animais intra replica. D) parcelas 2D mostrando um da célula 6 intra-animais TLC B replica apresentando os diferentes tipos e concentrações de epítopos a partir de animais ingénuos e activadas. Isso mostra a ausência de células FTA no animal ferrado relativa ao animal ingênuo, revelando "matar eventos"por CTLs que formam a base da E) análise TLC matando ensaio 1. Histograma de expressão de células de TLC B do marcador de activação CD69 em animais imunizados em relação aos animais ingénuo, que forma a base do ensaio de TLC ajudante T 2. favor aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. TLCs permitir a medição da magnitude e avidez das respostas das células T in vivo. Um parâmetro 252 TLC foi utilizado para avaliar as respostas de células T em murganhos infectados com VV-VIH, tal como descrito na Figura 1. UM)% de morte especifica foi calculada para todos os epitopos de CTL e os resultados de cada uma das seis replicates mostrados (painel da esquerda), bem como meios e erros padrão das médias (painel da direita) mostrado. B) resposta H T foi avaliada medindo a activação de células B TLC apresentando o epitopo de HIV Gag Th para cada uma das 6 réplicas animais intra ( painel da esquerda) e os meios e erros padrão das médias (painel da direita) calculado. c) AUC de morte especifica% (a), e as respostas das T auxiliares (b) foi calculado como uma medida da magnitude cumulativa. D) EC 50 medidas foram calculados para% dados matar específicas (a) como medida de avidez funcional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A vantagem de ensaios baseados em TLC é que eles permitem a discriminação de> 250 populações de células alvo viável e completamente funcional a partir de um único animal hospedeiro por citometria de fluxo. Isso proporciona um nível de complexidade para in vivo fluem ensaios baseados citometria de que não foi possível antes. Isto é realçado nas duas experiências com animais mostradas acima, em que as respostas aos epítopos virais 7 distintas em 6 concentrações poderiam ser monitorizadas em replicados de 6, simultaneamente, num único animal permitindo que os parâmetros tais como a AUC e EC 50 para ser determinada para as respostas de células T in vivo .

Além de medir as respostas das células T in vivo, os ensaios baseados em TLC pode ser modificada para medir as respostas in vitro 1. Isto essencialmente envolve a adição de FTAs às células T em cultura para medir as respostas ao longo de várias horas in vitro. Uma limitação potencial em ensaios baseados em vitro utilizando FTAs é tele tendência para as células marcadas dentro do FTA para transferir o corante rotulagem para células vizinhas 1, 3. Isso pode resultar numa diminuição da resolução de cachos de células FTA como sua fluorescência torna-se menos distintas entre cada população. Isto é mais aparente em ensaios in vitro, em comparação com ensaios in vivo, porque as células estão em estreita proximidade para os longos períodos de tempo em ensaios in vitro. Esta perda de resolução de populações de células FTA pode ser minimizada em ensaios in vitro, através da redução do tempo de cultura de células T com TLCs efectoras e usando TLCs que têm uma menor população de células alvo que possuem uma maior quantidade de "espaço fluorescente" entre eles de modo que a transferência de corante tem menos impacto.

Também notaram perda de resolução de populações de células FTA quando ALCs foram colocadas in vivo por 48 horas 1. Isto parece ser o resultado de células alvo B no prolife TLCclassificação e reduzindo, assim, a intensidade de fluorescência do corante. Isto é provavelmente um resultado de células B que apresentam o antigénio cognato para efectoras específicas de antigénio de células T CD4 +, que resultaram na estimulação das células B. Por conseguinte, recomenda-se que o ensaio de ser limitada a ~ 24 horas ou menos, quando os alvos de células B estão a ser monitorizados.

A capacidade de rotular várias (> 96) grupos de células únicas fluorescente foi relatado anteriormente o uso de células não viáveis ​​fixas 8. A coloração das células vivas, no entanto, tem sido mais problemática com a disponibilidade de corantes vitais compatíveis, e apenas 8-12 células viáveis ​​aglomerados foi conseguido anteriormente 9. A capacidade de gerar> 250 unicamente marcados com fluorescência de células viáveis ​​e funcionamento aqui relatados, baseia-se nas propriedades de CFSE como corantes vitais. Vários desses corantes, como o CTV e CPD, apenas recentemente se tornaram disponíveis. Estes corantes têm as características de ser capaz demarcação das células com uma alta intensidade de fluorescência, que é de longa vida e de baixa variação 3. Estas propriedades, juntamente com o facto de que existe uma relação linear (em particular no caso de CFSE e CTV) entre a concentração do corante utilizado para a rotulagem e a intensidade da fluorescência das células marcadas, significa que as células podem ser marcadas com vários (se a 7 mostrado aqui) intensidades de cada tipo de corante que pode ser facilmente distinguido por citometria de fluxo. Além disso, uma vez que a emissão de fluorescência de CFSE, CPD e CTV ter uma sobreposição espectral mínima, podem ser utilizados em combinação para identificar células, permitindo, assim, até> 250 assinaturas de células fluorescentes para ser detectada por citometria de fluxo. Deve notar-se que, a fim de alcançar a marcação das células com este número de assinaturas fluorescentes discernível, é importante que a marcação das células é realizada rapidamente 10, 11 (para gerar baixa variação da fluorescência) e num tampão apropriado contendoaminas livres 3 (para tamponar a toxicidade do corante que de outro modo pode ocorrer com estas tintas em altas concentrações). Também é fundamental que durante a aquisição de ACL por citometria de fluxo que as flutuações errôneas em evento de fluorescência são monitorados (por exemplo através da medição CFSE, CTV e / ou CPD intensidade de fluorescência ao longo do tempo). Isto é importante porque essas flutuações evento fluorescência que são devido a máquina apresentou erros podem resultar em má interpretação correta posicionamento do conjunto célula-alvo que por sua vez pode resultar em erros nas medidas finais da T efetoras função celular. Tal citómetro erros introduzidos pode ser limitado, assegurando amostras de alta qualidade são preparados (especialmente prestando atenção para filtrar as células através de uma malha de 70 um para minimizar a obstrução das linhas de fluidos no citómetro de fluxo por grandes agregados de células) e que o citómetro de fluxo é mantida a alto padrão.

Medição das respostas de células T in vivofoi realizado durante muitos anos utilizando corantes vitais, tais como CFSE para monitorar a morte as células alvo in vivo 12. Normalmente estes ensaios, no entanto, só foram capazes de monitorar até 7-8 células-alvo diferentes de uma só vez 13 e assim fornecer uma capacidade limitada para avaliar assassinato de alvos que expressam várias concentrações de múltiplos epitopos que são normalmente necessários para gerar uma avaliação detalhada dos parâmetros como a avidez funcional de respostas de células T. A este respeito, os ensaios de tetrâmero de dissociação pode ser usado para fornecer uma medida de T avidez células isoladas de fresco a partir de células T efectoras 14-16. Esta técnica, no entanto, mede MHC / TCR avidez de ligação, e por isso não é uma reflexão completa de avidez funcional, que também pode depender de mudanças na estrutura da sinapse imunológica eo estado de células T sinalização componentes 17. Portanto, idealmente, a avidez funcional requer experiências de dose-resposta para ser executada. Estefoi realizado anteriormente utilizando técnicas in vitro tais como o ensaio de 51 Cr de libertação, o ensaio de coloração de citocinas intracelulares 18, 19 ou o ensaio ELISPOT 20, 21. Estas técnicas, no entanto, muitas vezes requerem que as células T efectoras de ser estimuladas in vitro, o que pode alterar a avidez funcional global da população 22. Os ensaios de TLC, por isso, apresenta uma melhoria em relação às técnicas existentes, medindo células T CD4 + e CD8 + T célula dose-resposta in situ, em tempo real contra múltiplos epitopos em simultâneo, e proporcionando assim uma adição valiosa às técnicas existentes para medir a célula T função efetora. Prevemos que o uso de tecnologia de TLC pode tornar-se útil em estratégias de imunoterapia de rastreio concebidos para gerar respostas de alta qualidade de células T, tais como as vacinas dirigidas contra o HIV-1 e hepatite C.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subsídios do projeto # 1010395 (BQ e PB) e # 525431 (CR), e um Programa de Grant # 455395 (CP) do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália, um Centro Australiano para Hepatite e HIV Virologia EOI 2012 bolsa (CR e RJJ) e uma bolsa da Fundação Bootes Gordon and Gretel (BQ e CR). Queremos agradecer Harpreet Vohra e Michael Devoy por sua excelente manutenção do laboratório JCSMR FACS, a Facilidade Australian Cancer Research Foundation Biomolecular Resource, JCSMR, ANU, para síntese de peptídeos, e Dr. David Boyle, CSIRO Animais Laboratórios de Saúde, Geelong, Austrália por fornecer os estoques de vacinas HIV pais.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Sigma R8758
Fetal calf serum Serana FCS-500
CTV Invitrogen C34557
CFDA, SE Invitrogen C1157
CPD eBioscience 65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5 eBioscience 110730
anti-CD69 brilliant violet 605 Biolegend 104529
PKH-26 Sigma PKH26GL-1KT
Vortex Scientific Industries Inc
Centrifuge Eppendorf
Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) BD Bioscience

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References

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Imunologia Edição 88 Técnicas de Pesquisa a resposta das células T Citometria de Fluxo Multi ensaio CTL Éster succinimidyl carboxifluoresceína (CFSE) CellTrace Violet (CTV) Cell Proliferação Dye eFluor 670 (CPD)
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