Summary
Introductie van kleine moleculen de ontwikkeling Drosophila embryo grote mogelijkheden voor het karakteriseren van biologische activiteit van nieuwe verbindingen, geneesmiddelen en toxinen en het tasten fundamentele ontwikkelingspaden. Werkwijzen hierin beschreven schetsen stappen natuurlijke barrières deze benadering overwonnen, het uitbreiden van de bruikbaarheid van de Drosophila embryo model.
Abstract
De Drosophila embryo is al lange tijd een krachtige laboratorium model voor het ophelderen van de moleculaire en genetische mechanismen die ontwikkeling te bepalen. Het gemak van genetische manipulatie met dit model farmacologische benaderingen die gemeengoed zijn in andere diermodellen en cel-gebaseerde testen verdrongen. Hier beschrijven we de recente ontwikkelingen in een protocol dat de toepassing van kleine moleculen in staat stelt om de zich ontwikkelende fruitvlieg embryo. De methode Gegevens stappen om de ondoordringbaarheid van de eierschaal weg te werken en levensvatbaarheid van het embryo. Eierschaal permeabilisatie in een breed scala van ontwikkelingsstadia wordt bereikt door toepassing van een eerder beschreven d-limoneen embryo permeabilisatie oplosmiddel (EPS 1) en door veroudering embryo's bij verlaagde temperatuur (18 ° C) voorafgaand aan behandelingen. Bovendien wordt het gebruik van een ver-rode kleurstof (CY5) als indicator permeabilisatie beschreven die geschikt downstream toepassingen waarbij standaard rode en groene grieporescent kleurstoffen in levende en vaste preparaten. Dit protocol is van toepassing op studies met bioactieve verbindingen ontwikkelingsmechanismen sonde en voor studies ter evaluatie teratogene of farmacologische activiteit van ongekarakteriseerde kleine moleculen.
Introduction
De Drosophila embryo blijft een van de beste model voor onderzoek naar de fundamentele mechanismen van ontwikkeling 2 zijn. Deze krachtige model wordt ondersteund door een breed scala van moleculair genetische tools die manipulaties van in wezen elk gen toestaan op elk tijdstip en op elke ontwikkelen orgel. Het kleine formaat, snelle ontwikkeling, en uitgebreide karakterisering van morfogenese van de Drosophila embryo maken het een model van de keuze voor genetische screens, waarvan vele hebben blootgelegd fundamentele ontwikkelingstrajecten 3,4. Talrijke fenotypen in de Drosophila embryo zijn gekarakteriseerd en zijn gemakkelijk te interpreteren, vaak een middel om onderliggende moleculaire genetische mechanismen verantwoordelijk voor een abnormale eigenschap te identificeren.
Historisch gezien is een tekortkoming van de vlieg embryo model de moeilijkheid van de invoering van kleine moleculen om embryoweefsel geweest. Deze hindernis heeft beperkingen gesteld op: 1) using bekende bioactieve kleine moleculen als probes voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen ondervragen en 2) het gebruik van dit model vastgesteld op teratogene of farmacologische activiteit van ongekarakteriseerde kleine moleculen te evalueren. Bijgevolg heeft de screening mogelijk van de vlieg embryo onvoldoende benut in de karakterisering van moleculen activiteit.
Levering van kleine moleculen aan de vlieg embryo kan worden bereikt met twee methoden: 1) permeabilisatie van de eierschaal en 2) micro-injectie. Dit artikel presenteert voorschotten aan de methode van permeabilization die eenvoudig uit te voeren in de setting van een conventionele Drosophila laboratorium zijn. Opgemerkt zij dat de recente ontwikkelingen in micro-injectie methoden microfluïdische technologie ook bij aan werkwijzen voor het inbrengen verbindingen om de embryo 5,6. Introductie van moleculen aan het embryo wordt verhinderd door een waslaag van de eierschaal 7. De Drosophila eierschaal bestaat uit vijf lagen. Vanbinnen naar buiten zijn ze: de vitelline membraan, de waslaag, de binnenste laag chorion, de endochorion en de exochorion 8. De drie buitenste chorion lagen kunnen worden verwijderd door korte emersion van het embryo in verdund bleekwater, genoemde stap als dechorionation. De blootgestelde wasachtige laag kan vervolgens worden aangetast door blootstelling aan organische oplosmiddelen, zoals heptaan en octaan 7,9, waardoor de dechorionated embryo permeabel, maar blijft ingekapseld in de onderliggende vitelline membraan. Echter, het gebruik van deze oplosmiddelen introduceert complicaties vanwege hun toxiciteit en de moeilijkheid bij het reguleren van hun sterke permeabilisatie actie die beide sterk negatieve gevolgen embryouitvoerbaarheid 9,10.
Werkwijze voor permeabilisatie met een samenstelling genoemd embryo permeabilisatie oplosmiddel (EPS) is eerder beschreven 1. Dit oplosmiddel bestaat uit d-limoneen en planten-afgeleide oppervlakteactieve stoffen die het oplosmiddel in staat miscibl te zijne met waterige buffers. De lage toxiciteit van d-limoneen en het vermogen om het oplosmiddel te verdunnen tot de gewenste concentratie is een effectieve methode om permeabel embryo's met hoge levensvatbaarheid 1 genereren opgeleverd. Evenwel twee endogene factoren blijven beperkingen aan de toepassing brengen. Eerste, embryo's tonen heterogeniteit in permeabiliteit na een EPS-behandeling, zelfs wanneer zorg is genomen om dicht ontwikkelingsstoornissen enscenering te handhaven. Ten tweede, embryo ouder dan ongeveer acht uren zijn moeilijk te permeabiliseren, consistent met een verharding van de eierschaal die optreedt na eierleggende 11 bewezen.
Hier beschreven zijn vooruitgang in de EPS methode: 1) helpen bij het identificeren en analyseren van bijna identiek gepermeabiliseerde embryo, zelfs na fixatie en immunokleuring stappen zijn uitgevoerd en 2) mogelijk permeabilisatie van embryo's in de late ontwikkelings tijdstippen (> 8 uur, stadium 12 jaar en ouder). Met name de toepassing van een ver-rode kleurstof,CY5 carbonzuur, wordt beschreven dat dient als een indicator permeabiliteit, die blijft in het embryo tijdens de ontwikkeling en na formaldehyde fixatie. Bovendien wordt aangetoond dat opvoeding embryo bij 18 ° C houdt de schalen per EPS gevoelige toestand, waardoor permeabilisatie laat stadium embryo (stappen 12-16).
Deze vooruitgang overwinnen van de eerder genoemde beperkingen van de EPS methode. Deze toepassing zal daarom voorzien de onderzoekers een middel om kleine moleculen van belang kennismaken met de embryo in verschillende ontwikkelings tijdstippen behoud levensvatbaarheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Fly Culturen, Solutions, en Embryo Handling Devices
- Bereid een kooi cultuur van Drosophila. Plaats 500 + paring vliegen van de gewenste spanning in een populatie kooi voorzien van een 10 cm druif-agar plaat en een plek van gistpasta. Handhaaf cultuur in een 25 ° C vochtigheid incubator. OPMERKING: Cage culturen vereisen een dag of twee van conditionering om consistente embryo legpatronen verkrijgen. Druif platen met gistpasta worden een keer veranderd in de ochtend en een keer 's avonds tijdens het conditioneren.
- Bereid EPS. Warme oplossingen van oppervlakteactieve stoffen (cocamide DEA en geëthoxyleerde alcohol) bij 37 ° C. Pipetteer 18 ml van d-limoneen een glazen scintillatieflesje met een kleine roerstaaf. Pipetteer 1 ml elk van beide oppervlakteactieve stoffen (5% eindconcentratie van elk) op de d-limoneen. Meng goed en verwijder roerstaafje. Opmerking: Deze voorraadoplossing van EPS is goed voor ongeveer 2 maanden bij kamertemperatuur. De oplossingworden opgewarmd tot 37 ° C en gewerveld volledig oplosbaar oppervlakteactieve vóór gebruik. EPS en d-limoneen worden bewaard in een glazen container die sommige kunststoffen oplossen tijd.
- Bereid embryo dechorionation oplossing, incubatie mediums, kleurstof en drugs oplossingen. Meng 25 ml bleekwater met 25 ml H 2 O en plaats in ondiepe schaal. Bereid gemodificeerd uitgangsmateriaal incubatiemedium (MBIM) en MBIM-T volgens de bekende recept 1,12. Bereid Shields en Sang M3 celcultuurmedium en PBS volgens protocol van de fabrikant (zie Materials List). Bereid voorraad oplossing van permeabilization kleurstof bij 10 mM concentratie in DMSO.
- Monteer embryo-handling apparatuur en benodigdheden:
- Bereid dechorionation en EPS behandeling mand (zie figuur 1A). Snijd een 3 cm doorsnede van een wegwerp 50 ml polypropyleen centrifuge / cultuur buis met een zaag met fijne tanden. Maak het oppervlak lassen flush door de afdeling buis op schuurpapier gehandeld wrijveneen benchtop oppervlak. Las de sectie buis Nitex nylon mesh door het smelten van de rand van de buissectie op een vlam en drukken op het gaas op een glasplaat. Laat afkoelen en snijd eenmalige extra mesh. OPMERKING: De pure zijkanten en de bodem zorgen voor een snelle en volledige afspoelen van de resterende bleekmiddel en EPS bij de respectieve stappen. De lassen stappen moeten onder een zuurkast worden uitgevoerd.
- Bereid een ontwikkeling mand. Snijd bovenste gedeelte van een 50 ml centrifuge / kweekbuis gelijk met de rand van de dop. Verwijder de dop wijzigen door snijden een centrale opening en inkepingen langs de rand zoals getoond in figuur 1B. Schroef de kap over de maas en op de schroefdraad van de afgesneden buis sectie en trim extra mesh. OPMERKING: De kap bevat uitsparingen in de rand die diffusie toestaan de bulk medium wanneer het zich in het reservoir 60 mm schaal (figuur 1B).
- Bereid onderdelen van een dia kamer. Snij een vierkant van DO membraan dat groter is dande dia kamer opening. Breng een zeer dunne laag vacuüm vet aan de binnenzijde rand van de opening. Bevestig de DO membraan in de opening te dichten tegen het vet met de borgring. Knip extra DO membraan door te snijden terug dicht bij de ring. OPMERKING:. Specificaties voor de dia kamer kan worden gevonden in Kiehart et al. 13 Deze kamer is niet commercieel beschikbaar en vereist aangepaste fabricage door een machine winkel.
2. Staging, Dechorionation en EPS Behandeling van embryo's
- Staging embryo's door getimede collectie. Stel een verse druiven / gist plaat om de fly cultuur kooi in de AM. Laat embryo's worden vastgesteld gedurende 1 uur bij 25 ° C. Gooi deze plaat en vervangen door een verse druiven / gist plaat voor een volgende embryo leggen van 2 uur bij 25 ° C. Verzamelen deze plaat en plaats in 18 ° C incubator voor verdere ontwikkeling enscenering. Opmerking: 1 uur van ontwikkeling bij 25 ° C gelijk aan 2 uur van ontwikkelingbij 18 ° C. Het effect van veroudering bij 18 ° C versus 25 ° C op behoud EPS permeabilisatie in een vergevorderd stadium embryo's te zien in figuur 2.
- Dechorionation. Voorzichtig afspoelen embryo off van druif plaat in gaasmand gebruik 25 ° C kraanwater en een penseel. Spoel overtollige gist weg van de embryo's in de mand onder een zachte stroom van kraanwater. Dompel de mand in 50% bleekwater gedurende 2 minuten. Was de embryo's grondig onder een stroom van kraanwater. OPMERKING: voorzichtig spuiten bleekwater oplossing op de embryo's met tussenpozen met een plastic pipet. Terwijl 2 min is meestal voldoende voor een volledige dechorionation, dient deze incubatietijd worden gecontroleerd door rechtstreeks onderzoek en dienovereenkomstig aangepast. Handhaaf dechorionated embryo's in de mand ondergedompeld in kraanwater en meteen doorgaan naar de EPS stap.
- EPS Behandeling
- Neem zes 60 mm gerechten met ongeveer 10 ml PBS in elk. Bereid EPS verwatering door het oplossen van 75 ul EPS in 2,925 ml MBIM (01:40) in een 50 ml bekerglas met wervelende. Opmerking: Een witte emulsie vormen van dit mengsel.
- Dep het overtollige water uit de onderkant van het gaas mand met een lab te vegen. Dompel mand verdunde EPS in beker en onmiddellijk wervelen om embryo dispergeren in de EPS oplossing in de bodem van de mand. Doorgaan wervelende beweging gedurende 30 sec. OPMERKING: EPS verdunningen en blootstellingstijden kunnen worden gevarieerd om permeabiliteit controleren. Aanbevolen wordt optimaal EPS verdunningen en behandeltijden empirisch worden vastgesteld met de stammen van vliegen gebruikt. Toenemende blootstelling tijd om 60-90 sec is gunstig voor fase 12 en ouder embryo's.
- Verwijder mand, dep overtollige EPS weg met een lab te vegen. Ga door zes opeenvolgende wassingen in 10 ml PBS in 60 mm schalen. Gebruik een plastic pipet zachtjes spuiten embryo's met PBS in elk van de zes wasbeurten. Ga verder met verven en stappen behandeling met geneesmiddelen. OPMERKING: EPS kan worden afgevoerd door de gootsteen.
3. Dye and Drug Behandeling van gepermeabiliseerde embryo
- Dye Behandeling
- Voeg 5 ui 10 mM CY5 carbonzuur kleurstof * 1 ml MBIM-T (50 uM eindconcentratie) in een 1,5 ml microcentrifugebuis en vortex mengen. OPMERKING: * Keuze uit kleurstof afhankelijk van downstream analyse. CY5 carbonzuur is effectief voor de daaropvolgende analyses met behulp van fixatie en immunokleuring. Rhodamine B is bruikbaar voor de analyse van levende embryo. De rode emissie van Rhodamine B, en de groene emissie van zijn metabolieten 1, kan een aantal complicaties met downstream-toepassingen met behulp van fluorescentie presenteren. Geneesmiddel of toxine kunnen worden toegevoegd aan de kleurstofoplossing behandeling initiëren in dit stadium of drug / toxine behandeling beperken tot een impuls in dit stadium. Zorg moeten worden genomen om te verwerken en afvoeren van drugs en toxinen volgens VIB en milieuveiligheidsnormen.
- Transfer embryo's uit het gaas mand om de kleurstof oplossing met behulp van een penseel. Doe het buisje dicht en herhaaldelijk omkeren om ervoor te zorgen deembryo's zweven vrij in suspensie in de kleurstof oplossing. Plaats buis op een schudder wip voor 15 min bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder buis uit nutator en laat embryo's te regelen. Verwijder kleurstofoplossing met een fijne pipet en vervangen door 1 ml MBIM-T te wassen. Omkeren buis om opnieuw te schorten embryo's volledig. Laat embryo's te regelen en te herhalen met drie meer MBIM-T wasbeurten. Verwijder alle MBIM-T uit laatste spoeling en ga verder met incubatie stap.
- Incubatie voor embryo-ontwikkeling
- Transfer embryo tot een van de twee kamers: De ontwikkeling mand of de dia kamer. OPMERKING: De ontwikkeling mand heeft de voorkeur voor een periode langer ontwikkelingsstoornissen, en is nodig als de daaropvolgende vaststelling en immunostaining stappen moeten worden uitgevoerd. De dia kamer is optimaal voor hogere resolutie time-lapse imaging en is het meest effectief voor korte ontwikkelings periodes (bv. de vroege embryonale gebeurtenissen). Geneesmiddel of toxine kan aan het medium worden toegevoegd in verschillende concentraties en embryo dNTWIKKELING kunnen in real-time met levende embryo of een eindpunt met standaard fixatie en immunokleuring protocollen.
- Ontwikkeling in Manden
- Reinig een ontwikkeling mand door te spuiten met 70% ethanol, goed naspoelen met demi water en dep droog met lab vegen. Bereid 6 ml incubatiemedium met de gewenste concentratie geneesmiddel of toxine. Plaats de ontwikkeling mand in medium in 60 mm schaal en zorg ervoor dat niet val luchtbellen onder de spiraalbodem. OPMERKING: twee media worden vaak gebruikt: MBIM alleen of MBIM/M3 in een 50:50 mengsel, waarbij de laatste effectiever langer ontwikkeling.
- Transfer gepermeabiliseerde embryo oppervlakte maas in de basis van de mand met een penseel. Zachtjes spuiten de embryo's met media uit de omliggende reservoir. Dispergeer de embryo's met de verfkwast, zodat ze in een monolaag op het gaas. OPMERKING: Ga verder met microscopie beeldvorming en evalueren permeabilisatie en levensvatbaarheid kenmerken van de preparation (zie stap 4).
- Ontwikkeling in de Slide Kamer
- Omkeren dia kamer en breng een kleine kraal van vacuüm vet aan de rand van de opening. Breng 150 pi medium met de gewenste hoeveelheid geneesmiddel of toxine op het oppervlak van DO membraan in de opening. OPMERKING: twee media worden vaak gebruikt: MBIM alleen of MBIM/M3 in een 50:50 mengsel, waarbij de laatste effectiever langer ontwikkeling.
- Transfer gepermeabiliseerd's naar de daling van de media met een penseel. De verspreiding van de embryo's waardoor ze zich te vestigen op het membraan in de drop.
- Een verlaging van 25 mm rond dekglaasje voorzichtig over de opening waardoor het medium afvlakken. Zachtjes druk langs de omtrek van het dekglaasje om een afdichting met het vet vormen. OPMERKING: Ga verder met beeldvorming microscopie om permeabilisatie en levensvatbaarheid kenmerken van het preparaat te evalueren (zie stap 4).
4. Identicatie van gepermeabiliseerde levensvatbare embryo
- Identificeer gepermeabiliseerd embryo's. Let op embryo's onder epifluorescentie met een microscoop uitgerust met een digitale camera. Acquire beelden van verschillende gebieden met behulp van vaste microscoop en camera-instellingen (in de blauwe golflengte om het gebruikersprofiel dooier autofluorescentie bepalen).
- Bepaal permeabilisatie van embryo's op basis van relatieve fluorescentie-intensiteit. Gebruik een stereomicroscoop met een grote werkafstand aan de mand te vangen en manipulaties van de embryo's mogelijk te maken. De microscoop moet worden uitgerust met een programmeerbare XYZ fase epifluorescentie verlichting en een digitale camera. Het imago van de embryo's en zorg ervoor dat de belichting en podium positie parameters van elke afbeelding embryo opnemen herevaluatie van dezelfde embryo's mogelijk te maken op een later tijdstip (zie representatief resultaat in figuur 3). OPMERKING: Patronen van kleurstofopname zal variëren naargelang de gebruikte kleurstof, de blootstellingsduur en embryo leeftijd. Een breed scalaopname van kleurstof in een preparaat is typisch en weerspiegelt de variatie in de mate van permeabilisatie.
- Identificeer levensvatbare embryo's. Na markeren positie van gepermeabiliseerde embryo verder met embryonale ontwikkeling bij kamertemperatuur of 25 ° C. Terug mand of dia kamer naar microscoop. Controleer onder blauwe kanaal fluorescentie en het verwerven beeld van dooier autofluorescence in eerder geïdentificeerde gepermeabiliseerde embryo's. Beoordelen levensvatbaarheid volgens de normale progressie van de dooier distributie (zie Rand et al.. 1 en representatief resultaat in figuur 3). OPMERKING: Andere morfologische kenmerken van het embryo waargenomen met helderveld microscopie kan worden gebruikt om levensvatbaar zal zijn. Het wordt aanbevolen dat de vaststelling van het niveau van de permeabiliteit die compatibel zijn met de levensvatbaarheid is empirisch bepaald worden met elke kleurstof en spanning van het vliegen gebruikt.
- Evalueer geneesmiddel of toxine effecten in gepermeabiliseerde levensvatbare embryo's.
- Embryo's processed met het bovenstaande protocol zijn klaar voor een aantal conventionele analyses volgend op drugs of blootstelling toxine. Verscheidene verschillende soorten analyses worden beschouwd in onderstaande discussie en omvatten directe waarneming van morfogenese in levende embryo's alsmede post-fixatie immunokleuring analyses. Beide benaderingen worden verbeterd door toepassing van vitale kleurstoffen (bijvoorbeeld GFP) dat genexpressiepatronen en cellijn en morfologie profielen onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embryo handling apparaten worden afgebeeld in figuur 1 om te helpen bij het visualiseren van de "home-made" inrichtingen voor manipulatie in de bovenstaande protocollen. Resultaten getoond in figuur 2 illustreren de sterke effect van het houden embryo's bij 18 ° C op hun vermogen om te worden permeabel gemaakt door EPS in de late stadia van ontwikkeling. Deze voorwaarde wordt toegepast in het protocol stap 2.1. Werkzaamheid van de CY5 carbonzuur kleurstof de verschillende permeabiliteit typisch gezien in EPS behandelde embryo blijkt is te zien in figuur 3. De ontwikkelingsdynamiek van de kleurstof verdeling in de dooier wordt ook gezien in figuur 3, onthullen een criterium levensvatbaarheid beoordelen zoals beschreven in stap 4.2 protocol. Het nut van de CY5 kleurstof bepaling embryo permeabilisatie na toxine behandeling, formaldehyde fixatie en immunokleuring wordt geïllustreerd door de resultaten in Figuur 4.
Figuur 1. Embryo manipulatieinrichtingen voor de EPS-methode. De platte bodem korf in dechorination en EPS stappen blootstelling (A, A '). De ontwikkeling korf wordt gebruikt voor langere ontwikkelingsstoornissen blootstelling van gepermeabiliseerde embryo (B, B '). De dia kamer wordt gebruikt voor kortere ontwikkelings blootstelling en hogere resolutie beeldvorming van levende embryo's (C, C '. Zie de tekst voor een nadere beschrijving).
Figuur 2. Effect van veroudering bij 18 ° C op EPS werkzaamheid in een vergevorderd stadium embryo. Embryo's werden verzameld gedurende twee uur, gevolgd door verouderen bij 18 ° C gedurende 20 uur (Panels AA "
Figuur 3. Opneming van CY5 in doorlatend en levensvatbare embryo. Embryo's werden verzameld bij 25 ° C gedurende 2 uur en 14 uur verouderd bij 18 ° C (overeenkomend met 7-9 embryo uur bij 25 ° C, stap 12). Na dechorination, EPS behandeling werd uitgevoerd (01:40 in MBIM gedurende 1 min), gevolgd door incubatie in CY5 kleurstof (50 uM in MBIM-T gedurende 15 min). Embryo's werden drie keer gewassen in MBIM-T en overgebracht naar ontwikkeling mand MBIM in het reservoir. Ontwikkeling liet proceed gedurende 8 uur bij kamertemperatuur geroerd. Opname van CY5 (rood) wordt afgebeeld in het verre-rode kanaal onmiddellijk na dye behandeling en wassen (Panel A) en na 8 uur ontwikkeling (Panel B). Verdeling van de dooier wordt gezien door autofluorescentie in het blauwe kanaal. Kleurstofopname dus permeabiliteit, gezien variëren van embryo embryo. CY5 kleurstof (rood) wordt beschouwd te lokaliseren naar de dooier (blauw), die geconcentreerd om het lumen van de darm in fase 16 (paars, Paneel B) raakt.
Figuur 4. Bepaling van permeabilization en methylkwik effecten in vaste en immunostained embryo's. Embryo's werden verzameld bij 25 ° C gedurende 2 uur en 14 uur verouderd bij 18 ° C (overeenkomend met 7-9 embryo uur bij 25 ° C, stap 12). Na dechorination werd EPS behandeling gedaan (01:40 in MBIM gedurende 1 min), gevolgd door incubatie inCY5 kleurstof (50 uM in MBIM-T voor 15 min) samen met methylkwik (50 uM MeHg, Paneel B) of DMSO oplosmiddel controle (0,1% eindconcentratie, Panel A). Embryo's werden met MBIM-T en ontwikkeling in een mand met MBIM: M3-medium in het reservoir en een extra 8 uur bij kamertemperatuur liet verouderen. Embryo's werden vervolgens gefixeerd in een tweefasen 4% paraformaldehyde-heptaan preparaat een standaard protocol 14. Kleuring werd uitgevoerd met anti-fascicline-II (groen in A, B en wit in A ', B') motorneuronen en anti-elav antilichamen (rood A, B) op alle neuron cellichamen label label. CY5 kleurstof wordt onthuld door directe fluorescentie, die langdurige blootstelling als gevolg van verminderde fluorescentie-intensiteit als gevolg van fixatie (CY5 is pseudo-kleur blauw in alle panelen) vereist. De effecten van MeHg worden gezien in de onregelmatige patronen en clustering van de laterale chordotonal neuron cellichamen (elav-positief, gelabeld in rood en aangegeven met witte pijlen in B versus A). Bovendien is een kenmerk vertakking van de segmentale (SN) (vaste groene pijlen in A ') gezien zeer variabel met MeHg blootstelling (vaste groene pijlen in B ") in overeenstemming met eerder gerapporteerde effecten van MeHg de embryo 15 zijn. Projectie van de intersegmentele en segmentale zenuwen bij hun wortels worden gezien om naar achteren worden verplaatst met MeHg blootstelling (open groene pijl in B '). Opmerking: Methylkwik is een krachtige neurotoxine. Zorg moeten worden genomen om handschoenen en oogbescherming dragen bij hantering. Verwijdering dient te gebeuren door middel van een institutioneel milieuveiligheid faciliteiten en service.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bovenstaande methode schetst een middel tot het verkrijgen van levensvatbare Drosophila embryo's die toegankelijk is voor kleine molecule behandelingen in een breed scala ontwikkelingsstoornissen zijn. Deze methode introduceert de nieuwe en eenvoudige vaststelling dat veroudering embryo's bij 18 ° C maakt permeabilization van laat stadium embryo's met dezelfde werkzaamheid zoals eerder alleen gezien in een vroeg stadium embryo's. Bovendien is het gebruik van de ver-rode kleurstof CY5 carbonzuur als een indicator effectieve permeabiliteit in post-fix toepassingen bewezen en interfereert niet met gebruikelijke rode en groene fluorescente markers die kunnen worden gebruikt om fenotypen ontwikkeling onthullen. Deze bevindingen de effectiviteit en het nut van de EPS-methode aanzienlijk voorschot.
Deze methode is vatbaar voor analyses van zowel levende als vaste embryo preparaten. Met behulp van helderveld microscopie en de glijbaan kamer opgericht, typische kenmerken te scoren in de eerste helft van embryo-ontwikkeling zijn morfogenetische bewegingen zoalscellularization van de blastoderm, cefale vore vorming, germband rek en germband intrekken 1. GFP of RFP verslaggevers meer specifieke eindpunten kunnen worden onderscheiden, bijvoorbeeld vroeg segmentatiepatronen en de vorming van neurale structuren in latere ontwikkeling 1. GFP en RFP rapporten observatie van ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen in levende gepermeabiliseerde embryo's in zowel de dia kamer en ontwikkelingsstoornissen mand voorbereidingen ook in staat stellen. Een eenvoudige methode om bruto toxiciteit van een toegepaste geneesmiddel of chemische stof te bepalen, is te zien op de patroon van de dooier eiwit auto-fluorescentie in het blauwe kanaal een vertraging of stopzetting van de ontwikkeling te bepalen 1.
De EPS-methodiek heeft ook een groot potentieel voor het verbreden van de onderzoeksinstrumenten voor niet-model insecten, in het bijzonder de mug, die een soortgelijke architectuur van de eierschaal deelt. Toepassing van kleine moleculen om embryo's van andere insectensoorten zouden openstellen van een laan met investigativan waar standaard genetische benaderingen functionele studies nog ontbreken. Embryo's ontwikkeld in manden kunnen worden verwerkt voor formaldehyde fixatie, dus openstellen analyses aan het brede scala van immunostaining reagentia beschikbaar voor Drosophila studies. Echter, deze stap vereist dat een post-fix bepaling van permeabilization haalbaar om fenotypes correleren met embryo's die toegankelijk zijn voor de drug had gemaakt. Toepassing van CY5 carbonzuur kleurstof zeer effectief voor deze benadering gebleken. CY5 carbonzuur efficiënt opgenomen in permeabel embryo (Figuur 3A). Tijdens de ontwikkeling CY5 wordt geconcentreerd in de dooier, die uiteindelijk wordt afgezonderd in het lumen van de darm die in stap 14 en hoger (figuur 3B). Na fixatie wordt CY5 fluorescentie duidelijk verminderd, maar betrouwbaar detecteerbaar in de darm en dient als een marker van de embryo's die effectief zijn permeabel in het begin (zie representatieve result Figuur 4). Opgemerkt zij dat CY5 detectie in dit stadium een langzamere camera's (bv., 1-4 seconden) voor detectie. Aldus kan scoren van fenotypes met immunokleuring patronen doorgaan met de CY5 signaal eveneens permeabel embryo's en bevestig met weefselspecifieke merkers (bijvoorbeeld neurale specifieke antilichamen gezien in figuur 4).
Het grootste probleem bij deze werkwijze is de gevoeligheid van embryouitvoerbaarheid de permeabilisatie proces, iets dat lang last eerdere pogingen om deze methode 9,10,16 ontwikkelen. Levensvatbaarheid na permeabilisatie is grimmig leeftijdsafhankelijke, en stijgt dramatisch hoe ouder het embryo is op permeabilisatie 9. Maar, zoals we al eerder hebben aangetoond, doorlaatbaarheid wordt het steeds moeilijker met de leeftijd 1. Een recent rapport toont nu de mogelijkheid om laat stadium embryo's (stadium 14) permeabilize door opnieuw een beroep op heptane als oplosmiddel samen met d-limoneen 17. De brede toepasbaarheid van deze laatste methode is niet duidelijk enige geneesmiddel effect gekarakteriseerd (nocodazole) en toepassing vroeger stadium embryo niet beschreven 17. Bovendien, de toepassing van de 18 ° C ontwikkelingsstap bovenstaande rendementen laat stadium permeabiliteit en verder vermijdt het gebruik van toxische organische oplosmiddelen. De onderzoeker die nieuw is voor de EPS-protocol zal variabiliteit ervaren permeabilization en levensvatbaarheid resultaten bij de eerste pogingen. De stappen die hier beschreven geven de onderzoeker de middelen om systematisch variëren voorwaarden van permeabilization behandelingen en de daaropvolgende incubatie stappen om te optimaliseren voor specifieke stammen van Drosophila ze werken in hun eigen laboratorium setting.
Een extra probleem met deze methode is de variatie in chemische opname vanuit embryo embryo. Deze variabiliteit wordt weerspiegeld in de heterogeniteit vanCY5 kleurstofopname waargenomen bij embryo's onmiddellijk na kleurstof behandeling (Figuur 3A). Daarentegen Rhodamine B kleurstof sneller en gelijkmatiger verspreid over de embryonale weefsels dan CY5 kleurstof (Figuur 2B "). Aldus kunnen sommige embryo naar embryo variabiliteit worden geherbergd in de verdeling van de chemische eigenschappen, geneesmiddel of toxine plaats en is inherent aan de werkwijze. Wanneer kwantificering van de dosis kritisch is, wordt aanbevolen dat de opname van het geneesmiddel of toxine plaats wordt gekenmerkt door een alternatieve analysemethode. Niettemin, het gemak van het bovenstaande protocol, en de mogelijkheid om honderden embryo's te screenen, kan de onderzoeker om dosis reacties evalueren en scoren karakteristieke fenotypes met weinig investering van middelen, waardoor voor een krachtige eerste aanzet tot het karakteriseren van drugs of giftige stoffen in deze hoogontwikkelde modelsysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J.
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M.
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
