Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51649
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1, 2, 1, 1
1Institute of Biology, Leiden University, 2ZF-screens BV, 3Life Science Methods BV
* These authors contributed equally

Summary

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Abstract

Zebra balığı, yüksek kapasiteli tarama olanakları ile bir bütün hayvan modeli olarak ilaç keşif taramaları preklinik aşamasında değerli bir araç haline gelmektedir. Bunlar, bu şekilde azaltılması, memeli modellerinde erken aşamalarında hücre bazlı deneyler arasında boşluk ve in vivo doğrulama köprü için kullanılabilir, çok daha pahalı kemirgen modellerinde testten geçen bileşiklerin sayısı. Bu açıdan, bu metin içindeki Staphylococcus epidermidis çalışma ve Mycobacterium marinum enfeksiyonu için in vivo model sistem olarak zebrafish kullanarak yeni bir yüksek veri akışı boru hattı tarif edilmektedir. Bu kurulum senkron embriyo çok sayıda üretim ve analiz homojen enfekte sağlar. Ayrıca boru hattının esnek, kullanıcının kolayca gerektiğinde analiz çözünürlüğünü artırmak için başka platformlar uygulamasına olanak tanır. Birlikte yenilikçi yüksek verim te olan Zebra balığı kombinasyonuchnologies, bu yeni bileşiklerin etki moduna çözmek için kullanılabilecek transjenik sayıda için bütün bir hayvan modeli kullanılarak değil, aynı zamanda mukavemet, sadece ilaç test ve yeni olanaklar keşif alanı açar.

Introduction

Zebra balığı Bugüne kadar (Br.rerio) başarıyla bulaşıcı hastalıklar 1. çeşitli çalışma için verimli bir model olarak kurulmuştur. Zebra balığı embriyo nedeniyle şeffaflık ve floresan proteinleri eksprese eden transjenik mevcut raportör hatlarının çok sayıda vivo görüntüleme imkanı benzersiz sunmaktadır. Bu güçlü kombinasyon Miyobakteryum marinum, M. yakın akrabası olarak patojenler ile etkileşim sırasında bu sürede farklı bağışıklık hücre türlerini izlemek için yapar tüberküloz 2 veya Staphylococcus epidermidis, biyomalzeme ilişkili enfeksiyon 3-5 ana etken. Enfeksiyon farklı yolları çalışmanın 6 amaçları bağlı zebra balığı embriyolar kullanılabilir.

Bu enfeksiyon yollarından biri, bakterilerin sarısı enjeksiyon. Diğerlerine göre bu yöntemin temel avantajı sarısı enfeksiyonu olduğunuönemli ölçüde enjeksiyon süresini azaltmak ve enfeksiyonun 7, 8, yüksek tekrarlanabilirlik sağlayan, robot enjeksiyon yoluyla otomatik olarak gerçekleştirilebilir.

Önceki çalışma, S. ve çalışma için in vivo model sisteminde yüksek bir verim olarak zebrafish kullanarak epidermidis ve M. marinum enfeksiyon 7, 8 başarılı olduğunu gösterdi. Bu sistem, robot sarısı erken embriyo enjeksiyon ve bakteri yükü için bir ölçüt olarak floresan sonucu kullanılarak yoluyla hastalık ilerlemesine taranması edebilmektedir. Bu kavram ile uyumlu olarak, bu kurulum optimize edilmiş ve homojen enfekte embriyolarının büyük sayılar üretmek ve bileşikler bir dizi ile muamele edildikten sonra bir süre boyunca enfeksiyonun ilerleyişini izlemek için potansiyeli olan bir yüksek verimli yüksek verimli bir boru hattı kurulmuştur. Kurulan kurulum sayesinde ekrana 8.000 senkron embriyolar kadar üretmek mümkündürhastalığın ilerlemesi için, saat başına 2,500 embriyo kadar bu şekilde işlem. Embriyolar enfekte larva homojen gruplar sağlanması, otomatik bir sistem kullanarak bakteri yüküne göre sıralanır. Ayrıca, kurulum doğrulamak için, memelilerde, tüberküloz ilerlemesini önlemek için bilinen referans etkileri M. bulaşmış embriyo üzerinde test edilmiştir marinum E11 gerginlik veya daha öldürücü M suşu 9.

Bu çalışmada ayrıntılı olarak enfekte embriyo sayıda ve gelişme sırasında ve bileşik işlemden sonra bakteriyel ilerlemesinin sonraki analizi elde edebilmek için kurulmuştur yüksek verimli boru hattını açıklar.

Protocol

1.. Bakteriyel türler ve Büyüme Koşullar

  1. S. hazırlayın epidermidis Aşı
    1. S. birkaç ayrı ayrı koloniler, alın epidermidis suşu O-47, bir pWVW189 içeren Luria Bertani (LB) 25 ml LB ortamı içinde 37 ° C'de gece boyunca 10 ug / ml kloramfenikol ve kültür ile takviye agar plaka ile takviye edilmiş ikinci MCherry ekspresyon vektörü (De Boer L. yayınlanmamış) türetilmiş aşama midlog için 10 ug / ml kloramfenikol.
    2. 1 dakika boyunca 12,000 x g ve daha sonra kültür santrifüj 1 ml onları% 0.3 (v / v) Tween-80 ile 1 ml steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 3 kez yıkayın.
    3. 600 nm (OD 600) de optik yoğunluğunun ölçülmesi, ve (ağırlık / hacim) polivinilpirrolidon 40 (PVP 40) PBS içinde% 2 bir 0.3 OD 600 için bakteriyel süspansiyonun seyreltin. Not: Bir OD 600 x 10 8 ila 1.0 arasında koloni karşılık 0.3 birim / ml (cfu / ml) oluşturulması.
    4. M. hazırlayın marinum Aşı
      1. M. birkaç ayrı ayrı koloniler, alın marinum soy M veya stabil bir şekilde (v / v) Middlebrook OADC zenginleştirme 50 ug ile takviye /, 10 ml 28 ° C'de gece boyunca kültür ml higromisin ve% 10 ile bir Middlebrook 7H10 agar plakasından 10 mCherry ifade pSMT3 mCherry vektörü içeren E11 50 ug / ml higromisin ile takviye edilmiş,% 10 (v / v) Middlebrook ADC zenginleştirme ile Middlebrook 7H9 suyu.
      2. 1 dakika boyunca 12,000 x g ve daha sonra kültür santrifüj 1 ml, 0.3% (v / v) Tween-80 ile 1 ml steril PBS ile 3 kez yıkayın.
      3. OD 600 ölçün ve PBS (w / v) 40% 2 pvp bir 0.3 OD 600 için bakteriyel süspansiyonun seyreltin. Not: Bir 1 OD karşılık gelir 600 8 ila 10 x 1,0 cfu / ml.

    2.. Zebra balığı Yumurta hazırlayın

    1. 70 erkek ve 50 dişi yaban ty maksimum yerleştirinbüyük yetiştirme kabına ayrı ayrı zebrafish pe. Not: büyük yetiştirme kabın alt kısmında, dişi balık yerleştirin.
    2. Zebra balığı üreme başlayalım, sabah ertesi gün ayırıcısını sökün.
    3. Yumurta, su (60 ug / ml anında okyanus deniz tuzu) ile doldurulmuş bir 50 ml tüp içinde yumurta toplayıcı aracılığıyla büyük yetiştirme kabın altındaki yumurta toplayın.

    3.. Enjeksiyon İğneleri

    1. 10 um arasında bir iç çapa sahip ticari olarak temin edilebilen özel yapılmış bir cam kılcal damar iğneler elde edilir.

    Enjeksiyon 4. Deneysel Anahat

    1. Yaklaşık olarak 40 ° C kadar, 100 ml% 1 yumurta, su (ağırlık / hacim) agaroz ve serin kaynatın Otomatik mikroenjektörler plaka içine agaroz dökün ve agaroz içine 1.024-iyi damgası yer. Not: levha soğuduktan kullanıma hazırdır.
    2. Üzerinde otomatik mikroenjektör işletim yazılımı tıklayın 'sahne Kalibre'sonra '1024 'de ızgara üzerine tıklayın ve mikroenjektör de agaroz plaka yerleştirmek ve iyi merkezi konumunda ekranda tıklayarak plaka kalibre.
    3. 'Iğne menüsüne' gidin ve 'kalibre iğne tutucu' üzerine tıklayın.
    4. 100 kob / nl S ihtiva eden 10 ul pvp 40 biriyle bir Microloader ucu kullanılarak enjeksiyon iğnesi doldurun epidermidis veya 30 kob / nl M. marinum veya sahte enjeksiyon gibi kullanım pvp 40.
    5. Otomatik mikro enjektör iğnesi koyun ve aşağı veya yukarı hareket eden iğne ve iğnenin konumunda ekranda tıklayarak, y pozisyonlar x kalibre edin. Daha sonra, iğnenin ucunun konumunda ekranda tıklayarak iğnenin z konumunu kalibre edin.
    6. Plastik bir transfer pipet kullanılarak agaroz ızgara üzerinde yumurta dağıtmak, ve fazla yumurta su çıkarmak. Otomatik bir mikropüskürtücü içerisinde agaroz ızgara yerleştirin.
    7. 'Injectio gitn menüsü 've ayarlayın' FemtoJet ayarları menüsünden, 1 nl ile ilişkilidir '200 hPa ayarı' Enjeksiyon basıncı Enjeksiyon süresi '0.2 sn ve' Tazminat basıncı '15 hPa,.
    8. Tüm plaka enjekte etmek ', tüm enjekte' üzerine tıklayın.
    9. Yumurta toplamak Petri tabağı başına 70 embriyo, maksimum bir Petri kabı (92 x 16 mm) içine yıkama ve 28 ° C de inkübe edilir göre enjeksiyon sonrasında

    5. Akış-sitometresiyle Analizi

    1. Üreticinin talimatlarına göre sitometresi büyük bir tanecik akışı hazırlamak ve yumurta su ile bir numune kabı ve kılıf sıvı kabı doldurun.
    2. Işletim yazılımı de, 'PMT' menüsüne gidin ve aşağıdaki ayarları kullanın: 'Yeşil' ve 'sarı' kanalları için 650 'Kırmızı' kanalı için V ve 0 V. Ardından 'eşikleri' menüsüne gidin ve aşağıdaki ayarları kullanın: 'Opticaenkaz etkisini azaltmak amacıyla l yoğunlukta 'eşik sinyali: 975 mV (COPAS XL değeri: 50) ve "320 mikro-saniye (800 COPAS XL değeri) Flight Of Time' (TOF) minimum.
    3. Embriyolar analizi için, 5.4 adıma gidin sıralama ve bir Petri kabı içine embriyolar sıralama 5,5 veya analiz için adıma gidin ve bir 96-plaka içine embriyolar sıralama olmadan analiz için 5.6 adıma gidin.
    4. Numune fincan embriyolar yerleştirin ve analizine başlamak için 'start' üzerine tıklayın. Tüm embriyolar bakıldığında 'dur' tıklayarak analizini durdurun. 'Bütün Store' tıklayarak verileri kaydetmek. Not: Tüm veriler TXT, LMD, DAT, CSV ve BSRT dosyaları olarak depolanır. Adım 5.7 'protokolünü uygulayın.
    5. Numune fincan embriyolar yerleştirin ve 'Sıralama' menüsünde 70 girerek sıralanmasını plaka başına 70 embriyo maksimum tanımlar. Sıralayıcı altında boş bir Petri kabı yerleştirin ve 'Elle sırala' üzerine tıklayın. Ne Petri di sh doldurulur, 'bütün Store' tıklayarak verileri kaydetmek. Not: Tüm veriler TXT, LMD, DAT, CSV ve BSRT dosyaları olarak depolanır. Adım 5.7 'protokolünü uygulayın.
    6. Numune fincan embriyolar yerleştirin ve 'Sıralama' menüsünde 1 girerek sıralanmasını yuva başına 1 embriyo maksimum tanımlar. Sol plaka tutucu içine boş bir 96-plaka koyun ve 'plaka Doldur' üzerine tıklayın. 96-plaka dolduğunda, 'bütün Store' tıklayarak verileri kaydetmek. Not: Tüm veriler TXT, LMD, DAT, CSV ve BSRT dosyaları olarak depolanır. Adım 5.7 'protokolünü uygulayın.
    7. 'Durum seç': Aşağıdaki veri filtre ayarlarını kullanmak, ham verilerin işlenmesi için TXT dosyasını alın. 6 Ardından 'Kırmızı gelen toplam floresan sinyal numaralarını kullanabilirsiniz: 40, ve sıralama modül' Durum çeşit 'kullanıyorsanız ortalama ve ortalamanın standart hatasını hesaplamak için 'kanalı. Çubuk veya saçmanız grafikler içine bu veri setleri çizilir.
    ve_title "> 6. İlaç Tedavisi

    1. Analiz ve sıralama 3 gün sonrası enjeksiyon (dpi), M. marinum büyük bir tanecik (adım 5.5) akış sitometresi kullanılarak iki eşit gruba embriyolar etkilemiştir. Bir taşıyıcı ile bir çözücü içerisinde ilgi çekici bir bileşik grubu ile ve tek başına çözücü taşıyıcı (kontrol) ile diğer tedavi. Antibiyotik yan etkileri test etmek için enjekte kontrolü taklit benzer tedavileri uygulanır.
    2. 4 ve 5 dpi'de analizi tekrar (5.5 adım) ve yumurta su veya bileşiği içeren yumurta su yenileyin.

    7. Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme

    1. % 0.02 ile embriyolar anestezisi (ağ / hac) analiz öncesi yumurta su içinde 10 dakika boyunca 3-aminobenzoik asit etil ester (Tricaine) tamponlu.
    2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak Omurgalı otomatik tarama Technology sistemi ve büyük parçacık Sampler hazırlayın.
    3. Nesne - 'Görüntüleme gelen embriyoların yaşına karşılık gelen referans görüntüleri seçin211; Algılama Kurulum 'menüsü.
    4. Menüsünden - 'Auto mağaza görüntüleri Görüntüleme' dan Omurgalı Otomatik Tarama Teknoloji sistemi tarafından yapılacak resimlerin miktarını ve yönünü seçin.
    5. Büyük Parçacık Sampler sol plaka tutucuya (adım 5.6) embriyolar ile dolu bir 96-plaka yerleştirin ve 'Run plaka' üzerine tıklayın.
    6. Bir embriyo tespit ve doğru yerleştirildiğinde; görüntü baş ve CLSM bir 10X sade kuru objektif kullanarak ve görüntü işleme yazılımı kullanarak sonradan görüntüleri dikiş ile ayrı ayrı kuyruk.

Representative Results

Bu sonuçlar yüksek kapasiteli boru hattı S. çalışma olduğunu göstermektedir epidermidis ve M. marinum enfeksiyon başarıyla kurulmuş ve diğer enfeksiyon modellerine uzatılabilir. İlk olarak, Adatto ve arkadaşları tarafından yayınlanmış sistemine göre büyük yetiştirme kabına (Şekil 1A). (2011) 11 kullanımının, yumurtlama işleminin yüksek bir kontrolü elde tek olaylar senkron yumurtaların büyük sayılar üretmek için olanak sağlar. Daha önce geliştirilen otomatik mikro-enjeksiyon sistemi 7 geliştirilmiş bir versiyonu (Şekil 1A) kullanıldı, kısa bir süre içinde embriyo çok sayıda enjekte edebilmek için yanında. Sarısı enfeksiyon için en iyi gelişimsel aşamada, S. ile enjeksiyonları olduğunu değerlendirmek için epidermidis ve M. marinum Kimmel ve diğerleri tarafından yapılan açıklamaya göre, 1 ve 512 hücre aşamasında arasındaki tüm farklı safhalarında gerçekleştirilmiştir. (1995) 12

100 cfu S ile Enjeksiyonlar epidermidis 16 ve 128 hücre aşamasında arasında en iyi enfeksiyon modeli (Şekil 2) temin etmiştir. Bakteriler 3 gün boyunca sarısı içinde çoğaldı ve sonrası 3 dpi vücuda yayılır. 256 hücre aşamasında embriyo gövde içine yayılan neredeyse herhangi bir bakteri ile yumurta sarısı içinde esas olarak bakteri büyüme gösterdi sonra 16 hücre aşamasından önce enjeksiyon yapılması 4 dpi ve enjeksiyon yüksek mortaliteye neden oldu. Bakteriyel yük miktarının Veneman ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi, büyük bir tanecik akış sitometresi kullanılarak flüoresan yoğunluğu analizi ile gerçekleştirilmiştir. (2013) 8 (Şekil 3).

Gözlemler göstermiştir ki 30 cfu M. püskürtülmesi için uygun gelişim aşamasında marinum enjeksiyon E11 suşu (Şekil 4A) ve daha öldürücü M Strai ile 16-64 hücre aşamasına arasında 16-128 hücre aşamasında arasındadırn (Şekil 4B). Bu aşamalarda enjekte embriyolar yumurta sarısı içinde bakteri büyüme gösterdi ve embriyo (Şekil 7) yoluyla bakterilerin yayılmasını. Erken aşamalarında hem cinsleri ile Enfeksiyon 4 dpi sonra ölmeye embriyoların lider nonspesifik jeneralize bakteriyel büyümeyi sundu. Diğer taraftan, daha sonraki aşamalarda enjekte edilen embriyolar bakteri yükü sarısı sınırlıydı.

Daha sonra, büyük parçacık ön düzenlemesine (Şekil 1 B)-olmayan ya da yüksek derecede enfekte embriyolar (Şekiller 5A ve 6A) hariç enfekte balıkların büyük homojen gruplar oluşturulur akış sitometresi. Ön düzenlemesine sonra, M. marinum enfekte embriyolar Rifampisin, bir birinci hat antitüberküloz ilaç ile muamele edilmiştir. Önceki çalışmalar, 200 uM'lik bir dozda Rifampicin ile tedavi, etkin bir M. azalttığını göstermiştir zebrabalıkları 7, 13 marinum enfeksiyonu. Advantag alarakFarklı dozlarda uygulandı ile yüksek verimlilik ayarlaması, tedavi ile oluşturulan homojen bir şekilde enfekte edilmiş embriyoların sayıda e. M. ile enfekte embriyolar marinum M gerilme ve 12, 24 ile 48 saat boyunca muamele edilmiş ve 200 uM Rifampisin, doza bağlı bir şekilde (Şekil 5B) etkili bir şekilde azaltmak için mikobakteriyel enfeksiyonu gösterdi. Bu konsantrasyon, gelecekteki deneyler için kullanılmıştır 200 uM'lik bir dozda Rifampisin ile enfeksiyonun etkili bir azalma göz önüne alındığında. Önceki sonuca paralel olarak, bakteriyel yükü ilerlemesini okuyan M. kullanarak marinum E11 gerginlik belirgin bir azalma 24 saat ve sonrasında 200 mcM Rifampicin tedaviden sonra (Şekil 6B) gözlenmiştir.

Yüksek büyütme görüntüleme bu embriyoların gerekmektedir Ayrıca, eğer, bu numuneler kullanılarak analiz edilebilir yerden 96 oyuklu plakalar içinde (Şekil 1 C), otomatik olarak görüntülenebilirBüyük Parçacık Sampler ile Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi sistemi CLSM üzerine monte edilmiş.

Büyük Parçacık Sampler ile Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi sistemi ya bir CLSM veya stereo mikroskop üzerine monte edilebilir bir sistemdir. Bu cihaz, otomatik olarak, bir cam kılcal yoluyla, 96 oyuklu bir plaka ya da dökme kabından, canlı ya da sabit embriyoların yüklenmesini sağlar ve istenen açıda (örneğin, dorsal ve lateral) de kameranın önüne yönlendirir. Bütün yönlerde embriyonun Görüntüler kamera ile ilgili kartı ya da harici bir CLSM (Şekil 7) ile yapılabilir. Embriyolar daha sonra toplama veya atık konteynere transfer edilecektir.

Şekil 1
Şekil 1.. Yaygın deneysel outline. Büyük A) Yetişkin balık yumurtası toplanmış, bir agaroz plaka içine hizalanmış ve enjekte edilir, çiftleşmeye birlikte konur. B) enjekte yumurta 28 ° C'de kuluçkaya yatırılır ve olası ilaç tedavisi için önceden sıralanacaktır. ° C) daha sonraki analizi parçacık CLSM ile sitometresinin ve / veya Büyük Partikül Numune / Omurgalı Otomatik Eleme Teknolojisi akar. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
S. iyi cep evre 2. Kurulması Şekil epidermidis enjeksiyon sarısı. Zebrafish embriyolar S. 100 cfu ile 1 512 hücre aşamasından farklı gelişim aşamalarında sarısı enjekte edildi epidermidis. 1 a arasına enjekte embriyolarnd 8 hücreli evre 4 dpi sarısı ve yüksek mortalite bakteriyel büyüme gösterdi. 16 ve 128 hücre aşamasına arasına enjekte Embriyolar sarısı ve 3 dpi başlayan vücudun içinde bakteri büyüme gösterdi. 256 ve 512 hücre aşamasına arasına enjekte Embriyolar sarısı içinde birçok bakteri büyüme gösterdi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
S. sitometresinin büyük parçacık akışı kullanılarak bakteri yükünün Şekil 3.. Kantitasyonu. 100 kob epidermidis zebrafish embriyoların sarısı içine enjekte edilmiştir. A) 5 dpi kadar, her gün, 10 embriyo grupları iki biyolojik kopyaları (hata çubukları göre ortalama üstel büyüme gösteren, homojenize edilir ve direkt olarak kaplanmıştırAnaliz sitometresiyle = SEM). B) Büyük parçacık akışı olmayan enjekte ve S'den ortalama floresan sinyalini göstermektedir epidermidis embriyolar enjekte. . Değil önemli farklılıklar C) mikroorganizma arasındaki korelasyon ve: durum başına 30-160 embriyolar (hata çubukları = SEM), farklı harf ANOVA Tukey post-hoc testi (P <0.001), ns tarafından izlenen bir arada istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermektedir analiz edildi 10 S. gruplarının ortalama floresans sinyali epidermidis (hata çubukları = SEM) embriyolar bulaşmış. Bu rakam Veneman ark modifiye edilmiştir. (2013) 8. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. EstablisM. için iyi cep sahnenin taşınma süreleri marinum sarısı enjeksiyon. Zebrafish embriyolar M. 30 cfu ile 1 512 hücre aşamasında tüm farklı gelişim aşamalarında enjekte edilmiştir marinum E11 ve M suşu. A, B) Embriyolar gösterdi 1-8 hücreli aşamasında enjekte benzer yayılan ve bu enjekte ederken E11 gerginlik granülomlar ve sistemik enfeksiyon oluşumunu gösterdi hem cinsleri ile mortalite. A) Embriyolar 16-128 hücre aşamasına arasına enjekte 256 512 hücre aşaması. B) sarısı içine bakteri yükünü tuttu Embriyolar 512 hücre aşamasına kadar 128 enjekte olanlar sarısı içine bakteri yükünü tutarken yapıları ve sistemik enfeksiyon gibi granülom oluşumunu gösterdi M suşu ile 16-64 hücre aşamasına arasına enjekte . , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 5, Şekil 5,. M. tedavisi marinum akut enfeksiyon birinci basamak anti-tüberküloz ilaç ile. Embriyolar M. 30 cfu ile 16-64 hücre aşamasına arasına enjekte marinum M soy Her iki grupta da, bireysel embriyoların olmayan ve / veya yüksek derecede enfekte embriyolar. A) Floresans attıktan sonra iki grupta kriteri için 3 dpi akış sitometresi büyük parçacık aracılığıyla çalıştırılmıştır. B) Embriyolar Rifampicin (RIF ile muamele ), 12, 24 ve 200 uM 4 dpi'de analiz edildi dozlarında 48 saat boyunca; bunların bakteri yükü önemli ölçüde. C) Örnek COPAS 12, 24'ün dozlarda DMSO ile muamele edilmiş ve Rifampicin embriyo profilleri ve 24 saat boyunca 200 uM azalır. Bakteriyel yük ve dağıtım kırmızı zirveleri ile belirtilir. Mavi hat Zebrafish e dpf'e kriteri elemanının profili (4 temsilmbryo) COPAS tarafından. Koşul başına 60-90 embriyo analiz edilmiştir. Her bir veri noktası tek bir embriyo temsil eder. ± SEM olarak değerleri belirtilmiştir. ns: anlamlı değil farklılıklar. Farklılıkların istatistiksel anlamlılık Analizi ANOVA Tukey posthoc testinin ardından tek yönlü tarafından yapıldı. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6,. M. tedavisi marinum kronik enfeksiyon birinci basamak antitüberküloz ilaç ile. Embriyolar M. 30 cfu ile 16-64 hücre aşamasına arasına enjekte marinum E11 suşu olmayan ve / veya yüksek oranda enfekte embriyolar attıktan sonra iki grup halinde sıralanır 3 dpi sitometresini büyük parçacık akışı ile çalıştırıldı. A) her iki grupta da bireysel embriyolar Floresans. B) 4 gün boyunca 200 uM Rifampicin (RIF) ile muamele Embriyolar tedavi 1 gün sonra bakteri yükünün önemli bir azalma gösteren analiz edilmiştir. Koşul başına 90 embriyo analiz edilmiştir. ± SEM olarak değerleri belirtilmiştir. Farklı harfler aynı tedavinin zaman noktaları arasında önemli farklılıklar göstermektedir. * Kontrol grubu ile anlamlı farklılıklar gösterir. ns: anlamlı değil farklılıklar. Farkların istatistiksel farkları, ANOVA analizi Tukey testi posthoc ardından bir şekilde gerçekleştirildi. (P <0.05). Şekil B) Spaink ark modifiye edilmiştir. (2013) 13. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/>
M. Şekil 7. Sonucu marinum E11 sarısı enjeksiyon Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi ve CLSM kullanarak görüntülü. 5 dpi FLI1-EGFP 14 embriyo (3 görüntülerini dikişli) Eşodaklı Z yığını. M. A) Canlı embriyo gösteren çoğalması vücut. B genelinde marinum E11 bakteriler (kırmızı)) M. gösteren Sabit 5 dpi fli-EGFP embriyo vücutta marinum E11 bakteriler (kırmızı) lökositlerin L-plastin 15 immün ile tespit (açık mavi) ile ko-lokalize.

Discussion

Bu yazıda anlatılan yüksek verimlilik metodoloji enfeksiyonları farklı tipleri ile balık embriyoları ve larvaları yüksek sayıda taranması için hızlı ve uygun maliyetli boru hattı sağlar. Yerine geleneksel tek veya aile üreme tankların büyük yetiştirme kabı kullanarak yumurtlama sürecinin kontrolü ve senkron yumurta daha fazla sayıda nesil kolaylaştırdı. Otomatik mikro-enjeksiyon sistemi 7 geliştirilmiş bir versiyonu ile, 1 saat içinde aynı hücre aşamasında hemen hemen tüm 2500 yumurta kadar enjekte etmek mümkündür. Bu güncellemeler ve geliştirilmiş yazılımı ile bir okuyabilirisiniz olarak bakteriyel çoğalması ile büyük ilaç ekranlar gerçekleştirmek için kullanılabilecek önceden mümkün olandan daha fazla yumurta enjekte etmek mümkündür. Bununla birlikte, bu yöntem yine enjeksiyon, Benard ve arkadaşları tarafından tarif edilen, örneğin diğer enjeksiyon yolları sarısı ile sınırlıdır. (2012) 6, umarım yakın gelecekte otomatik mikro-enjeksiyon sistemine dahil edilecektir.

<Bu yöntemler zebrafish tarama için Benchmarking rağmen p class = "jove_content">, hem de diğer balık türleri ile uygulamalar için yararlı olacaktır. Örneğin, ortak sazan ilaç ekranlar için avantajlara sahip olduğu gösterilmiştir. Zebra balığı gibi, yumurta ve ortak sazan erken evre embriyolar şeffaf ama yüz binlerce yumurta ve daha sabit bir genetik zemini 16 teklif kendilenmiş hatlarının kullanılabilirliği geniş spawn boyutu ana avantajı ile vardır.

Enfekte embriyolarının büyük miktarlarının analizi sitometresi yüksek miktarda, büyük bir tanecik akışı ile yapılır. Bu cihaz, sıralama çok gözlü levhalar ya da bileşiklerin çok sayıda test edilmesi için özellikle uygun hale getiren bir Petri kabı içine embriyolar analiz edilebilir. Daha yüksek bir görüntüleme çözünürlük gerekli ise, kurulum tekniği sitometresi büyük bir tanecik akış ön tarama için kullanılabilecek bir şekilde adapte edilmiş ve daha sonra da ortam ile örnekleri analiz edilir dahayüksek çözünürlükte koydu. Bu Omurgalı otomatik tarama Teknolojisi 17, 18 kullanılarak yapılabilir. Bu cihaz, otomatik, çok oyuklu bir plaka veya toplu bir kap, resim CLSM veya stereo mikroskobu kullanarak bir kılcal boyunca 360 ° 'den 2 ve 7 gün sonra fertilizasyon arasında canlı ya da sabit embriyolar toplayıp göre embriyoların manuel ayırma sağlayan 2 dökme kaplarda tekrar bertaraf edebilir mikroskopik görüntülerde. Gelecek gelişmeler bu nedenle mümkün CLSM ile, zaman içinde embriyo otomatik olarak çok sayıda taranması için yapım çok iyi plaka içine görüntüleme sonra embriyonun sıralama sağlayacaktır. Gelecekteki uygulamalarda Omurgalılar Otomatik tarama Technology sistemi, aynı zamanda, çok gözlü levhalar içine önce dağıtma larvalarının gerek kalmadan teknoloji sitometresi büyük bir tanecik akımının bağlanabilir varsayılarak, daha gelişmiş bir sıralama yol açacaktır.

Bu kağıt tesis bir açıklarS. incelemek için yüksek bir verim kurulum d optimizasyonu epidermidis ve M. ilaç keşfi için bir model olarak marinum enfeksiyonu. Bu yumurta sarısı enjekte bu bakterilerin sonucu enjeksiyonu da yumurta gelişim aşamasına bağlı olduğunu göstermektedir. M. enjekte 16-128 hücre aşamasında ya da 16-64 hücre aşamasında M gerilimde marinum E11 kuyruk damarı enjeksiyonu 2, 6 ile aynı enfeksiyon ortaya çıkarır. Ancak bu kurulum sadece bakteriyel patojenlerin çoğalması ile sınırlı değildir. Bu robot, sırasıyla, 13, aşırı ifadesi ve gen knock-down çalışmaları genetik dönüştürme için DNA, RNA veya morpholinos içeren çözeltiler enjekte mümkün olduğu daha önce gösterilmiştir. Ayrıca, bu kurulum, kanser hücresi çoğalma ve yer değiştirme çalışmaları için yararlı olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu boru hattı bağlamında sinyal çeşitli mekanizmalar yüksek verimli taramalar için çok yönlü bir yöntem sunardoğuştan gelen bağışıklık, enfeksiyon hastalıkları ve kanser gelişimine uygulanır. Bu ekranlar ilaç keşfi için başkaları ile değil, aynı zamanda tespit uygulanabilir ilaçların olası toksik etkileri analizi ile kombine edilebilir.

Disclosures

JS Bu makalede kullanılan aletleri üreten Yaşam Bilimi Yöntemleri BV'nin sahibi.

Acknowledgments

Biz S. ile bize sağlamak için Leonie de Boer ve Bas Zaat (Academic Medical Centre) minnettarız epidermidis O-47 suşu. Biz COPAS XL ve GENİŞ BioImager analizi ile yardım ve tavsiye için Rico Bongaarts, Francis Smet ve Angela COMAS (Union Biometrica) teşekkür ederim. Biz balık kapıcılık ve yararlı tartışmalar için Leiden Üniversitesi'nden diğer meslektaşları için Davy de Witt, Ulrike Nehrdich ve Laura van Hulst teşekkür ederim. Bu araştırma Biyomedikal Malzeme Enstitüsü, Ekonomik İşler Hollandalı Bakanlığı tarafından ortaklaşa finanse edilen araştırma programının Proje P5.03 IBIZA bölümünü oluşturur ve Ekonomik İşler Hollanda Bakanlığı Smart Mix Programı (NWOA_6QY9BM) ve bir Eğitim, Kültür ve Bilim Bakanlığı, Hollanda. Ek destek AB projesi ZF-Sağlık (FP7-Sağlık-2009-242048) elde edilmiştir, ve RMJ AB Başlangıç ​​Eğitim Ağı FishForPharma (PITN-GA-201 Tecrübeli Araştırıcı olarak Marie Curie bursu ile desteklenmiştir1-289209). SJR 115.337 ° hibe anlaşması n altında Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Teşebbüsün fon aldı, kaynakların hangi Avrupa Birliği'nin Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ve tür contribution.The yazarların EFPIA şirketlerden daha fazla kabul mali katkı oluşmaktadır robotik için Leiden Üniversitesi Fonu (LUF) dan ve Cyttron gelen mali destek, sırayla mali görüntüleme tesisleri için Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü tarafından desteklenen Besluit Sübvansiyonlar Investeringen Kennisinfrastructuur programda. COPAS sistem edinimi kısmen Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO, 834.10.004) mali yardımı ile Dünya'da ve Yaşam Bilimleri (ALW) için Bölümü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Middlebrook 7H10 agar BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 262710
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 271310
BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211886
BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA 211887
LB agar Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L5542 Multiple suppliers
LB broth Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA L3022 Multiple suppliers
Chloramphenicol Bio-connect, Huissen, the Netherlands 16785.03 Multiple suppliers
Hygromycin Bio-connect, Huissen, the Netherlands 25966.01 Multiple suppliers
Tween-80 Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA P1754 Multiple suppliers
Polyvinylpyrrolidone40 Calbiochem, San Diego, California, USA 529504 Multiple suppliers
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA A5040
Agarose Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands S103 Multiple suppliers
Instant ocean sea salt Sera Marin, Heinsberg, Germany 5460
iSPAWN Techniplast, Buguggiate, Italy iSPAWN
Automated microinjection system Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands Automated microinjection system
Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA COPAS XL
Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager) Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA VAST BioImager
LP Sampler Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA LP Sampler
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SL
Injection needle 10 µm inner diameter Qvotek, Mississauga, Canada

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
  3. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
  4. Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
  5. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
  6. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. , (2012).
  7. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  8. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  9. Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
  10. Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
  11. Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
  12. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  13. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  14. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
  15. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  16. Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
  17. Chang, T. -Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
  18. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).

Tags

Enfeksiyon Sayı 88 Zebra, Otomatik enjeksiyon yüksek kapasiteli tarama COPAS XL VAST BioImager konak-patojen etkileşimi ilaç ekran CLSM
Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veneman, W. J., Marín-Juez, R., … More

Veneman, W. J., Marín-Juez, R., de Sonneville, J., Ordas, A., Jong-Raadsen, S., Meijer, A. H., Spaink, H. P. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), e51649, doi:10.3791/51649 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter