Summary
的飞行（MALDI-TOF）质谱（MS），直接向血培养肉汤基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱的应用加快细菌的鉴定。该方法是一种快速和可靠的方法，可直接从血培养肉汤鉴定革兰氏阴性细菌。
Abstract
临床微生物学实验室的一个重要作用是提供快速鉴定细菌，导致血液感染的。传统的识别需要信号血培养肉汤识别可用的亚文化不仅已经成熟后，在固体琼脂菌落。 MALDI-TOF MS是用于识别大多数临床相关的细菌时，适用于菌落在固体培养基上可靠的，快速的方法。 MALDI-TOF MS直接到血培养液中的应用是一个有吸引力的方法，因为它有潜力加速了细菌的种属鉴定，提高临床管理。然而，要克服的一个重要问题是，在分析前除去包含在血培养标本，如不去除，干扰MS谱，并可能导致判别识别分数不足或低干扰的树脂，蛋白质和血红蛋白。此外，有必要集中硝化细菌IA开发足够的质量谱。该方法描述了浓缩，纯化和提取的革兰氏阴性细菌，允许从一个信号血液培养液中的早期识别细菌。
Introduction
由于细菌患者的血流感染（BSI）继续有较高的住院死亡率，范围从6-48％1。适当的经验性抗生素交付促进生存和在严重脓毒症患者的子集，每个小时的延迟，以适当的治疗相关的生存2,3下降。因此，临床实验室的主要目标是快速检测，识别和沟通细菌在血培养存在的，告知临床决策。它已经证明，微生物实验室对抗菌治疗在报告的革兰氏染色4，最近的一次影响最大，观察研究证明，飞行质谱基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）直接在血培养液进行影响超过三分之一BSI引起的革兰阴性菌5订明。
，6,7微生物的鉴定。该技术是目前公认，并已集成到许多实验室进行快速准确的识别微生物中分离固体培养基上6,8。直接应用MALDI-TOF MS对血培养（BC）的肉汤已经表示“积极”的微生物，因为获得低成本的早期识别微生物的潜在的临床医生和实验室管理人员的上诉。
直接应用MALDI-TOF MS的血培养液的临床应用已被广泛观察到的灵敏度，当与鉴定标准表型文化为基础的方法，以成功识别革兰阴性菌不等的报告相比，限制从47-98.9 ％9-11。在灵敏度的变化可能涉及对BC肉汤组成，初始细菌浓度，变化的样品制备方法，以及在研究人群9中遇到的革兰氏阴性生物体的数组。与这些其他的发布的协议相比，这里提出的方法可避免使用乙醇，氯化铵或附加的（非矩阵）乙腈。其结果是将细菌沉淀将保持存活（直到蛋白提取的点），允许潜在敏感性表型试验方法，可直接应用于这些微生物在液体培养基。此外，所提出的方法已经被证明是便宜的，可靠的，快速，细菌鉴定内的血培养物革兰氏染色结果25分钟内可用的，以最小的手上的时间12。
这种方法是利用甲酸提取一个简单的内部自旋裂解方案直接应用到血培养阳性肉汤识别革兰氏阴性bacteria与MALDI-TOF MS技术。
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Protocol
1，血培养液标为“正”
- 从连续监测温育箱中取出信号血培养瓶，并把它变成一个生物安全柜。注意：瓶可以含有有害微生物和普遍预防需要遵循。由于采样传染性气溶胶的危险性，所有抽样程序必须在生物安全II级层流柜中进行。
2，革兰氏染色准备
- 从信号血培养肉汤按当地机构的协议准备革兰氏染色。注意：当革兰氏阴性生物体的显微鉴定的血培养液处理为每个下面的方法。当革兰氏阳性菌鉴定，基因靶向识别和抗性标记另一种分子生物学方法应用于肉汤（本文中未提及）13。
- 轻轻颠倒2-3倍混合血培养瓶。
- 在生物安全柜连接10 ml注射器的安全血液传输设备。
- 附加的血液转移装置至血液培养瓶和撤回将5ml培养液进入注射器。转让吸气公元前清汤倒入血清分离管。
血培养液对4。浓度
- 离心血清分离管中以1250×g离心15分钟，除去大量的红血细胞。
- 吸出物，并用无菌移液管小心离开紧接凝胶/液体界面上方大约1毫升的血沉棕黄层的弃上清。注意：需氧瓶显示的红血细胞的明确分离到管的底部与凝胶/液界面出现白色不透明的颜色。相反，当加到凝胶/液体界面显示为深红色由于裂解红血细胞成分在上清液中余下的悬浮裂解厌氧血培养肉汤。
5，重复离心洗涤步骤
- 轻轻混合，最后加入1ml的血沉棕黄层的流体上面的凝胶界面，用无菌移液管，然后将整个体积转移到1.5ml的离心管中。离心新管中于288×g离心30秒。
- 使用一次性塑料1毫升移液管插入一个新的1.5 ml微量离心管转移上清液并丢弃管与沉淀。注意：这是在该步骤中小心地避免粒料的转移是至关重要的。这是用于从厌氧公元前瓶子被处理的上清液仍颜料和颗粒并不总是清楚地看到试样尤为重要。
残余细胞6。裂解
细菌蛋白质的7。提取
- 吸弃上清液，用吸用细尖吸管确保尽可能多的液体尽量除去了。
- 重悬沉淀于10μl甲酸（70％V / V）。注：甲酸可影响身体，如果它被吸入或者如果它与皮肤接触。在准备或操作的解决方案是为recommended员工使用通风柜除了个人防护装备。
- 拌匀使用移液管，以确保均匀的悬浮液。使用移液管尖端的物理破坏的颗粒可能是必要的，以确保更均匀的溶液。
8，准备MALDI-TOF的目标板
- 接种干净的MALDI-TOF靶板与2μl每个目标点的准备暂停。制备3靶位点的每个样品，以克服失败读取偶然问题。
- 让MALDI-TOF靶板干燥。干燥速率可以增大通过将板放在通风橱中的边缘，以最大化整个板的气流。
- 覆盖各干燥点与1微升的基质溶液（10 mg / ml的α-氰基-4 - 羟基肉桂酸（HCCA），50％乙腈，2.5％三氟乙酸）。注：基质溶液可以影响身体，如果它被吸入或者如果它进入其所含克拉皮肤。在准备或操作的解决方案，建议员工使用通风柜除了个人防护装备。
- 允许的MALDI-TOF靶板上干燥，如上所述的烟橱的边缘。确保均匀制剂填充每个平板上的目标点。
9。地方MALDI-TOF靶板进入质谱仪
- 将MALDI-TOF目标板进入MALDI-TOF质谱仪。确保板坐在弹簧加载板齐平。注意：请不要将目标板，直到所有的目标点都干。
- 确保橡胶密封件是干净的线头，灰尘和毛发，使可以创建所需的真空条件。
- 关闭MALDI-TOF阶段盖子，然后按下仪器前面的“输入/输出”按钮。盖子现在将锁定并允许创建必要的真空度。
10，MALDI-TOF MS Spectra收购
- 打开MALDI生物分型和FlexControl软件。
- 内的打字软件请从下拉菜单中选择“新分类”标题为“文件”。将项目命名，然后选择“新建”。选择“下一步”的打字软件内完成设置。
- 在控制软件窗口识别屏幕上的图形目标板。突出显示MALDI-TOF目标点正在使用通过移动鼠标在接种点，同时按住鼠标左键。
- 用鼠标右键单击任意位置上选定的目标位置，然后选择从下拉菜单中选择“添加分析物”。
- 加血培养鉴定的详细信息的“ID”列中为每个目标点，然后点击“下一步”完成时。
- 选择商业“分类学”光谱数据库，然后选择“下一步”。注：Labo的ratories可以利用额外的内部或商业数据库，以提高参考光谱的数目。
- 点击“完成”和MALDI-TOF MS将开始产生光谱。注意：MALDI-TOF设置为按制造商的设定（线性正模式，60赫兹激光频率，20千伏的加速电压，16.7千伏电压IS2，170毫微秒的提取延迟和2,000-20,137 m / z范围）。
- 如果MALDI控制软件无法生成的山峰，人工采集的光谱可以进行（没有描述的方法）。
11发布分析MALDI-TOF MS分数的解释
- 一旦光谱采集和分析完成后，请在打字的软件旁边的物种鉴定的“+”按钮，展开对每个目标的识别列表。
- 研究了前5名标识，并指出，如果前5名是相似的。不和谐的前5个属，分数≥1.7相同的目标点引发混合肉汤的可能性。注：MALDI-TOF技术具有敏感性差检测混合肉汤。例如，当发酵液包含混合物种高置信度得分可以被识别为混合种中的一种。
- 当得分≥2.0是注意到在目标点的最高匹配，报告该物种。
- 当最高得分上的目标点为≥1.7，但<2.0，只报告了属。如果前5名标识的附加条件是一致的，然后向种的水平。
12，去除MALDI-TOF靶板
- 当所有的光谱是完全按MALDI-TOF机器上的“IN / OUT”按钮。
- 打开MALDI-TOF靶板插座和移除MALDI-TOF靶板。
- 如果使用的是可重复使用的MALDI-TOF靶板，用酒精清洁所有目标点和MALDI-TOF板储存在室温，一旦它的清洁和干燥。
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Representative Results
所生成的MALDI-TOF MS谱进行比较，以光谱的集成参考数据库。对数分数分配给测试分离和参考数据库隔离之间的比赛的信心，用分数≥1.7所需的鉴定可能要属水平（ 图1），≥2.0为可能的识别物种（ 图的建议2）。报告以种的水平时，得分≥1.7和所述第一5标识所匹配的打字软件是一致的（ 图1）12。图3演示了当混合物种的血培养液进行分析的结果，在这种情况下， 大肠埃希氏菌和沙雷氏菌属沙雷氏菌 。注意前5匹配的光谱是不和谐的。先前已表明，混合属将只通过该方法在混合的肉汤12的约30％的确定。要知道，用混合培养液，可以是很重要的一个单一物种的具有高置信度得分。 表1总结了从该方法的验证研究先前公布的结果，其中单一菌血症肉汤91.8％达到了一致的报告在MALDI-TOF评分> 1.7，与100％和97.0％的一致性属的和种，分别为12。
图1的MALDI-TOF MS谱产生大肠杆菌与对数得分1.861。右边是确定的打字软件的前5场比赛。需要注意的是该品种始终报告为大肠杆菌 。随着1.861的得分，并与前5场比赛是E。大肠杆菌识别被认为是可靠物种水平12。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图2的MALDI-TOF MS谱产生铜绿假单胞菌具有对数得分2.216。右边是确定的打字软件的前5场比赛。需要注意的是该品种始终报告为绿脓杆菌。随着高分2.216鉴定被认为是可靠的鉴定种的水平。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图3：MALDI-TOF MS谱产生的含有大肠杆菌和粘质沙雷氏菌的混合血培养肉汤。右侧有确定的打字软件，在第5匹配的光谱报告既大肠杆菌和粘质沙雷氏菌的第5场比赛。这种混合属仅发现约三分之一的混合肉汤培养物12。软件在未来的改进版本可能会提高混合培养物的检测。 请点击此处查看该图的放大版本。
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比较MALDI-TOF MS的表1。验证数据直接进行血液培养液中，随后表型鉴定上继代培养的菌落。谐和识别所需要的质谱得分对血培养肉汤≥1.7。此表是改编自一个以前的出版物12。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
运用MALDI-TOF MS到后离心步骤都与足够的照顾不进行重新混合分离的成分血培养肉汤时，这一点很重要。特别重要的是，除去血培养成分和人类细胞的蛋白质，包括血红蛋白，这可能会产生尖峰与MALDI-TOF光谱干扰。
虽然MS制造商推荐切得分≥2.0的物种和≥1.7，属鉴定，其他报告表明较低的对数得分（范围≥1.4至≥1.6）时，适用于公元前肉汤10,12,14-18可以实现。在临床微生物实验室较低MS鉴定成绩的实施，才考虑下面的适当地方监管和验证程序。
通过这种方法，它要么不匹配所产生的差的情况的光谱，或报告与升OW信心分数。执行重复或一式三份的斑点为每个分离物可以减少重复该实验时，单点失效的不便。偶尔，所有重复的点不会进球足以识别。穷人查明病因可能是由于不完整的数据库集，或更常见，如细菌在血培养肉汤低起始浓度的结果。在对所提出的方法<1.7时遇到的临床分离株的8％，并有轻微的优势在厌氧血培养瓶12时执行的分数已发布的验证集。
MALDI-TOF MS技术是无法分开，即使被隔绝在固体介质中的所有临床上遇到的革兰氏阴性细菌。例如， 大肠杆菌大肠杆菌不会从志贺氏菌属物种区别和沙门氏菌属，不能speciated。作为结果概括的是要认识th是重要直接在血液培养液使用MALDI-TOF当在用于检测混合物种的灵敏度低11,12,18,19。
总体而言，这种方法提供了一种快速，廉价且可靠的方法，用于识别革兰氏超过90％内的血培养肉汤信令的25分钟内血培养阴性菌株。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer - Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 ml | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 ml) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod'hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel,, et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
