Summary
L'applicazione di desorbimento laser assistita da matrice tempo / ionizzazione di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa (MS) direttamente emocoltura brodo velocizza l'identificazione dei batteri. Il metodo proposto è un metodo rapido e affidabile per l'identificazione dei batteri Gram negativi direttamente dalla cultura sangue brodo.
Abstract
Un ruolo importante del laboratorio di microbiologia clinica è quello di fornire una rapida identificazione dei batteri che causano infezioni flusso sanguigno. L'identificazione tradizionale richiede la sub-cultura del segnalato brodo di coltura di sangue con l'identificazione disponibili solo dopo colonie su agar solido hanno maturato. MALDI-TOF MS è un metodo rapido affidabile per l'identificazione della maggioranza dei batteri clinicamente rilevanti quando applicato colonie su supporti solidi. L'applicazione di MALDI-TOF MS direttamente alla cultura del sangue brodo è un approccio interessante in quanto ha il potenziale di accelerare l'identificazione delle specie di batteri e migliorare la gestione clinica. Tuttavia, un problema importante da superare è la rimozione pre-analisi di interferenti resine, proteine e di emoglobina contenute nei campioni di sangue di cultura che, se non rimosso, interferiscono con la MS spettri e può portare a punteggi di identificazione discriminazione insufficienti o bassi. Inoltre è necessario concentrare Bacteria per sviluppare spettri di qualità sufficiente. Il metodo presentato descrive la concentrazione, la purificazione e l'estrazione dei batteri Gram-negativi che consentano l'identificazione precoce dei batteri da un segnalata cultura sangue brodo.
Introduction
I pazienti con infezione sangue (BSI) a causa di batteri continuano ad avere alta mortalità in ospedale, che vanno 6-48% 1. La consegna di un adeguato antibiotica empirica promuove la sopravvivenza e nel sottogruppo di pazienti con sepsi grave, ogni ora di ritardo alla terapia appropriata è correlato alla diminuzione della sopravvivenza 2,3. Di conseguenza, un obiettivo chiave del laboratorio clinico è quello di rilevare rapidamente, identificare e comunicare la presenza di batteri nelle colture di sangue per informare le decisioni cliniche. È stato dimostrato che il laboratorio microbiologia ha la più grande influenza sulla terapia antimicrobica al momento di segnalare la colorazione di Gram 4 e recentemente, uno studio d'osservazione ha dimostrato che il tempo desorbimento laser assistita dalla matrice / ionizzazione di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) eseguita direttamente sul brodi di coltura di sangue influenzare la prescrizione in oltre un terzo di BSI causate da batteri Gram-negativi 5.
6,7. La tecnologia è ormai ben consolidata ed è stato integrato in molti laboratori per l'identificazione rapida e accurata dei microrganismi isolati su supporti 6,8 solida. L'applicazione diretta di MALDI-TOF MS alla cultura del sangue (BC) brodo che hanno segnalato "positivo" per i microrganismi appello a entrambi i medici e responsabili di laboratorio a causa della possibilità di ottenere la tempestiva individuazione dei microrganismi a basso costo.
L'utilità clinica di applicazione diretta di MALDI-TOF MS alla cultura del sangue brodo è stato limitato dalla vasta gamma di sensibilità osservati rispetto ai metodi di coltura fenotipica standard di base di identificazione, con i rapporti di identificazione successo dei batteri Gram-negativi che vanno 47-98,9 9-11%. La variazione di sensibilità probabilesi riferisce alla composizione aC brodo, concentrazione batterica iniziale, variazione nei metodi di preparazione del campione e la gamma di microrganismi Gram-negativi riscontrati in popolazioni di studio 9. Rispetto a questi altri protocolli pubblicati il metodo qui presentato evita l'uso di etanolo, cloruro di ammonio o aggiuntivo (non a matrice) acetonitrile. Come risultato il pellet batterico rimanere vitali (fino al punto di estrazione delle proteine) consentendo potenziali metodi di prova sensibilità fenotipica da applicare direttamente a questi organismi in brodo. Inoltre, il metodo presentato ha dimostrato di essere poco costoso, affidabile e rapido con identificazione batterica disponibile entro 25 min delle emocolture Gram risultati della colorazione, con minime 'mani' tempo 12.
Questo metodo è un semplice protocollo spin-lisi in casa utilizzando estrazione acido formico applicato direttamente positivi brodi di coltura sangue per identificare Gram negativi bacteria con la tecnologia MALDI-TOF MS.
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Protocol
1. Sangue Cultura Brodi Segnala come "Positive"
- Rimuovere il flacone cultura sangue segnalata dal cabinet monitoraggio incubazione continuo e posizionarlo in una cappa di sicurezza biologica. Nota: Le bottiglie possono contenere microrganismi pericolosi e precauzioni universali devono essere seguite. A causa del rischio di aerosol infettivi di campionamento, tutte le procedure di campionamento devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare sicurezza biologica di classe II.
2. Gram Stain è preparato
- Preparare una colorazione di Gram dal segnalata brodo di coltura del sangue come da protocolli istituzionali locali. Nota: Quando microrganismi Gram-negativi sono identificati in microscopia brodo di coltura del sangue viene elaborata secondo il metodo seguente. Quando organismi Gram-positivi sono identificati, un metodo alternativo di targeting molecolare identificazione genetica e marcatori di resistenza viene applicata al brodo (non affrontato in questo articolo) 13.
- Mescolare delicatamente il flacone cultura sangue invertendo 2-3x.
- All'interno dell'armadio biosicurezza allegare una siringa da 10 ml per un dispositivo di trasferimento di sangue sicurezza.
- Fissare il dispositivo di trasferimento di sangue al flacone di coltura sangue e prelevare 5 ml di brodo nella siringa. Trasferire il BC brodo aspirato in un tubo separazione del siero.
4. Concentrazione di Sangue brodo di coltura
- Centrifugare la provetta separazione del siero a 1.250 xg per 15 min che rimuove un grande volume di globuli rossi.
- Aspirare e scartare il surnatante con una pipetta di trasferimento sterile facendo attenzione a lasciare circa 1 ml di buffy coat immediatamente sopra l'interfaccia gel / liquido. Nota: Le bottiglie aerobici mostrano una netta separazione dei globuli rossi al fondo del tubo con l'interfaccia gel / liquido apparire un colore bianco opaco. Al contrario, quandoapplicata al brodo di coltura anaerobica litico sangue dell'interfaccia gel / liquido appare come un colore rosso intenso, grazie ai componenti di globuli rossi lisati rimanendo sospesi nel supernatante.
5. Ripetere centrifugazione Lavare Steps
- Mescolare delicatamente ultimi 1 ml di buffy coat fluido sopra l'interfaccia gel con una pipetta sterile e poi trasferire l'intero volume in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifugare la nuova provetta a 288 xg per 30 sec.
- Trasferire il surnatante con una usa e getta 1 ml pipetta di plastica in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il tubo con il pellet. Nota: è fondamentale in questa fase che si ha cura di evitare il trasferimento del pellet. Ciò è particolarmente importante per un campione da lavorare dalla bottiglia BC anaerobica come il surnatante rimane pigmentata e il pellet non è sempre chiaramente visibile.
6. Lisi di cellule residue
7. Estrazione di proteine batteriche
- Aspirare e scartare il surnatante, sempre con l'aspirazione con una pipetta punta fine in modo che quanto più liquido possibile, viene rimosso.
- Risospendere il pellet in 10 ml di acido formico (70% v / v). Nota: Acido formico può influenzare il corpo se viene inalato o se non viene a contatto con la pelle. Durante la preparazione o soluzioni manipolazione è recommended che il personale utilizza un aspiratore oltre a dispositivi di protezione individuale.
- Mescolare bene con la pipetta per garantire una soluzione risospeso omogenea. Utilizzando la punta della pipetta per interrompere fisicamente il pellet può essere necessaria per garantire una soluzione più omogenea.
8. Preparazione di MALDI-TOF target Piatto
- Seminare una piastra segnale MALDI-TOF pulita con 2 ml di sospensione preparata per ogni posto di destinazione. Preparare tre siti bersaglio per ogni campione per superare il problema occasionale di riuscita legge.
- Lasciare che la piastra segnale MALDI-TOF ad asciugare. La velocità di essiccazione può essere aumentata inserendo la piastra sul bordo della cappa per massimizzare il flusso d'aria attraverso la piastra.
- Sovrapporre ogni spot essiccato con 1 ml di soluzione di matrice (/ ml di acido α-ciano-4-idrossicinnamico 10 mg (HCCA), 50% di acetonitrile, 2,5% di acido trifluoroacetico). Nota: la soluzione Matrix può influenzare il corpo se viene inalato o se entra in Contact con la pelle. Durante la preparazione o la manipolazione di soluzioni, si raccomanda che il personale utilizza un aspiratore oltre a dispositivi di protezione individuale.
- Lasciare la piastra segnale MALDI-TOF asciugare sul bordo della cappa come descritto sopra. Assicurare un preparato omogeneo riempie ciascuno dei punti di riferimento sul piatto.
9. Luogo MALDI-TOF piastra bersaglio nello spettrometro di massa
- Inserire la piastra segnale MALDI-TOF nello spettrometro di massa MALDI-TOF. Assicurarsi che la piastra è seduto contatto con le piastre a molla. Nota: non inserire la piastra di mira fino a quando tutti i punti di riferimento sono asciutti.
- Assicurarsi che la guarnizione in gomma sia pulita di lanugine, polvere e peli di consentire possono essere create le condizioni di vuoto richieste.
- Chiudere il coperchio fase MALDI-TOF e quindi premere il tasto "in / out" sulla parte anteriore dello strumento. Il coperchio sarà ora bloccare e consentire il vuoto necessario da creare.
10. MALDI-TOF MS Spectra Acquisition
- Aprire il MALDI biotipizzazione e software FlexControl.
- All'interno del software Typing selezionare "nuova classificazione" dal menu a discesa intitolato "file". Assegnare un nome al progetto e quindi selezionare "nuovo". Selezionare "Avanti" per completare l'installazione all'interno del software Typing.
- All'interno della finestra del software di controllo di identificare l'immagine sullo schermo della piastra di mira. Evidenziare i punti di destinazione MALDI-TOF che sono in uso spostando il mouse sopra i punti inoculati tenendo premuto il tasto sinistro del mouse.
- Utilizzare il pulsante destro del mouse per fare clic su un punto qualsiasi delle posizioni di destinazione selezionati e quindi selezionare "aggiungi analiti" dal menu a discesa.
- Aggiungi cultura del sangue estremi identificativi alla colonna "ID" per ciascuno dei luoghi di destinazione e fare clic su "Avanti" una volta completato.
- Selezionare "tassonomia" banca dati spettri commerciali e selezionare "Avanti". Nota: Laboratori possono utilizzare ulteriori internamente o database commerciali per aumentare il numero di spettri di riferimento.
- Fare clic su "Fine" e il MALDI-TOF MS avrà inizio la generazione di spettri. Nota: le impostazioni MALDI-TOF erano per le impostazioni del produttore (in modalità lineare positiva, 60 di frequenza laser Hz, 20 kV tensione di accelerazione, 16,7 kV di tensione IS2, 170 di ritardo estrazione ns, e 2,000-20,137 gamma di m / z).
- Se il software di controllo MALDI non riesce a generare picchi, acquisizione di spettri manuale può essere eseguita (metodo non descritto).
11. Analisi post Interpretazione dei MALDI-TOF MS Scores
- Una volta gli spettri vengono acquisiti e l'analisi è completa, selezionare il pulsante "+" accanto alla identificazione delle specie sul software Typing per espandere l'elenco di identificazione per ogni target.
- Studiare i primi 5 identificazioni, notando se la top 5 sono simili. Discordanti primi 5 generi con punteggi ≥ 1.7 dello stesso obiettivopunto sollevato la possibilità di brodi misti. Nota: la tecnologia MALDI-TOF ha scarsa sensibilità per il rilevamento di brodi misti. Ad esempio, quando un brodo misto contiene specie un punteggio elevato fiducia può essere identificato solo per una delle specie miste.
- Quando un punteggio ≥ 2.0 è nota per la partita più alta in un luogo di destinazione, riportare la specie.
- Quando il punteggio più alto in un punto bersaglio è ≥ 1.7, ma <2,0, riportano solo i generi. Se criteri aggiuntivi dei primi 5 identificazioni sono concordanti, poi riferire a livello di specie.
12. Rimozione di MALDI-TOF target Piatto
- Quando tutti gli spettri sono complete premere il tasto "in / out" sulla macchina MALDI-TOF.
- Aprire la piastra di mira ricettacolo MALDI-TOF e rimuovere la piastra bersaglio MALDI-TOF.
- Se si utilizza una piastra segnale MALDI-TOF riutilizzabili, puliti tutti i punti di destinazione utilizzando alcool e conservare la piastra MALDI-TOF a temperatura ambiente una volta che è pulita e asciutta.
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Representative Results
Il generata MALDI-TOF MS spettri vengono confrontati con il database di riferimento integrato di spettri. Un punteggio logaritmica viene assegnato per la fiducia del match tra l'isolato di prova e il database di riferimento isolati, con la raccomandazione di un punteggio ≥ 1.7 richiesto per probabile identificazione a livello di generi (figura 1) e ≥ 2.0 per probabile l'identificazione di specie (Figura 2). Relazione al livello di specie quando il punteggio ≥ 1.7 e le prime 5 identificazioni abbinato dal software Typing è coerente (Figura 1) 12. Figura 3 mostra il risultato quando un brodo di coltura di sangue di specie miste viene analizzata, in questo caso Escherichia coli e Serratia marcescens. Nota: i primi 5 spettri abbinati sono discordanti. È stato precedentemente dimostrato che generi misto sarà identificato solo con questo metodo in circa il 30% dei brodi misti 12. È importante tenere presente che con un brodo misto è possibile per un rapporto costante di una singola specie con un punteggio elevato fiducia. Tabella 1 riassume i risultati precedentemente pubblicati dallo studio verifica di questo metodo in cui 91,8% di brodi monomicrobial raggiunto un punteggio MALDI-TOF di> 1.7, con il 100% e il 97,0% concordanza di genere e specie, rispettivamente, 12.
Figura 1. L'MALDI-TOF MS generato spettri di Escherichia coli con un punteggio logaritmica di 1.861. A destra è il primo 5 partite individuate dal software Typing. Si noti che la specie è costantemente riportato come Escherichia coli. Con il punteggio di 1,861 e con le prime 5 partite essendo E. coli l'identificazione è considerato affidabile a livello di specie 12. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. L'MALDI-TOF MS generato spettri di Pseudomonas aeruginosa con un punteggio di 2,216 logaritmica. A destra è il primo 5 partite individuate dal software Typing. Si noti che la specie è costantemente segnalato come Pseudomonas aeruginosa. Con l'alto punteggio di 2,216 identificazione è considerato affidabile a livello di specie di identificazione. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'MALDI-TOF MS generato spettri di un brodo di coltura di sangue misto contenente Escherichia coli e Serratia marcescens. A destra sono le prime 5 partite individuate dal software Typing che riporta sia Escherichia coli e Serratia marcescens nei primi 5 spettri abbinato . Questa generi misto viene identificata solo in circa un terzo dei brodi di coltura miste 12. Migliorate versioni del software in futuro potrebbero migliorare l'individuazione di colture miste. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Dati della tabella 1. Verifica confrontando MALDI-TOF MS eseguiti direttamente sulla cultura del sangue brodo con successiva identificazione fenotipica sulle colonie subcultura. Identificazione concordante richiesto un punteggio di spettrometria di massa sulla cultura sangue brodo ≥ 1.7. Questa tabella è adattato da una pubblicazione precedente 12. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
E 'importante quando si applica MALDI-TOF MS alla cultura del sangue brodo che le operazioni di post centrifugazione vengono eseguite con sufficiente attenzione a non rimescolare i componenti separati. È particolarmente importante rimuovere i componenti di coltura sangue e proteine cellulari umani, compresi emoglobina, che possono produrre picchi interferenti con gli spettri MALDI-TOF.
Anche se MS produce consiglia di tagliare punteggio ≥ 2.0 per le specie e ≥ 1.7 per l'identificazione genere, altri rapporti hanno suggerito punteggi logaritmiche inferiori (range ≥ ≥ 1.4 a 1.6) può essere attuato quando applicato a BC brodo 10,12,14-18. L'attuazione di punteggi più bassi di identificazione MS in laboratori di microbiologia clinica deve essere considerato solo dopo adeguate procedure di regolamentazione e di convalida locali.
Spettri occasionalmente poveri sono generati da questo metodo non sono o abbinata, o sono segnalati con low punteggi di confidenza. Esecuzione di due o tre esemplari punti per ogni isolato può ridurre il disagio di ripetere l'esperimento, quando un singolo punto non riesce. Raramente, tutti i punti duplicati non segnerà sufficiente per l'identificazione. La causa della scarsa identificazione può essere dovuto a insiemi di database incompleti, o più comunemente, a causa di una bassa concentrazione iniziale di batteri nel brodo di coltura sangue. In un set di validazione pubblicato per il metodo presentato un punteggio di <1,7 è stato rilevato l'8% degli isolati clinici e aveva una leggera predominanza se eseguito in flaconi di emocolture anaerobi 12.
La tecnologia MALDI-TOF MS è in grado di separare tutti i batteri Gram-negativi clinicamente riscontrate anche quando isolato su terreni solidi. Ad esempio, E. coli non viene distinta dalla specie Shigella e generi Salmonella non può essere speciato. Come evidenziato nei risultati, è importante riconoscere tha quando si utilizza MALDI-TOF direttamente sulla cultura del sangue brodo la sensibilità per il rilevamento di specie miste è basso 11,12,18,19.
Nel complesso, questo approccio offre un metodo rapido, economico e affidabile per identificare oltre il 90% dei batteri Gram negativi isolati cultura sangue entro 25 minuti di una segnalazione cultura sangue brodo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer - Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 ml | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 ml) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
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