Summary
Нарушения обмена веществ являются одним одним из наиболее распространенных заболеваний у людей. Генетически послушный модель организма Д. MELANOGASTER могут быть использованы для идентификации новых генов, которые регулируют обмен веществ. Эта статья описывает относительно простой метод, который позволяет изучать скорость метаболизма у мух путем измерения их производство CO 2.
Abstract
Нарушения обмена веществ часто являются проблемой, затрагивающей здоровье человека. Таким образом, понимание механизмов, которые регулируют обмен веществ является одним из важнейших научной задачей. Многие гены болезнетворные у человека есть летать гомолог, что делает дрозофилы хорошей моделью для изучения сигнальных путей, участвующих в развитии различных заболеваний. Кроме того, уступчивость дрозофилы упрощает генетические экраны, чтобы помочь в идентификации новых терапевтических целей, которые могут регулировать обмен веществ. Для того чтобы выполнить такой экран простой и быстрый способ для идентификации изменения в метаболического состояния мух необходимо. В целом, производство углекислого газа является хорошим показателем расходы субстрат окисления и энергии предоставляя информацию о метаболического состояния. В этом протоколе введем простой метод для измерения CO 2 выхода от мух. Этот метод может потенциально помочь в идентификации генетических возмущений, влияющих на скорость метаболизма.
Introduction
Цикл биохимических Кребса генерирует АТФ за счет окисления ацетата, полученного из углеводов, жиров и белков, производящих CO 2. У дрозофилы O 2 вход непосредственно коррелирует с CO 2 выхода, и отражает уровень обмена веществ 1. Таким образом, измерение CO 2 выхода успешно применяется в исследованиях, связанных со старением и метаболизма 2-5. Здесь наша лаборатория изменение ранее разработанные экспериментальные установки, что позволяет измерять CO 2 производства в до восемнадцати проб, не требуя никакого специального оборудования. Другие и мы ранее использовали этот метод, чтобы показать различия в скорости метаболизма в мух, которые испытывают дефицит мышечной дистрофии, связанной белка, дистрогликана (DG) 6-8.
O 2 используется для окислительного метаболизма преобразуется в CO 2, который выбрасывается в качестве дыхательного отходов. Строительции ручной респирометров описано, что позволяет для определения скорости O 2 потребляется. Мухи помещают в герметичный контейнер с веществом, которое абсорбирует СО 2 исключен, эффективно исключает его из газовой фазы. Изменение объема газа (пониженное давление) измеряется перемещению жидкости в стеклянном капилляре, прикрепленной к закрытой респирометре.
Основным преимуществом этого метода по сравнению с другими является стоимость. Предыдущие исследования измеряется CO 2 производства по дрозофилы с помощью газоанализаторов и технически совершенных респирометрии системы 1,9. Несмотря на более сложного оборудования, чувствительность метода, описанного здесь аналогична сообщенных значений (табл. 1). Кроме того, несколько других групп использовали вариации этого метода для определения относительных скоростей обмена веществ в Drosophila 4-6. Таким образом, этот анализ может быть использован для создания reliabле, воспроизводимые данные, относящиеся к Drosophila метаболизма без приобретения специализированного оборудования, которые могут быть установлены в любой лаборатории и могут быть использованы в образовательных целях.
В общем, принятые методы для определения метаболизм организма заключается в измерении CO 2 производится, потребляется O 2, или оба ,3,4,9. Хотя, можно предположить, что один эквивалент O 2 генерирует один эквивалент CO 2, точное соотношение СО 2 генерируется зависит от метаболического субстрата, используемого 10. Таким образом, для точного определения скорости обмена веществ в энергетических единицах необходимо измерить как O 2 потребляется и СО 2 производится. В связи с этим, метод, описанный здесь, в частности, отношение к сравнивая различия в CO 2 производства между животными и не абсолютного значения. Наша методика объединяет несколько животных СО 2 производства в течение тиме (1-2 ч) и, следовательно, возвращает в среднем деятельности животных. Если есть основания полагать, что опытные животные менее активны, чем у контрольных животных измерение может отражать различные уровни деятельности и не обязательно метаболизм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка респирометров
- Разрежьте пипетки 1000 мкл с лезвием бритвы, чтобы можно было вставить в 50 мкл капиллярной микропипетки, попытайтесь получить пипетки как можно более прямо.
- Место кусок пены в пипетку и толкать ее вниз в кончика пипетки.
- Добавить небольшое количество абсорбента CO 2 и содержать его на второй кусок пены.
- Нанесите клей в месте, где микропипетки вставляется в наконечником пипетки.
- Оставьте респирометре ночь, чтобы клей для просушки.
Схематическое изображение респирометре показано на фиг.1А.
2. Подготовка измерительной камеры
- Подготовьте камеру решение путем смешивания воды с эозином в соотношении, которое приведет к видимым раскрашивания.
- Налейте раствор эозин / воды в камеру.
- Этикетка одну из сторон камеры со шкалой сантиметр.
- Этикетка индивидуальные респирометров с маркером.
- Обезболить мух с использованием альтернативного метода в СО 2 и поместите 3-5 мух желаемого генотипа внутри каждого респирометре.
- Запечатайте респирометров плотно в верхней использованием пластилина замазку.
- Разрешить мухи, чтобы оправиться от наркоза в течение примерно 15 мин.
- Подготовьте респирометре без мух, которые будут использованы в качестве атмосферного управления.
4. Проведения эксперимента
- Повесьте респирометров в камере путем присоединения 1,5 мл Eppendorf держатель трубки, которая открыта на верхней и нижней в верхней части камеры.
- Вставьте респирометров кончиком пипетки вниз в камеру, позволяя верхушка погружаться в окрашенного раствора.
- Добавить вазелин между крышкой крышкой и камерой, чтобы обеспечить более сильное изоляцию от температуры и давления fluctuations.
- Закрыть крышку и позволить системе для уравновешивания в течение 15 мин.
- Сфотографировать камеры, убедившись, что уровень жидкости внутри каждого микропипетки видна и так является шкала (см. пример, показанный на рисунке 1b).
- После 1-2 часов, принять другую картину.
- Когда эксперимент закончен, удалите мух от респирометров и весят при желании или передавать их обратно в пузырек, если это необходимо в дальнейшем.
5. Анализ результатов
- Открыть полученных изображений с помощью программного обеспечения ImageJ 11.
- Используя шкалу в каждой картине, установите пикселей масштабирование в программном обеспечении.
- Измерьте расстояние (SD), что жидкость путешествовал из определенной опорной месте в снимках, сделанных в начале (D1) и конец эксперимента (D2). Схематический пример показан на рисунке 1С.
- Рассчитайте количество произведенного CO 2 (мкл / ч / лету) с формулой:
R = радиус микропипетки трубы в сантиметрах
Δd = расстояние жидкость поднялась в микропипетки тестовых образцов измеряется в сантиметрах
Δc = расстояние жидкость поднялась в микропипетки образца отрицательный контроль (без мух)
п = количество мух, используемых
ч = часы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того чтобы показать, что метод чувствителен мы измерили CO 2 производства от дикого типа (Орегон R) мужской летает в 18, 25 и 29 ° C и летит мутанта для Dg. Мухи были подняты при 25 ° С и затем перенесен на экспериментальной температуре в течение 5 дней до измерений. Как и ожидалось для этого эктотермных видов, количество CO 2 производится увеличивается с температурой (рис. 2). Мы в прошлом показали, что без сахара диета снижает скорость метаболизма как дикого типа, и Ст мутант летает 7. Потеря Dg приводит к повышению уровня обмена веществ (рис. 2).
Рисунок 1. Установка для измерения CO 2 производства в мух. А. Схематическое изображение тон построение индивидуального респирометре. B. фотографии камеры во время измерения CO 2. Письма отметьте положение респирометров. Вертикальные цифры показывают масштабы в сантиметрах. С. Схематическое изображение изменения в ходе эксперимента. Зеленая линия показывает справочную место (d1), синий указывает на окончательную позицию жидкости через 2 часа (D2). Δd это расстояние жидкость путешествовал в микропипетки.
Рисунок 2. Производство CO 2 в мух при различных температурах и в Dg мутантов. Температура Корпус положительно коррелирует с CO 2 производства у дрозофилы и значительно увеличивается в Dg мутантов. Столбики ошибок указывают SEM из четырех отдельных экспериментов, *** р ≤ 00,01.
| (Мкл / лететь х час) | Оборудование, используемое | Ссылка |
| 2-3 CO 2 | СО анализатор 2 газ | (Ван Voorhies, Khazaeli соавт. 2004) |
| 4.68 ± 1.04 CO 2 | CO 2 система респирометрии | (Khazaeli, Ван Voorhies соавт. 2005) |
| 2.9-6.2 O 2 | Аналогично, предназначенные респирометров | (Хулберт, Клэнси и др.. 2004) |
| 2.20 ± 0.15 O 2 | Описанные здесь ручной работы респирометров | (Кучеренко, Марроун соавт. 2011) |
| * Табличные значения взяты из исследований, которые сообщают численные значения мух измеренные при 25 ° С |
Таблица 1. Сравнениеиз различных методов, используемых для измерения CO 2 производства по дрозофилы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, мы описываем недорогой и надежный метод для измерения CO 2 производства в мух. Мы обнаружили, что этот эксперимент просто, быстро провести и генерирует воспроизводимое данные, которые согласуются с другими исследованиями 1, 6, 9. Протокол изложил здесь могут быть легко изменены, чтобы соответствовать бюджета и доступных материалов любой лаборатории в. Строительство каждого отдельного респирометре могут быть адаптированы тех пор, пока камера остается герметичной. Однако чем дольше, более тонкие микропипетки предлагают большую точность по сравнению короткие. Использование внешней камеры может быть опционально тех пор, пока нет существенных температуры и давления изменения окружающей среды, чтобы поставить под угрозу эксперимент. Это может быть определено с помощью анализа с отрицательным контролем и большой изменчивости в пределах измерений биологическом образце. Кроме того, абсорбирующий CO 2 может быть любого сорта тех пор, пока он не токсичен к еложь (например, гидроксид калия). Это имеет первостепенное значение будет иметь негативные контроль, обеспечивающий, что техника работает должным образом. Самая распространенная проблема для респирометра не быть запечатаны полностью. Если это так, то измерение будет сравнима с отрицательным контролем. Дополнительные проблемы могут возникнуть в связи с мухами, которые не имели времени, чтобы восстановиться от анестезии или погибших.
Наиболее важным шагом в этом протоколе является строительство респирометре. Как отмечалось выше, респирометра должно быть герметичным. Крепление микропипетки к большей пипетки камере должно быть сделано с правильным клеем. Более резиноподобный клея работали лучше. Рекомендуется проверять респирометров под микроскопом наблюдать ни на какие компромиссы в клееного структуры после завершения. Кроме того, уплотнение респирометре после мухи были размещены внутри очень важно. Использование замазки чкак было установлено, работать лучше и не редко. Парафин было установлено, работает очень плохо и его следует избегать. Жидкость, которая используется для измерения объема газа также очень важна и должна быть манометрический. Вода является поэтому лучшим выбором. Использование чернил не рекомендуется, поскольку это может затвердеть в капилляре делая респирометра бесполезно. Важно также, чтобы не использовать воспроизведения самок, как мы заметили, что их производство CO 2 может быть сильно варьирует. Кроме того, возраст мух Важно, таким образом мухи, которые по сравнению должен быть того же возраста. В нашем тесте мы использовали 5 дней старые самцы. Генетический фон из мух, также важно. Контрольные мухи должны быть одного и того же генетического фона по сравнению с мутантами. Эти данные также могут быть представлены в виде (мкл / ч / мг), измеряя массу мух после проведения анализа, если существуют значительные различия в размере мух. В наших руках, один дикого типа мухи весит 0,80 ± 0,11 мг (п = 180). Следует также отметить, что в течение времени эксперимента значения средней скорости метаболизма вещества. Мы также обнаружили, что можно измерить индивидуальный муху, но мы достигли высокую точность с использованием 3-5 мух. Пространство доступны в респирометре для мух достаточно того, что они не чувствуют себя переполненными, но в то же время они не имеют места, чтобы идти интенсивно: поэтому дефектные geotaxis не должны иметь никакого эффекта на уровень CO 2 производства.
Мухи уже давно был создан в качестве одного из основных модельных организмов для изучения заболеваний человека, которые связаны с биологии развития, клеточной биологии и нейробиологии. Ряд недавних исследований показали, что мухи могут быть легко использованы для изучения энергетического гомеостаза, а также (отзывы в 12, 13). Метод, представленный здесь могут быть легко использованы в генетических экранов для выявления новых молекулярных компонентов, возможно, участвующих в управлении меняtabolic состояние до покупки более точную и дорогостоящего оборудования. До сих пор большинство таких экранов были сделаны только в культуре клеток указывая, что более продвинутые исследования являются оправданными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Макса Планка Общество для финансирования наших исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).
- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takeuchi, K., et al. Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants. Science. 323, 1740-1743 (2009).
- Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components. Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).
- Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles. Scientific Reports. 1, 47 (2011).
- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. Genetics. 169, 231-242 (2005).
- Elia, M. Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques. The American Journal of Physiology. 260, (1991).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Bharucha, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism. Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, 38 (2013).
