Summary
代謝障害はヒトにおいて最も一般的な疾患の1つである。遺伝的に扱いやすいモデル生物D.キイロは、代謝を調節する新規遺伝子を同定するために使用することができる。本稿では、そのCO 2産生を測定することにより、ハエに代謝率を研究することができ、比較的簡単な方法を説明します。
Abstract
代謝障害は、人の健康に影響を与え、頻繁に問題となっている。そのため、代謝を調節するメカニズムを理解することは非常に重要な科学的な課題である。ヒトでの多くの疾患の原因遺伝子は、 ショウジョウバエの異なる障害の発症に関与するシグナル伝達経路を研究するための良いモデル作り、フライホモログを持っている。さらに、 ショウジョウバエの扱いやすには、代謝を調節することができる新たな治療標的を同定するのを助けるために遺伝子スクリーニングを簡素化します。このようなスクリーンを行うために、ハエの代謝状態の変化を同定するための簡単かつ迅速な方法が必要である。一般に、二酸化炭素生成は基質酸化及び代謝状態に関する情報を提供するエネルギー消費量の良好な指標である。このプロトコルでは、ハエからのCO 2の出力を測定するための簡単な方法をご紹介します。この技術は、潜在的に代謝速度に影響を与える遺伝的摂動の識別を助けることができる。
Introduction
生化学クレブス回路は、CO 2を生成する炭水化物、脂肪、およびタンパク質由来の酢酸酸化によってATPを生成します。 ショウジョウバエでは、O 2入力は直接CO 2の出力と相関し、代謝1のレベルを反映している。これにより、CO 2の出力の測定は、正常老化と代謝2-5に関連研究において使用されている。ここに私たちの研究室では、任意の特別な装置を必要とせずに、最大18サンプル中のCO 2産生を測定することができるように、あらかじめ設計された実験装置を変更しました。その他、我々は以前に筋ジストロフィー関連タンパク質、ジストログリカン（DG）6-8が不足しているハエの代謝率の差を表示するには、このメソッドを使用している。
O酸化的代謝に用いられる2は、呼吸廃棄物として排出されるCO 2に変換される。建設手作りの呼吸計が消費されたTiON O 2の割合の決定を可能にすることが記載されている。ハエを効率的に気相からそれを排除し、CO 2排出された吸収する物質を密閉容器内に配置される。ガス容積（減圧）の変化は、閉鎖呼吸計に取り付けられたガラス毛細管内の流体の変位によって測定される。
他のものよりもこの技術の主な利点はコストです。これまでの研究では、ガス分析と技術的に高度な呼吸計測システム1,9を使用して、ショウジョウバエによるCO 2産生を測定した。より複雑な機器にもかかわらず、ここで説明する方法の感度が報告された値（ 表1）と同様である。さらに、いくつかの他のグループは、 ショウジョウバエ 4-6の相対的な代謝率を決定するために、この技術のバリエーションを使用している。したがって、このアッセイはreliabを生成するために使用することができるル、任意の実験室で設定でき、教育の目的に使用することができる特殊な機器の購入なしに、ショウジョウバエの代謝に関連する再現性のあるデータ。
一般に、生物の代謝を決定するための技術が受け入れを製造CO 2を測定することで、O 2を消費し、または両方3,4,9。しかし、それは、O 2 1当量のCO 2 1当量を生成すると仮定することができ、生成されたCO 2の正確な比は、10を利用代謝基質に依存する。従って、正確にエネルギ単位での代謝速度を決定するためには、O 2消費およびCO 2が生成さの両方を測定する必要がある。このため、ここで説明する方法は、動物ではなく絶対値とCO 2生成の違いを比較するに特に関連のある。私たちの技術は、ティムの期間にわたって複数の動物のCO 2の生産を統合したがって、E（1〜2時間）とは、動物の活動の平均値を返します。実験動物は、測定対照動物よりも活性であることを信じる理由がある場合には異なるレベルの活性を反映し、必ずしも代謝でした。
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Protocol
呼吸計の1。準備
- 50μlのキャピラリーマイクロピペットの挿入を可能にするためにカミソリの刃で千μlのピペットチップをカットし、できるだけまっすぐピペットチップを取得しよう。
- ピペットに泡の部分を置き、ピペットチップでそれを押し下げます。
- CO 2吸収剤を少量添加すると、発泡体の二枚で、それが含まれています。
- マイクロピペットをピペットチップに挿入されている場所で、接着剤を適用します。
- 接着剤を乾燥させるために、一晩呼吸のままにしておきます。
呼吸計の概略図を図1Aに示されている。
測定所の2。準備
- 目に見えるカラー化になります比でエオシンで水を混合することにより、チャンバ溶液を調製する。
- チャンバー内にエオシン/水溶液を注ぐ。
- センチメートルスケールで、チャンバの側面の1にラベルを付けます。
- マーカーで、個々の呼吸計にラベルを付けます。
- 2を COと各呼吸計内部の希望する遺伝子型の3-5ハエを配置する別の方法を使用してハエを麻酔。
- 粘土のパテを使用して、上部にしっかりと呼吸計を密封する。
- ハエは約15分間麻酔から回復することができます。
- 大気中のコントロールとして使用される、ハエなしで1呼吸を準備します。
4。実験を行う
- チャンバーの上部に上下に開いて1.5ミリリットルエッペンドルフチューブホルダーを取り付けることにより、チャンバ内の呼吸計を掛ける。
- ダウン先端が着色した溶液に浸すことを可能チャンバ内へのマイクロピペットチップで呼吸計を挿入します。
- 温度および圧力fluctより強い分離を提供する蓋カバーとチャンバーとの間にワセリンを追加uations。
- ふたを閉め、システムが15分間平衡化することができます。
- （ 図1Bに示す例を参照）、各マイクロピペット内の液体のレベルが表示されているので、スケールがあることを確認して、チャンバの写真を撮る。
- 1〜2時間後、別の写真を撮る。
- 実験が終了すると、呼吸計からハエを削除し、必要に応じて、重さや、さらに必要に応じてバイアルに戻ってそれらを転送します。
結果5。分析
- オープンImageJソフトウェア11を使用して画像を取得しました。
- 各写真にスケールを使用して、ソフトウェアでピクセルスケーリングを設定します。
- 液体は初め（D1）で撮影された画像内の決定された基準点から移動した距離（ΔD）と実験終了（D2）を測定します。概略的な例を図1Cに示されている。
- 式で（μL/ HR /飛ぶ）生成されるCO 2の量を計算します。
センチメートルでマイクロピペット管のRは=半径
液体はセンチメートル単位で測定された試験試料のマイクロピペットで上に移動したΔD=距離
液体が（ハエなし）陰性対照試料のマイクロピペット中に移動した距離=Δcを
使用ハエのN =数
H =時間
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Representative Results
メソッドが敏感であることを示すために、我々は、野生型（ オレゴンR）からのCO 2の生産は、男性は18、25、および29℃で飛んで測定され、DGと変異体を飛ぶ。ハエは、25℃で昇温し、測定前に5日間実験温度にシフトした。この外温性種について予想されるように、CO 2の量は、温度（ 図2）に増加した産生した。我々は過去に、砂糖を含まない食事は、野生型の代謝率を低下させ、 危険物の変異体は、7を飛ぶことが示されている。 Dgはの損失が増加し、代謝レベル（ 図2）をもたらす。
図1。ハエのCO 2産生の測定のためのセットアップ。トンを示すA.回路図CO 2測定時の室内の彼は、個々の呼吸の構築B.写真 。文字は、呼吸計の位置をマークします。垂直方向の数値はcmスケールを示している。C.回路図は、実験中に変化を示す。緑色の線は、基準地点（D1）を示し、青色は、2時間（d2）の後に液体の最終的な位置を示す。 ΔDは、液体はマイクロピペットで移動した距離である。
図2と異なる温度でDgの変異体におけるハエにおけるCO 2生成ハウジング温度は、積極的にショウジョウバエのCO 2産生と相関し、Dgの変異体において有意に増加する。エラーバーは、*** P≤0、4個々の実験からのSEMを示す0.01。
| （μL/ X時間飛ぶ） | 使用される機器 | リファレンス |
| 2〜3のCO 2 | CO 2ガス分析器 | （ヴァンVoorhies、Khazaeli ら 2004） |
| 4.68±1.04、CO 2 | CO 2呼吸計測システム | （Khazaeli、ヴァンVoorhies ら 2005） |
| 2.9から6.2のO 2 | 同様に設計された呼吸計 | （ハルバート、クランシーら 2004） |
| 2.20±0.15 O 2 | ここで説明する手作りの呼吸計 | （Kucherenko、Marroneのら 2011） |
| ※表の値は、ハエの数値を報告した研究から25°Cで測定される |
表1の比較ショウジョウバエによるCO 2産生を測定するために使用されるの異なる技術。
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Discussion
このプロトコルでは、ハエにおけるCO 2産生を測定するための安価で信頼性の高い方法を記載している。我々は、この実験が容易であることが見出さ行うことが迅速かつ他の研究1,6,9と一致して再現性のあるデータを生成する。ここで概説したプロトコルは、簡単に任意の研究室の予算や利用可能な材料に合わせて変更することができます。各個々の呼吸の構成であれば、チャンバは、気密のままであるように適合させることができる。しかし、より長い、より薄いマイクロピペットは短いものより高い精度を提供します。外側チャンバーの使用は、長い実験を侵害する有意な周囲温度および圧力の変化がないように、任意とすることができる。これは、陰性対照および生物学的試料の測定値内の大きな変動性の分析によって決定することができる。また、CO 2吸収剤は、それがfの毒性でないような任意の種々のものであってもよい嘘（ 例えば 、水酸化カリウム）。これは、技術が正常に動作していることを確認するための陰性対照を有することが最も重要である。最も一般的な問題は、完全に密閉されないように呼吸用です。この場合、その後の測定は、陰性対照のものに匹敵するであろう。さらなる問題は、麻酔から回復する時間がなかったか、死亡しているハエに発生する可能性があります。
このプロトコルの中で最も重要なステップは、呼吸の構築である。上述したように、呼吸計気密されなければならない。大きなピペット室へのマイクロピペットの取り付けが正しい接着剤で行う必要があります。より多くのゴム状接着剤は、最高の仕事をしました。それが完了した後に接着された構造内の任意の妥協を観察し、顕微鏡下で呼吸計を検査することをお勧めします。また、ハエは内部に置かれた後に呼吸のシールは非常に重要です。パテHの使用最高の、まれに失敗するように機能することが分かっている。パラフィンは、非常にうまく機能しないことが分かっているので、避けるべきである。ガス量を測定するために使用される液体は、非常に重要であり、マノメータであるべきである。水は、そのための最良の選択です。それは呼吸が役に立た作るキャピラリーで硬化できるため、インクの使用は推奨されません。我々は彼らのCO 2生成は非常に可変とすることができることに気づいたように、それは、再生メスを使用しないことも重要です。またハエの年齢は重要であり、したがって、比較され、ハエは同じ年齢である必要があります。我々のテストでは、5日齢の雄を使用していました。ハエの遺伝的背景も重要である。突然変異体と比較した場合、コントロールハエは、同じ遺伝的背景のものであるべきである。データはまた、ハエの大きさに大きな違いがある場合にアッセイを実施した後にハエの質量を測定することによって（液/時間/ mg）として提示することができる。私たちの手で、1野生型ハエは、n = 1（0.80±0.11 mgの重さ80）。また、実験の間、タイミング、代謝速度の平均値が得られることが指摘されるべきである。我々はまた、個々のハエを測定することが可能であることを見出したが、我々は3-5ハエを使用して最高の精度を達成した。ハエのための呼吸で利用可能なスペースは、彼らが過密に感じることはありませんが、同時に彼らは集中的に歩くスペースがないことを十分にされています：そのため、不良走地は、CO 2産生のレベルには影響を与えないようにしてください。
ハエは、長い発生生物学、細胞生物学、神経生物学とに関連するヒトの疾患を研究するための主要なモデル生物の一つとして確立されている。最近の多くの研究は、ハエが容易に（12、13に概説されている）ならびにエネルギー恒常性を研究するために使用することができることを示している。ここに示された方法は容易に可能性が私の制御に関与する新たな分子成分を同定するための遺伝子スクリーニングにおいて使用することができる前より正確で高価な機器を購入するtabolic状態。これまでこのようなスクリーニングの大部分は、より高度な研究が保証されていることを示す唯一の細胞培養物中で行った。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は我々の研究の資金調達のためのマックス·プランク協会に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
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