Summary
Stofskiftesygdomme er blandt en af de mest almindelige sygdomme hos mennesker. Den genetisk medgørlig model organisme D. melanogaster kan anvendes til at identificere hidtil ukendte gener, der regulerer stofskiftet. Dette papir beskriver en forholdsvis enkel fremgangsmåde, som gør det muligt at studere stofskiftet i fluer ved at måle deres CO 2-produktion.
Abstract
Stofskiftesygdomme er et hyppigt problem, der påvirker menneskers sundhed. Derfor forstå de mekanismer, der regulerer stofskiftet er en afgørende videnskabelig opgave. Mange sygdomsfremkaldende gener i mennesker har en flue homolog, at Drosophila en god model til at studere signalveje, der er involveret i udviklingen af forskellige lidelser. Derudover spores Drosophila forenkler genetiske skærme til at hjælpe med at identificere nye terapeutiske mål, der kan regulere stofskiftet. For at udføre en sådan skærm er nødvendigt med en enkel og hurtig metode til at identificere ændringer i metaboliske tilstand af fluer. I almindelighed kuldioxid produktion er en god indikator for substratoxidering og energiomsætning give oplysninger om metaboliske tilstand. I denne protokol indfører vi en enkel metode til at måle CO 2-output fra fluer. Denne teknik kan potentielt hjælpe med identifikationen af genetiske forstyrrelser, der påvirker stofskiftet.
Introduction
Den biokemiske Krebs cyklus genererer ATP ved oxidering af acetat afledt fra kulhydrater, fedtstoffer og proteiner, der frembringer CO 2. I Drosophila, O 2-indgangen er direkte korreleret med CO 2-produktion og afspejler niveauet af stofskiftet 1. Således har måling af CO 2-udgang med succes været anvendt i undersøgelser i forbindelse med aldring og stofskifte 2-5. Her vores laboratorium har ændret tidligere designet forsøgsopstillinger, så måling af CO 2-produktionen i op til atten prøver uden at kræve nogen specialiseret udstyr. Andre, og vi har tidligere brugt denne metode til at vise forskelle i stofskifte i fluer, der er mangelfuld i muskelsvind protein, dystroglycan (DG) 6-8.
O 2 anvendes til oxidativ metabolisme omdannes til CO 2, der er udvist som respiratorisk affald. Opførelsention af håndlavede respirometers beskrives som giver mulighed for bestemmelse af hastigheden af O 2 forbruges. Fluerne anbringes i en forseglet beholder med et stof, der absorberer udvises CO 2, effektivt fjerne det fra gasfasen. Ændringen i gasvolumen (reduceret tryk) måles ved forskydning af væske i et glaskapillar fastgjort til den lukkede respirometer.
Den væsentligste fordel ved denne teknik i forhold til andre er omkostningerne. Tidligere undersøgelser har målt CO 2 produktion af Drosophila hjælp gas analysatorer og teknisk avancerede respirometri systemer 1,9. Trods en mere kompliceret udstyr, følsomheden af den her beskrevne fremgangsmåde svarer til rapporterede værdier (tabel 1). Derudover har en række andre grupper anvendes variationer af denne teknik til at bestemme relative stofskifte i Drosophila 4-6. Derfor kan dette assay anvendes til at frembringe reliable, reproducerbare relevante data for Drosophila stofskifte uden indkøb af specialudstyr, som kan være setup i enhver laboratorium og kan bruges til uddannelsesmæssige formål.
I almindelighed er de anerkendte teknikker til at bestemme metabolismen af en organisme er at måle produktionen af CO 2, O 2 forbruges, eller begge dele 3,4,9. Dog kan det antages, at en ækvivalent af O 2 genererer en ækvivalent af CO 2, den nøjagtige andel af CO 2 genereres, er afhængig af den metaboliske substrat udnyttet 10.. Således, at nøjagtigt at bestemme stofskiftet i energienheder er det nødvendigt at måle både O 2 forbruges og CO 2 produceres. På grund af dette, den her beskrevne fremgangsmåde er særlig relevant for at sammenligne forskelle i CO 2-produktion mellem dyr og ikke den absolutte værdi. Vores teknik integrerer flere dyr CO 2 produktion over en periode på time (1-2 timer), og derfor returnerer et gennemsnit af dyrenes aktivitet. Hvis der er grund til at tro, at forsøgsdyrene er mindre aktive end kontrol dyrene målingen kunne afspejle forskellige niveauer af aktivitet, og ikke nødvendigvis stofskifte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Respirometers
- Skær 1.000 ul pipettespids med et barberblad for at tillade indsættelsen af 50 ul kapillar mikropipette, forsøge at få pipettespidsen så lige som muligt.
- Læg et stykke skum ind i pipetten, og skub den ned i pipettespidsen.
- Tilsæt en lille mængde CO 2 absorberende og indeholder det med et andet stykke skum.
- Påfør lim på det sted, hvor mikropipetten indsættes i pipettespidsen.
- Lad respirometerkolben natten over for at tillade limen at tørre.
En skematisk en respirometer er vist i figur 1A.
2.. Forberedelse af Measurement Afdeling
- Forbered kammeret ved at blande vand med eosin i et forhold, der vil resultere i synlig farvning.
- Hæld eosin / vand-opløsningen ind i kammeret.
- Mærk den ene af siderne af kammeret med en centimeter skala.
- Mærk de enkelte respirometers med en markør.
- Bedøver fluer ved hjælp af en alternativ metode til CO 2 og placere 3-5 fluer af den ønskede genotype i hver respirometer.
- Forsegl respirometers tæt på toppen ved hjælp af modellervoks kit.
- Tillad fluer at komme fra bedøvelse i ca 15 min.
- Forbered en respirometer uden fluer, som vil blive anvendt som den atmosfæriske kontrol.
4.. Udførelse af eksperiment
- Hæng respirometers i kammeret ved at fastgøre et 1,5 ml Eppendorf-rør holder, der er åben i toppen og bunden i toppen af kammeret.
- Indsæt respirometers med mikropipettespidsen ned i kammeret, at spidsen at dykke ind i den farvede opløsning.
- Tilføj Vaseline mellem låg dække og kammeret for at give stærkere isolation fra temperatur og tryk fluctuations.
- Luk låget og tillade systemet at ækvilibrere i 15 min.
- At tage et billede af kammeret at sikre, at niveauet af væske i hver mikropipette er synlig, og så er skalaen (se eksempel vist i figur 1B).
- Efter 1-2 timer, tage et andet billede.
- Når forsøget er afsluttet, skal du fjerne fluerne fra respirometers og vejer hvis det ønskes eller overføre dem tilbage til hætteglasset, hvis yderligere behov.
5.. Analyse af resultater
- Åbent erhvervede billeder ved hjælp ImageJ software 11.
- Brug af skalaen i hvert billede, indstilles pixel skalering i softwaren.
- Mål afstanden (af d), at væsken rejste fra en beslutsom henvisning stedet i billeder taget i begyndelsen (d1) og slutningen af forsøget (d2). Et skematisk eksempel er vist i figur 1C.
- Beregne mængden af producerede CO 2 (ul / t / flue) med formlen:
R = radius af mikropipette røret i centimeter
Af d = afstand væsken har bevæget sig op i mikropipetten af prøver målt i centimeter
Δc = afstand væsken har bevæget sig op i mikropipetten af den negative kontrolprøve (uden fluer)
n = antallet af fluer, der anvendes
h = timer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vise, at metoden er følsom vi målte CO 2-produktion fra vildtype (Oregon R) mandlige flyver på 18, 25 og 29 ° C og fluer mutant til GD. Fluer blev rejst ved 25 ° C og derefter flyttet til den eksperimentelle temperatur i 5 dage før måling. Som forventet for dette ectothermic art, mængde CO 2 fremstillet øges med temperatur (figur 2). Vi har tidligere vist, at en sukker fri kost nedsætter stofskiftet af både vildtype og Dg mutant fluer 7. Tabet af Dg medfører øgede metaboliske niveauer (figur 2).
Figur 1.. Opsætning til måling af CO 2-produktion i fluer. A. Skematisk viser than konstruktion af individuelle respirometer. B. Fotografi af kammeret under CO 2-måling. Breve afmærk respirometers. Lodrette tal angiver skala i centimeter. C. Skematisk viser ændringerne i løbet af eksperimentet. Grøn linje angiver henvisning spot (d1), blå angiver den endelige position af væsken efter 2 timer (D2). Af d er afstanden væsken har rejst i mikropipetten.
Figur 2.. CO 2 produktion i fluer ved forskellige temperaturer og i GD mutanter. Staldtemperatur positivt korrelerer med CO 2-produktion i Drosophila og er signifikant forøget i GD mutanter. Fejllinjer indikerer SEM fra fire individuelle eksperimenter, *** p ≤ 0.01.
| (Ul / fly x time) | Udstyr, der anvendes | Henvisning |
| 2-3 CO 2 | CO 2 gas analysator | (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2004) |
| 4,68 ± 1,04 CO 2 | CO 2 respirometri systemet | (Khazaeli Van Voorhies et al. 2005) |
| 2,9-6,2 O 2 | Ligeledes designede respirometers | (Hulbert, Clancy et al. 2004) |
| 2,20 ± 0,15 O 2 | Beskrevet her håndlavede respirometers | (Kucherenko, Marrone et al. 2011) |
| * Tabelværdierne er fra studier, der rapporterer numeriske værdier af fluer målt ved 25 ° C |
Tabel 1. Sammenligningaf forskellige teknikker, der anvendes til at måle CO 2-produktion af Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, beskriver vi en billig og pålidelig metode til måling af CO 2 produktion i fluer. Vi fandt, at dette eksperiment er nem, hurtig at gennemføre og genererer reproducerbare data, der er i overensstemmelse med andre undersøgelser 1, 6, 9. Protokollen beskrevet her kan let ændres til at passe enhver laboratoriets budget og tilgængelige materialer. Opførelsen af enkelte respirometer kan tilpasses, så længe kammeret bliver utæt. Men jo længere, tyndere mikropipetter tilbyde mere præcision i løbet af kortere dem. Anvendelsen af det ydre kammer kan være frivillig, så længe der ikke er væsentlige i omgivende temperatur-og trykændringer at kompromitere eksperimentet. Dette kan bestemmes ved analyse af den negative kontrol og en stor variation i biologiske prøve målinger. Derudover kan CO 2 absorberende være af enhver sort, så længe det ikke er toksisk for fligger (fx kaliumhydroxid). Det er af yderste vigtighed at have en negativ kontrol for at sikre, at teknikken fungerer korrekt. Det mest almindelige problem er respirometerkolben til ikke forsegles fuldstændigt. Hvis dette er tilfældet, så målingen vil være sammenlignelig med den for den negative kontrol. Yderligere problemer kan opstå på grund af fluer, der ikke har haft tid til at komme fra bedøvelse eller er forsvundet.
Det mest kritiske skridt i denne protokol er opførelsen af respirometerkolben. Som nævnt ovenfor skal respirometerkolben være lufttæt. Fastgørelsen af mikropipetten til større pipette kammer skal udføres med den korrekte lim. En mere gummilignende limen har fungeret bedst. Det anbefales at inspicere respirometers under et mikroskop for at observere eventuelle kompromiser i limede struktur efter afslutningen. Derudover forsegling af respirometerkolben efter fluer er blevet placeret inde er meget vigtigt. Anvendelsen af kit hsom vist sig at fungere bedst, og ikke sjældent. Paraffin har vist sig at fungere meget dårligt og bør undgås. Den væske, der anvendes til at måle mængden af gas er også meget vigtig og bør være manometrisk. Vand er derfor det bedste valg. Anvendelsen af blækket ikke anbefales, da det kan hærde i kapillarrøret gør respirometerkolben ubrugelig. Det er også vigtigt at ikke bruge gengive hunner, som vi har bemærket, at deres CO 2-produktion kan være meget varierende. Desuden er det vigtigt at en alder af fluer derfor fluer, der sammenlignes, bør være af samme alder. I vores test har vi brugt fem dage gamle hanner. Den genetiske baggrund for fluer er også vigtig. Kontrolorganerne fluer skal være af den samme genetiske baggrund i forhold til mutanter. Dataene kan også blive præsenteret som (ul / t / mg) ved at måle massen af fluer efter udførelse af analysen, hvis der er betydelige forskelle i størrelsen af fluer. I vores hænder, én vildtype flue vejer 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). Det bør også bemærkes, at i timingen af eksperimentet, er værdierne for den gennemsnitlige stofskifte opnået. Vi har også fundet, at det er muligt at måle en individuel flyve, men vi opnået den højeste nøjagtighed ved hjælp af 3-5 fluer. Pladsen i respirometer for fluer er nok, at de ikke føler overfyldte, men på samme tid, de ikke har plads til at gå intensivt: derfor defekte geotaxis bør ikke have nogen indvirkning på niveauet af CO 2-produktion.
Fluer har længe været etableret som en af de store modelorganismer at studere humane sygdomme, der er relateret til udviklings-biologi, cellebiologi og neurobiologi. En række nyere undersøgelser har vist, at fluer nemt kan bruges til at studere energi homeostase samt (revideret i 12, 13). Metoden præsenteres her kan nemt bruges i genetiske skærme til at identificere nye molekylære komponenter muligvis er involveret i at kontrollere migtabolic tilstand før du køber mere præcis og dyrt udstyr. Hidtil har størstedelen af disse skærme blev udført kun i cellekultur indikerer, at mere avancerede studier er berettiget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Max-Planck Society for at finansiere vores forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).
- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takeuchi, K., et al. Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants. Science. 323, 1740-1743 (2009).
- Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components. Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).
- Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles. Scientific Reports. 1, 47 (2011).
- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. Genetics. 169, 231-242 (2005).
- Elia, M. Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques. The American Journal of Physiology. 260, (1991).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Bharucha, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism. Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, 38 (2013).
