Summary
Les troubles métaboliques sont parmi l'une des maladies les plus communes chez les humains. Le modèle organisme génétiquement traitable D. melanogaster peut être utilisé pour identifier de nouveaux gènes qui régulent le métabolisme. Ce document décrit une méthode relativement simple qui permet d'étudier le taux métabolique chez les mouches par la mesure de leur production de CO 2.
Abstract
Les troubles métaboliques sont un problème fréquent qui affecte la santé humaine. Par conséquent, la compréhension des mécanismes qui régulent le métabolisme est une tâche cruciale scientifique. De nombreux gènes causant des maladies chez les humains ont un homologue à la mouche, la drosophile faire un bon modèle pour étudier les voies de signalisation impliquées dans le développement de différents troubles. En outre, la traçabilité de la drosophile simplifie écrans génétiques pour aider à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques susceptibles de réguler le métabolisme. Pour effectuer un tel écran une méthode simple et rapide pour identifier les changements dans l'état métabolique des mouches est nécessaire. En général, la production de dioxyde de carbone est un bon indicateur de la dépense d'oxydation du substrat et de l'énergie fournissant des informations sur l'état métabolique. Dans ce protocole, nous introduisons une méthode simple pour mesurer le CO 2 émis par les mouches. Cette technique peut potentiellement contribuer à l'identification de perturbations génétiques affectant le taux métabolique.
Introduction
Le cycle de la biochimique Krebs génère de l'ATP par l'oxydation de l'acétate dérivé de glucides, les lipides et les protéines de production de CO 2. Chez la drosophile, O 2 entrée est directement corrélée à la production de CO 2 et reflète le niveau de métabolisme 1. Ainsi, la mesure de la production de CO 2 a été utilisé avec succès dans les études liées au vieillissement et le métabolisme 2-5. Voici notre laboratoire a modifié montages expérimentaux conçus antérieurement, permettant la mesure de la production de CO 2 dans un maximum de dix-huit échantillons sans nécessiter aucun équipement spécialisé. Autres et que nous avons déjà utilisé cette méthode pour montrer les différences dans les taux métaboliques chez les mouches qui sont déficientes dans la protéine de dystrophie musculaire associée, Dystroglycan (Dg) 6-8.
O 2 utilisé pour le métabolisme oxydatif est converti en CO 2, qui est expulsé en tant que déchets respiratoire. La constructiontion de respiromètres réalisés à la main est décrite qui permet la détermination du taux de consommation d'O 2. Les mouches sont placés dans un récipient scellé avec une substance qui absorbe le CO 2 expulsé, il en éliminant de manière efficace à partir de la phase gazeuse. Le changement de volume de gaz (diminution de la pression) est mesurée par le déplacement du fluide dans un capillaire en verre fixé à la respiromètre fermé.
Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres est le coût. Des études antérieures ont mesuré la production de CO2 par la drosophile en utilisant des analyseurs de gaz et systèmes de respirométrie techniquement avancés 1,9. En dépit de l'équipement plus complexe, la sensibilité de la méthode décrite ici est similaire aux valeurs rapportées (tableau 1). En outre, plusieurs autres groupes ont utilisé des variantes de cette technique pour déterminer les taux métaboliques relatifs dans Drosophila 4-6. Par conséquent, ce dosage peut être utilisé pour générer reliable, des données reproductibles pertinentes au métabolisme chez la drosophile sans l'achat d'équipement spécialisé qui peut être installé dans n'importe quel laboratoire et peut être utilisé à des fins éducatives.
En général, les techniques admises pour déterminer le métabolisme d'un organisme est de mesurer le CO 2 produit, l'O 2 consommé, ou les deux 3,4,9. Cependant, il peut être supposé que un équivalent d'O 2 génère un équivalent de CO 2, le rapport exact de CO 2 produite dépend du substrat métabolique utilisé 10. Ainsi, pour déterminer avec précision le taux métabolique en unités d'énergie, il est nécessaire de mesurer tous les deux O 2 et CO 2 consommée produite. Pour cette raison, le procédé décrit ici est particulièrement pertinent pour comparer les différences dans la production de CO 2 entre les animaux et non la valeur absolue. Notre technique intègre multiples CO 2 de la production animale sur une période de time (1-2 heures) et retourne donc une moyenne de l'activité des animaux. S'il ya des raisons de croire que les animaux de laboratoire sont moins actives que les animaux de contrôle de la mesure pourrait refléter les différents niveaux de l'activité et pas nécessairement le métabolisme.
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Protocol
Une. Préparation de respiromètres
- Couper l'extrémité de la pipette de 1000 pi avec une lame de rasoir pour permettre l'insertion de la 50 pi capillaire micropipette, essayez d'obtenir la pointe de la pipette aussi droit que possible.
- Placez un morceau de mousse dans la pipette et pousser vers le bas dans la pointe de la pipette.
- Ajouter une petite quantité d'absorbant de CO 2 et de le contenir par un second morceau de mousse.
- Appliquez de la colle à l'endroit où la micropipette est insérée dans l'embout de pipette.
- Laissez le spiromètre nuit pour permettre à la colle de sécher.
Un schéma d'un respiromètre est représentée sur la Figure 1A.
2. Préparation de la Chambre de mesure
- Préparer la solution de la chambre par mélange d'eau avec de l'éosine, dans un rapport qui se traduira par une colorisation visible.
- Verser la solution d'éosine / eau dans la chambre.
- Étiqueter l'un des côtés de la chambre avec une échelle centimétrique.
- Étiqueter les respiromètres individuels avec un marqueur.
- Anesthésier les mouches en utilisant une méthode alternative au CO 2 et placer 3-5 mouches du génotype souhaitée à l'intérieur de chaque spiromètre.
- Sceller les respiromètres étroitement au sommet en pâte à modeler mastic.
- Permettre aux mouches de se remettre de l'anesthésie pendant environ 15 min.
- Préparer un spiromètre sans mouches, qui sera utilisé comme contrôle atmosphérique.
4. Exécution de l'expérience
- Accrocher les respiromètres dans la chambre par la fixation d'un support d'Eppendorf de 1,5 ml de tube qui est ouvert sur le haut et le bas dans la partie supérieure de la chambre.
- Insérez respiromètres avec la pointe de micropipette vers le bas dans la chambre permettant la pointe de plonger dans la solution colorée.
- Ajouter Vaseline entre le couvercle et le couvercle de la chambre pour assurer une isolation plus forte de la température et de la pression fluctuations.
- Fermez le couvercle et laissez le système s'équilibrer pendant 15 min.
- Prendre une photographie de la chambre en s'assurant que le niveau de liquide à l'intérieur de chaque micropipette est visible et est donc l'échelle (voir l'exemple représenté à la figure 1B).
- Après 1-2 heures, prendre une autre photo.
- Lorsque expérience est terminée, retirez les mouches de respiromètres et peser si vous le souhaitez ou de les transférer vers le flacon si nécessaire encore.
5. Analyse des résultats
- Ouvrir des images acquises en utilisant le logiciel ImageJ 11.
- Utilisation de l'échelle dans chaque image, réglez la mise à l'échelle du pixel dans le logiciel.
- Mesurer la distance (Dd) que le liquide a voyagé d'un endroit de référence déterminé dans les images prises au début (d1) et à la fin de l'expérience (d2). Un exemple schématique est représentée sur la Figure 1C.
- Calculer la quantité de CO 2 produite (pi / h / mouche) avec la formule:
R = rayon du tube de micropipette en centimètres
Dd = distance le liquide s'est déplacé vers le haut dans la micropipette d'échantillons d'essai mesurée en centimètres
Ac = distance du liquide a progressé dans la micropipette de l'échantillon de contrôle négatif (sans vol)
n = nombre de mouches utilisés
h = heure
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Representative Results
Afin de montrer que la méthode est sensible, nous avons mesuré la production de CO 2 de type sauvage (Oregon R) mâle vole à 18, 25, et 29 ° C et les mouches mutantes pour Dg. Les mouches ont été soulevées à 25 ° C, puis déplacés à la température expérimentale pendant 5 jours avant la mesure. Comme attendu pour cette espèce ectotherme, la quantité de CO 2 produite augmente avec la température (figure 2). Nous avons par le passé démontré qu'un régime sans sucre réduit le taux métabolique de deux type sauvage et Dg mouches mutantes 7. La perte de Dg conduit à une augmentation des niveaux métaboliques (figure 2).
Figure 1. Configuration pour la mesure de la production de CO 2 en vol. A. Schéma montrant til la construction de l'individu spiromètre. B. Photo de la chambre lors de la mesure de CO 2. Lettres marquent la position de respiromètres. Numéros verticales indiquent échelle en centimètres. C. Schéma montrant les changements au cours de l'expérience. Ligne verte indique endroit de référence (d1), bleu indique la position finale du liquide après 2 heures (d2). Ad est la distance le liquide a voyagé dans la micropipette.
Figure 2. Production de CO 2 dans les mouches à différentes températures et dans des mutants Dg. Température du logement est positivement corrélée avec la production de CO 2 chez la drosophile et est significativement augmentée chez les mutants Dg. Les barres d'erreur représentent la SEM à partir de quatre expériences individuelles, *** p ≤ 00,01.
| (Pi / voler x heures) | Matériel utilisé | Référence |
| 2-3 CO 2 | CO 2 analyseur de gaz | (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2004) |
| 4,68 ± 1,04 CO 2 | CO 2 système de respirométrie | (Khazaeli, Van Voorhies et al. 2005) |
| 2.9 à 6.2 O 2 | Respiromètres même conçus | (Hulbert, Clancy et al. 2004) |
| 2,20 ± 0,15 2 O | Décrites ici respiromètres main | (Kucherenko, Marrone et al. 2011) |
| * Les valeurs de la table sont des études qui rendent compte des valeurs numériques de vol mesurée à 25 ° C |
Tableau 1. Comparaisondes différentes techniques utilisées pour mesurer la production de CO 2 par la drosophile.
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode peu coûteuse et fiable pour mesurer la production de CO 2 en vol. Nous avons constaté que cette expérience est facile, rapide à réaliser et génère des données reproductibles qui est en accord avec d'autres études 1, 6, 9. Le protocole décrit ici peut être facilement modifié pour s'adapter budgétaires disponibles et les matériaux de tout laboratoire. La construction de chaque respiromètre individuel peut être adapté aussi longtemps que la chambre reste étanche à l'air. Cependant, la plus longue, micropipettes minces offrent plus de précision sur les plus courtes. L'utilisation de la chambre extérieure peut être facultative dans la mesure où il n'y a pas de température et de pression ambiantes changements importants pour compromettre l'expérience. Ceci peut être déterminé par analyse du témoin négatif et une grande variabilité au sein des mesures d'échantillons biologiques. En outre, l'absorbeur de CO 2 peut être de n'importe quelle variété tant qu'il n'est pas toxique pour la fmensonges (par exemple, l'hydroxyde de potassium). Il est de la plus haute importance d'avoir un contrôle négatif pour s'assurer que la technique fonctionne correctement. Le problème le plus commun est pour le spiromètre de ne pas être complètement scellé. Si tel est le cas, alors la mesure sera comparable à celle du contrôle négatif. D'autres problèmes pourraient survenir en raison de mouches qui n'ont pas eu le temps de se remettre de l'anesthésie ou ont péri.
L'étape la plus critique dans ce protocole est la construction du spiromètre. Comme indiqué plus haut, le spiromètre doit être étanche. La fixation de la micropipette à la plus grande chambre de la pipette doit être effectuée en respectant la colle. Un adhésif plus semblable à du caoutchouc a le mieux fonctionné. Il est recommandé d'inspecter les respiromètres sous un microscope pour observer aucun compromis sur la structure collée après l'achèvement. En outre, l'étanchéité du respiromètre après mouches ont été placés à l'intérieur est très importante. L'utilisation de mastic hcomme cela a été constaté à travailler mieux et ne rarement. Paraffine a été trouvée à travailler très mal et doit être évitée. Le liquide qui est utilisé pour mesurer le volume de gaz est également très important et doit être manométrique. L'eau est donc le meilleur choix. L'utilisation de l'encre n'est pas recommandé car il peut durcir dans le capillaire faire le spiromètre inutile. Il est également essentiel de ne pas utiliser les femelles reproductrices, nous avons remarqué que leur production de CO 2 peut être très variable. En plus de l'âge de vol est important, par conséquent, les mouches qui sont comparés doivent être du même âge. Dans notre test, nous avons utilisé de vieux mâles 5 jours. Le fond génétique de vol est également important. Les mouches de contrôle devraient être du même fond génétique par rapport aux mutants. Les données peuvent également être présentées sous forme (l / h / mg) par la mesure de la masse des mouches après la réalisation du test s'il existe des différences significatives de la taille des mouches. Dans nos mains, une mouche de type sauvage pèse 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). Il convient également de souligner que pendant le moment de l'expérience, on obtient les valeurs de la vitesse du métabolisme de la moyenne. Nous avons également constaté qu'il est possible de mesurer une mouche individuelle, mais nous atteint la plus haute précision utilisant 3-5 mouches. L'espace disponible dans respiromètre pour vol est assez qu'ils ne se sentent pas surpeuplé, mais en même temps ils n'ont pas d'espace pour marcher intensive: donc géotaxie défectueux ne devraient pas avoir d'effet sur le niveau de production de CO 2.
Les mouches sont établis depuis longtemps comme l'un des principaux organismes modèles pour étudier les maladies humaines qui sont liées à la biologie du développement, la biologie cellulaire et de la neurobiologie. Un certain nombre d'études récentes ont montré que les mouches peuvent facilement être utilisés pour étudier l'homéostasie énergétique ainsi (revue dans 12, 13). La méthode présentée ici peut facilement être utilisé dans les écrans génétiques pour identifier de nouveaux composants moléculaires éventuellement impliqués dans le contrôle du moiétat tabolic avant l'achat d'équipement plus précis et plus coûteux. Jusqu'à présent, la majorité de ces écrans ont été réalisées uniquement dans la culture cellulaire qui indique que des études plus poussées sont nécessaires.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Max-Planck pour le financement de nos recherches.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
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