Summary
Stoffwechselstörungen gehören zu einer der häufigsten Erkrankungen des Menschen. Die genetisch manipulierbaren Modellorganismus D. melanogaster kann verwendet werden, um neue Gene, die den Stoffwechsel regulieren, zu identifizieren. Dieses Papier beschreibt eine relativ einfache Methode, die die Untersuchung der Stoffwechselrate in Fliegen durch die Messung ihrer CO 2-Produktion ermöglicht.
Abstract
Stoffwechselstörungen sind ein häufiges Problem, die die menschliche Gesundheit. Daher ist das Verständnis der Mechanismen, die den Stoffwechsel regulieren, ist eine entscheidende wissenschaftliche Aufgabe. Viele krankheitsverursachenden Gene in Menschen haben eine Fliege Homolog, so dass Drosophila ein gutes Modell, um Signalwege in der Entwicklung verschiedener Erkrankungen beteiligt zu studieren. Zusätzlich wird die Lenkbarkeit von Drosophila vereinfacht genetische Screens bei der Identifizierung neuer therapeutischer Targets, die den Stoffwechsel regulieren kann helfen. Um einen solchen Bildschirm führen eine einfache und schnelle Methode, um Änderungen in der Stoffwechselzustand entfernt ist notwendig, zu identifizieren. Im allgemeinen ist die Produktion von Kohlendioxid ein guter Indikator für die Substratoxidation und Energieaufwand die Bereitstellung von Informationen über die Stoffwechsellage. In diesem Protokoll führen wir eine einfache Methode, um CO 2-Ausstoß von Fliegen messen. Diese Technik kann möglicherweise helfen bei der Identifizierung von genetischen Störungen beeinflussen die Stoffwechselrate.
Introduction
Die biochemischen Krebs-Zyklus erzeugt ATP durch Oxidation von Acetat aus Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen produzieren CO 2 abgeleitet. In Drosophila, O 2-Eingang direkt mit CO 2-Ausstoß korreliert und spiegelt das Niveau des Stoffwechsels ein. So Messung der CO 2-Ausstoß ist erfolgreich in Studien zur Alterung und Stoffwechsel 2-5 Zusammenhang verwendet. Hier unser Labor zuvor entworfen Versuchsaufbauten modifiziert, so dass Messung von CO 2-Produktion in bis zu achtzehn Proben ohne jede Spezialausrüstung erfordern. Andere und wir haben auch bisher diese Methode, um Unterschiede in der Stoffwechselraten in den Fliegen, die einen Mangel in der Muskeldystrophie assoziierten Protein, Dystroglycan (Dg) 6-8 sind zu zeigen.
O 2 für oxidativen Stoffwechsel verwendet wird, in CO 2, der als Atemwegs Abfall ausgestoßen wird, umgewandelt wird. Der Baution von Hand hergestellt Respirometer beschrieben, die zur Bestimmung der Rate der O 2-Verbrauch kann. Fliegen werden in einem versiegelten Behälter mit einer Substanz, die CO 2 absorbiert vertrieben werden, mit dem gasförmigen Phase wirksam eliminieren. Die Änderung des Gasvolumens (verminderte Druck) wird durch die Verdrängung des Fluids in einer Glaskapillare mit dem geschlossenen Spiro angebracht war, gemessen.
Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber anderen sind die Kosten. Frühere Studien haben CO 2-Produktion durch Drosophila mit Gasanalysatoren und technisch ausgereifte Systeme Respirometrie 1,9 gemessen. Trotz der komplexeren Geräten ist die Empfindlichkeit der hier beschriebenen Verfahren ähnlich berichteten Werten (Tabelle 1). Darüber hinaus haben mehrere andere Gruppen Varianten dieser Technik verwendet, um relative Stoffwechselraten in Drosophila 4-6 bestimmen. Daher kann dieser Assay verwendet werden, um verlässigen erzeugenle, relevant Drosophila Stoffwechsel ohne den Erwerb von Spezialgeräten, die Konfiguration für jedes Labor sein kann und für pädagogische Zwecke verwendet werden reproduzierbare Daten.
Im allgemeinen ist die akzeptierten Techniken, um den Stoffwechsel des Organismus zu bestimmen, messen die CO 2 erzeugt, das O 2 verbraucht oder beides 3,4,9. Obwohl, kann angenommen werden, daß ein Äquivalent von O 2 erzeugt ein Äquivalent von CO 2 ist, das genaue Verhältnis von CO 2 erzeugt wird, ist abhängig von der Stoffwechselsubstrat 10 verwendet. So ist es, um die Stoffwechselrate in Energieeinheiten notwendig, genau zu bestimmen, zu messen, sowohl O 2 verbraucht und CO 2 erzeugt. Aus diesem Grund ist das hier beschriebene Verfahren besonders relevant Vergleich Unterschiede in CO 2-Produktion von Tieren und der Absolutwert. Unsere Technik integriert mehrere Tier CO 2-Produktion über einen Zeitraum von time (1-2 Stunden) und damit gibt eine durchschnittliche Aktivität der Tiere. Wenn es einen Grund zu glauben, dass die Versuchstiere weniger aktiv als bei den Kontrolltieren konnten die Mess verschiedenen Ebenen der Aktivität und nicht unbedingt Stoffwechsel widerspiegeln.
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Protocol
1. Vorbereitung der Respirometer
- Schneiden Sie die 1.000 ul Pipettenspitze mit einer Rasierklinge, um die Einführung der 50-ul Kapillar-Mikropipette zu ermöglichen, versuchen, die Pipettenspitze so gerade wie möglich zu erhalten.
- Legen Sie ein Stück Schaumstoff in die Pipette und drücken Sie ihn in der Pipettenspitze.
- Eine kleine Menge des CO 2 absorbierenden und enthalten es durch ein zweites Stück Schaumstoff.
- Leim an der Stelle, wo die Mikropipette in die Pipettenspitze eingelegt.
- Verlassen Sie die Respirometer über Nacht, damit der Leim trocknen.
Eine schematische Darstellung eines Spiro ist in 1A gezeigt.
2. Herstellung der Messkammer
- Bereiten Sie die Kammer-Lösung durch Mischen von Wasser mit Eosin in einem Verhältnis, das im sichtbaren Einfärbung führen wird.
- Gießen Sie die Eosin-/ Wasser-Lösung in die Kammer.
- Beschriften Sie eine der Seiten der Kammer mit einer Zentimeter-Skala.
- Beschriften Sie die einzelnen Respirometer mit einem Marker.
- Anesthetize Fliegen mit einer anderen Methode zu CO 2 und legen 3-5 Fliegen des gewünschten Genotyps in jedem Respirometer.
- Verschließen Sie die Respirometer dicht an der Spitze mit Plastilin Kitt.
- Lassen Sie Fliegen von Betäubung für ca. 15 min zu erholen.
- Bereiten Sie eine Respirometer ohne Fliegen, die als die atmosphärische Steuerung verwendet wird.
4. Durchführung des Experiments
- Hängen die Respirometer in der Kammer, indem ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen Halter, der auf der Oberseite und der Unterseite an der Oberseite der Kammer offen ist.
- Legen Respirometer mit der Mikropipette Spitze nach unten in die Kammer so dass die Spitze in die Farblösung eintauchen.
- In Vaseline zwischen dem Deckelabdeckung und der Kammer, um stärkere Isolation von Temperatur-und Druck fluct bietenuations.
- Schließen Sie den Deckel und lassen Sie das System für 15 Minuten ins Gleichgewicht.
- Machen Sie ein Foto von der Kammer darauf achten, dass der Flüssigkeitsstand innerhalb der einzelnen Mikropipette sichtbar ist und so ist die Skala (siehe Beispiel in Abbildung 1B).
- Nach 1-2 Stunden, nehmen Sie ein anderes Bild.
- Als Experiment ist abgeschlossen, entfernen Sie die Fliegen aus Respirometer und wiegen, wenn gewünscht oder übertragen Sie sie zurück in das Fläschchen, wenn weitere benötigt.
5. Analyse der Ergebnisse
- Offene erfassten Bilder mit ImageJ Software 11.
- Mit der Skala in jedem Bild, stellen Sie die Pixel-Skalierung in der Software.
- Den Abstand (&Dgr; d) daß die Flüssigkeit von einem bestimmten Referenzpunkt in den Bildern am Anfang (d1) aufgenommen und zurück Ende des Experiments (d2). Ein schematisches Beispiel ist in Fig. 1C gezeigt.
- Berechnen der Menge an erzeugtem CO 2 (&mgr; l / hr / Fliege) mit der Formel:
R = Radius der Mikropipette Rohr in cm
&Dgr; D = Abstand die Flüssigkeit in der Mikropipette von Testproben in Zentimetern gemessen bewegt
&Dgr; C = Abstand die Flüssigkeit in der Mikropipette der negativen Kontrollprobe (ohne entfernt) bewegt
n = Anzahl der Fliegen verwendet
h = Stunden
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Representative Results
Um zu zeigen, dass die Methode ist empfindlich uns gemessenen CO 2-Produktion aus dem Wildtyp (Oregon R) männlich fliegt bei 18, 25, und 29 ° C und fliegt Mutante für Dg. Die Fliegen wurden bei 25 ° C erhöht und dann verschoben, um die Versuchstemperatur 5 Tage lang vor der Messung. Wie für diese Art ectothermic erwartet, die Menge an CO 2 erzeugt erhöhte Temperatur (Abbildung 2). Wir haben in der Vergangenheit gezeigt, dass eine zuckerfreie Diät reduziert die Stoffwechselrate sowohl von Wildtyp und Mutante Dg fliegt 7. Der Verlust von Dg führt zu einer erhöhten Stoffwechsellage (Fig. 2).
Abbildung 1. Aufbau zur Messung der CO 2-Produktion im Fliegen. A. Schematische Darstellung ter Bau der einzelnen Respirometer. B. Foto von der Kammer während der CO 2-Messung. Buchstaben markieren die Position der Respirometer. Vertikale Zahlen zeigen Skala in Zentimetern. C. Schematische Darstellung der Veränderungen während des Experiments. Grüne Linie zeigt Referenzpunkt (d1), blau zeigt die endgültige Position der Flüssigkeit nach 2 Stunden (d2). &dgr; D ist der Abstand der Mikropipette die Flüssigkeit zurückgelegt hat.
Abbildung 2. CO 2-Produktion in Fliegen bei unterschiedlichen Temperaturen und in Dg Mutanten. Gehäusetemperatur positiv korreliert mit der CO 2-Produktion in Drosophila und deutlich in Dg Mutanten erhöht. Fehlerbalken zeigen SEM aus vier Einzelexperimenten, *** p ≤ 0.01.
| (Ul / Fliegen x Stunde) | Ausrüstung verwendet | Referenz |
| 3.2 CO 2 | CO 2-Gas-Analysator | (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2004) |
| 4.68 ± 1.04 CO 2 | CO 2-System Respirometrie | (Khazaeli, Van Voorhies et al. 2005) |
| 2,9-6,2 O 2 | Ähnlich gestaltet Respirometer | (Hulbert, Clancy et al. 2004) |
| 2,20 ± 0,15 O 2 | Beschrieben hier handgemachte Respirometer | (Kucherenko, Marrone et al. 2011) |
| * Tabelle sind Werte von Studien, die Zahlenwerte von Fliegen gemessen bei 25 ° C zu melden |
Tabelle 1. Vergleichverschiedener Techniken verwendet, um CO 2-Produktion durch Drosophila messen.
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode zur Messung der CO 2-Produktion in Fliegen. Wir fanden, dass dieses Experiment ist einfach, schnell durchzuführen und erzeugt reproduzierbare Daten, die in Übereinstimmung mit anderen Studien, 1, 6, 9 ist. Das hier beschriebene Protokoll kann leicht geändert werden, um Budget und verfügbaren Materialien jedes möglichen Labor passen. Die Konstruktion jedes einzelnen Respirometers kann, solange die Kammer luftdicht bleibt angepasst werden. Je länger, dünner Mikropipetten bieten jedoch mehr Präzision über kürzere. Die Verwendung der äußeren Kammer kann, solange es keine signifikanten Umgebungstemperatur und Druckänderungen, den Versuch beeinträchtigen optional sein. Dies kann durch Analyse der Negativkontrolle und eine große Variabilität in der biologischen Probe Messungen bestimmt werden. Zusätzlich kann das CO 2 absorbierende jeder Sorte, solange es nicht toxisch für den fLügen (zB Kaliumhydroxid). Es ist von äußerster Wichtigkeit, um eine negative Kontrolle, um sicherzustellen, daß das Verfahren korrekt funktioniert haben. Das häufigste Problem ist für die Respirometer nicht vollständig versiegelt werden. Wenn dies der Fall ist, dann wird die Messung vergleichbar mit der Negativkontrolle ist. Zusätzliche Probleme könnten durch Fliegen, die nicht Zeit, sich von der Betäubung erholen hatten oder umgekommen entstehen.
Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist der Aufbau des Spiro. Wie oben erwähnt, muss die Spiroluftdicht sein. Die Befestigung der Mikropipette auf die größere Kammer muss mit der richtigen Klebstoff verwendet werden. Eine gummiartigen Kleber am besten funktioniert. Es wird empfohlen, die Respirometer unter dem Mikroskop untersuchen, um keine Kompromisse in der Klebestruktur nach Fertigstellung zu beobachten. Darüber hinaus ist die Abdichtung des Spiro nach innen angeordnet sind entfernt worden sehr wichtig. Die Verwendung von Kitt hals erwiesen, am besten funktionieren und nicht selten. Paraffin hat sich herausgestellt, sehr schlecht arbeiten und sollte vermieden werden. Die Flüssigkeit, die verwendet wird, um Gasvolumen zu messen, ist sehr wichtig und sollte manometrischen sein. Wasser ist daher die beste Wahl. Die Verwendung von Tinte wird nicht empfohlen, da es in der Kapillare verhärten was die Respirometer nutzlos. Es ist auch wichtig, nicht zu verwenden, reproduzieren Frauen, als wir merkten, dass ihre CO 2-Produktion kann sehr variabel sein. Neben dem Alter von Fliegen ist daher wichtig, die Fliegen, die verglichen werden sollen im gleichen Alter sein. In unserem Test haben wir 5 Tage alten Männer. Der genetische Hintergrund der Fliegen ist ebenfalls wichtig. Die Kontrollfliegen sollte die gleiche genetische Hintergrund im Vergleich zu Mutanten sein. Die Daten können auch als (&mgr; l / h / mg) durch Messen der Masse der Fliegen nach dem Test, ob es signifikante Unterschiede in der Größe von Fliegen vorgestellt. In unseren Händen wiegt ein Wildtyp-Fliege 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). Es sollte auch darauf hingewiesen, dass während des Zeitablaufs des Versuchs, die Werte der Durchschnittsstoffwechselrate erhalten werden. Wir haben auch festgestellt, dass es möglich ist, eine einzelne Fliege messen, aber wir erzielten den höchsten Präzision mit 3-5 Fliegen. Die in Respirometer für Fliegen Raum ist genug, dass sie sich nicht überfüllt, aber zur gleichen Zeit, die sie nicht haben Raum, sich intensiv zu gehen: also defekt Geotaxis sollte keinen Einfluss auf die Höhe der CO 2-Produktion haben.
Fliegen sind seit langem als einer der wichtigsten Modellorganismen für die menschliche Krankheiten, die zu Entwicklungsbiologie, Zellbiologie, Neurobiologie und beziehen studieren etabliert. Eine Reihe von aktuellen Studien haben gezeigt, dass Fliegen kann leicht verwendet werden, um Energie-Homöostase als auch studieren (in 12, 13 überprüft) werden. Das hier vorgestellte Verfahren kann leicht in der genetischen Bildschirme verwendet werden, um neue molekulare Komponenten möglicherweise bei der Kontrolle der beteiligten mich identifizierentabolic Zustand vor dem Kauf genauer und teure Ausrüstung. So weit die Mehrheit solcher Bildschirme wurden nur in der Zellkultur getan angibt, dass fortgeschrittene Studien sind gerechtfertigt.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten die Max-Planck-Gesellschaft für die Finanzierung unserer Forschung danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
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