Summary
Metabola sjukdomar är bland en av de vanligaste sjukdomarna hos människor. Den genetiskt lätthanterlig modellorganism D. melanogaster kan användas för att identifiera nya gener som reglerar metabolism. Detta dokument beskriver en relativt enkel metod som gör det möjligt att studera den metaboliska hastigheten i flugor genom att mäta deras CO 2 produktion.
Abstract
Metabola sjukdomar är ett vanligt problem som påverkar människors hälsa. Därför att förstå de mekanismer som reglerar ämnesomsättning är en viktig vetenskaplig uppgift. Många sjukdomar som orsakar gener hos människor har en fluga homolog, vilket gör Drosophila en bra modell för att studera signalvägar som är involverade i utvecklingen av olika sjukdomar. Dessutom, den spårbarhet Drosophila förenklar genetiska skärmar för att hjälpa till att identifiera nya terapeutiska mål som kan reglera ämnesomsättningen. För att kunna utföra en sådan skärm är det nödvändigt med en enkel och snabb metod för att identifiera ändringar i det metaboliska tillståndet hos flugor. I allmänhet är koldioxidproduktion en god indikator på substrat oxidation och energiförbrukning som ger information om metaboliskt tillstånd. I detta protokoll introducerar vi en enkel metod för att mäta CO 2 som utmatas från flugor. Denna teknik kan potentiellt hjälpa till vid identifieringen av genetiska störningar som påverkar ämnesomsättning.
Introduction
Den biokemiska Krebs cykel genererar ATP genom oxidation av acetat som härrör från kolhydrater, fetter och proteiner som producerar CO 2. I Drosophila, O 2 ingång är direkt korrelerad med CO2-utgång och avspeglar graden av metabolism 1. Således har mätning av CO2-utgång med framgång använts i studier relaterade till åldrande och ämnesomsättning 2-5. Här vårt laboratorium har ändrat tidigare utformade experimentella uppställningar, möjliggör mätning av CO 2-produktion i upp till arton proverna utan att kräva någon specialutrustning. Andra och vi har tidigare använt denna metod för att visa skillnader i metabola priser på flugor som har brist på det muskeldystrofi associerat protein, Dystroglycan (Dg) 6-8.
O 2 används för oxidativ metabolism omvandlas till CO 2, som drivs ut som andnings avfall. Byggning av handgjorda respirometers beskrivs som medger bestämning av graden av O 2 konsumeras. Flugor placeras i en sluten behållare med ett ämne som absorberar utvisas CO 2, effektivt eliminera den från gasfasen. Förändringen i gasvolymen (nedsatt tryck) mäts genom förskjutning av fluid i en glaskapillär fäst vid den slutna respirometer.
Den största fördelen med denna teknik framför andra är kostnaden. Tidigare studier har mätt CO2 produktion av Drosophila hjälp av gasanalysatorer och tekniskt avancerade respirometri system 1,9. Trots den mer komplicerad utrustning, är känsligheten hos den här beskrivna metoden liknar rapporterade värden (tabell 1). Dessutom har flera andra grupper som används varianter av denna teknik för att bestämma relativa metabola priser i Drosophila 4-6. Därför kan denna analys användas för att generera reliable, reproducerbara data med avseende på Drosophila metabolism utan inköp av specialutrustning som kan ställas in på något labb och kan användas i undervisningssyfte.
I allmänhet är de erkända metoder för att bestämma metabolismen av en organism är att mäta CO 2 produceras, O 2 konsumeras, eller både och 3,4,9. Även om, kan det antas att en ekvivalent av O 2 alstrar en ekvivalent av CO 2, varvid den exakta förhållandet av CO2 som alstras beror på den metaboliska substrat utnyttjas 10. Således är det nödvändigt att mäta både O 2 konsumeras och CO 2 produceras för att noggrant bestämma den metaboliska hastigheten i energienheter. På grund av detta, är den här beskrivna metoden är särskilt relevant för att jämföra skillnader i CO 2 produktion mellan djur och inte det absoluta värdet. Vår teknik integrerar flera djur CO2 produktionen under en period av Time (1-2 h) och därför återvänder ett genomsnitt av djurens aktivitet. Om det finns anledning att tro att försöksdjuren är mindre aktiva än kontrolldjuren mätningen kan återspegla olika aktivitetsnivåer och inte nödvändigtvis ämnesomsättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Respirometers
- Skär 1,000 l pipettspetsen med ett rakblad för att möjliggöra insättning av 50 ^ kapillär mikropipett, försöka få pipettspetsen så rakt som möjligt.
- Lägg en bit skum i pipetten och tryck ner den i pipettspetsen.
- Tillsätt en liten mängd CO2 absorberande och innehåller det genom en andra bit av skum.
- Applicera lim på den plats där mikropipett sätts in i pipettspetsen.
- Låt respirometer över natten för att låta limmet torka.
En schematisk bild av en respirometer visas i figur 1A.
2. Beredning av mätkammaren
- Förbered kammarlösningen genom att blanda vatten med eosin i ett förhållande som kommer att resultera i synligt färgläggning.
- Häll eosin / vattenlösningen in i kammaren.
- Märk en av sidorna av kammaren med en centimeter skala.
- Märk de enskilda respirometers med en markör.
- Söva flugor med en alternativ metod till CO 2 och placera 3-5 flugor i önskad genotyp inuti varje respirometer.
- Täta respirometers tätt i toppen med hjälp av model kitt.
- Låt flugor att återhämta sig från bedövning i ca 15 min.
- Förbered en respirometer utan flugor, som kommer att användas som den atmosfärkontroll.
4. Utföra experiment
- Häng respirometers i kammaren genom att fästa en 1,5 ml Eppendorf-rör-hållare som är öppen i toppen och botten på den övre delen av kammaren.
- Sätt respirometers med mikropipett spetsen nedåt in i kammaren tillåter spetsen att dränka in den färgade lösningen.
- Lägg vaselin mellan locket locket och kammaren för att åstadkomma starkare isolering från temperatur och tryck fluctationer.
- Stäng locket och tillåta systemet att jämvikta i 15 min.
- Ta ett fotografi av kammaren och se till att nivån på vätskan i varje mikropipett syns och så är skalan (se exemplet i figur 1B).
- Efter 1-2 timmar, ta en ny bild.
- När experimentet är klar, ta bort flugorna från respirometers och väger om så önskas eller överföra dem tillbaka till flaskan om det behövs ytterligare.
5. Analys av resultat
- Öppna förvärvade bilder med ImageJ programvara 11.
- Med hjälp av skalan i varje bild, ställ in pixel skalning i programvaran.
- Mät avståndet (Ad) att vätskan reste från en bestämd referens plats i bilder tagna i början (d1) och slutet av experimentet (d2). Ett schematiskt exempel visas i figur 1C.
- Beräkna mängden producerad CO 2 (j, l / tim / fluga) med formeln:
R = radie mikropipett röret i centimeter
Ad = sträcka vätskan har flyttat upp i mikropipett av proverna mätt i centimeter
Δc = avstånd vätskan har rört sig uppåt i mikropipett av provet negativ kontroll (utan flugor)
n = antalet flugor som används
h = timmar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att visa att metoden är känslig vi mätte CO2 produktion från vildtypen (Oregon R) män flyger på 18, 25 och 29 ° C och flyger mutant för Dg. Flugor höjdes vid 25 ° C och sedan skiftas till den experimentella temperatur under 5 dagar före mätningen. Som förväntat för denna ectothermic art, mängden CO2 som producerats ökade med temperaturen (Figur 2). Vi har tidigare visat att en sockerfri diet minskar ämnesomsättningen av både vildtyp och Dg mutant flugor 7. Förlusten av Dg leder till ökade metaboliska nivåer (Figur 2).
Figur 1. Uppställning för mätning av CO 2-produktion i flugor. A. Schematisk visar than byggandet av den enskilde respirometer. B. Fotografera av kammaren under CO 2-mätning. Brev markera positionen för respirometers. Vertikala siffror indikerar skala i centimeter. C. Schematiskt visar ändringarna under experimentet. Grön linje visar Referensavistakurs (d1), visar blå den slutliga positionen av vätskan efter 2 timmar (d2). AD är avståndet vätskan har rest i mikropipetten.
Figur 2. CO2 produktion i flugor vid olika temperaturer och i Dg mutanter. Bostäder temperatur korrelerar positivt med CO 2-produktion i Drosophila och ökar signifikant i Dg mutanter. Felstaplar visar SEM från fyra enskilda experiment, *** p ≤ 00,01.
| (L / flyga x timme) | Utrustning som används | Referens |
| 2-3 CO 2 | CO 2 gasanalysator | (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2004) |
| 4,68 ± 1,04 CO2 | CO2 respirometri systemet | (Khazaeli, Van Voorhies et al. 2005) |
| 2,9-6,2 O 2 | På liknande sätt utformade respirometers | (Hulbert, Clancy et al. 2004) |
| 2,20 ± 0,15 O 2 | Beskrivs här handgjorda respirometers | (Kucherenko, Marrone et al. 2011) |
| * Värdena i tabellen är från studier som rapporterar numeriska värdena av flugor som uppmätts vid 25 ° C |
Tabell 1. Jämförelseav olika tekniker som används för att mäta CO2 produktion av Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, beskriver vi en billig och tillförlitlig metod för mätning av CO 2 produktion i flugor. Vi fann att detta experiment är enkelt, snabbt att genomföra och ger reproducerbara data som stämmer överens med andra studier 1, 6, 9. Det protokoll som beskrivs här kan lätt modifieras för att passa alla laboratoriets budget och tillgängliga material. Konstruktionen av varje enskild respirometer kan anpassas så länge kammaren blir otät. Men ju längre, tunnare mikropipetter ger mer precision än kortare. Användningen av den yttre kammaren kan vara valfria så länge som det inte finns några betydande omgivande temperatur och tryckförändringar att komma experimentet. Detta kan bestämmas genom analys av den negativa kontrollen, och en stor variation inom mätningar biologiskt prov. Dessutom kan CO 2 absorberande vara av vilken sort så länge som det inte är toxiskt för fbefinner sig (t.ex. kaliumhydroxid). Det är av yttersta vikt att ha en negativ kontroll för att se till att tekniken fungerar som den ska. Det vanligaste problemet är att respirometer att inte tätas helt och hållet. Om detta är fallet, då mätningen kommer att vara jämförbar med den för den negativa kontrollen. Ytterligare problem kan uppstå på grund av flugor som inte har haft tid att återhämta sig från bedövning eller har omkommit.
Det mest kritiska steget i detta protokoll är byggandet av respirometer. Som nämnts ovan måste respirometer vara lufttät. Fastsättningen av mikropipett till större pipett kammaren måste göras med rätt lim. En mer gummiliknande lim har fungerat bäst. Det rekommenderas att inspektera respirometers i mikroskop för att observera eventuella kompromisser i den limmade konstruktionen efter slutförandet. Dessutom är det mycket viktigt att tätningen av respirometer efter flugor har placerats inuti. Användningen av kitt hsom visat sig fungera bäst och misslyckas sällan. Paraffin har befunnits fungera mycket dåligt och bör undvikas. Den vätska som används för att mäta gasvolym är också mycket viktigt och bör vara manometriska. Vatten är därför det bästa valet. Användning av bläck rekommenderas inte eftersom det kan härda i kapillären gör respirometer värdelös. Det är också viktigt att inte använda reproducerande honor, eftersom vi har märkt att deras CO2-produktionen kan vara mycket varierande. Dessutom är det viktigt åldern av flugor, därför flugorna som jämförs bör vara av samma ålder. I vårt test använde vi fem dagar gamla hanar. Den genetiska bakgrunden av flugorna är också viktigt. Styr flugor bör vara av samma genetiska bakgrund jämfört med mutanter. Uppgifterna kan också presenteras som (l / tim / mg) genom att mäta massan av flugorna efter att ha utfört analysen om det finns betydande skillnader i storlek på flugorna. I våra händer, väger en vild typ fluga 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). Det bör också påpekas att under tiden för experimentet är värdena för den genomsnittliga ämnesomsättning erhölls. Vi har också funnit att det är möjligt att mäta en enskild fluga, men vi uppnådde den högsta precision med hjälp av 3-5 flugor. Den finns i respirometer för flugor utrymme är nog att de inte känner sig överfulla, men samtidigt att de inte har utrymme för att gå intensivt: därför defekta geotaxis bör inte ha någon effekt på nivån av CO2 produktion.
Flugor har länge etablerad som en av de stora modellorganismer för att studera mänskliga sjukdomar som är relaterade till utvecklingsbiologi, cellbiologi, och neurobiologi. Flera nya studier har visat att flugor lätt kan användas för att studera energi homeostas samt (över i 12, 13). Den metod som presenteras här kan lätt användas i genetiska skärmar för att identifiera nya molekylära komponenter möjligen är involverade i att kontrollera migtabolic tillstånd innan du köper mer exakt och dyr utrustning. Hittills majoriteten av dessa skärmar gjordes endast i cellkultur som indikerar att mer avancerade studier är motiverade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Max-Planck-sällskapet för att finansiera vår forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).
- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takeuchi, K., et al. Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants. Science. 323, 1740-1743 (2009).
- Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components. Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).
- Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles. Scientific Reports. 1, 47 (2011).
- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. Genetics. 169, 231-242 (2005).
- Elia, M. Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques. The American Journal of Physiology. 260, (1991).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Bharucha, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism. Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, 38 (2013).
