Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מודל הלמידה Lateralized ריח חולדות ילודים לביתור גיבוש עצבי מעגל בבסיס זיכרון

Published: August 18, 2014 doi: 10.3791/51808
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University, 2Division of Medical Sciences, University of Victoria
* These authors contributed equally

Introduction

Olfaction הוא השיטה העיקרית חושית במכרסמים, שבלעדיו הם לא יהיו מסוגלים לנווט או לשרוד בסביבה שלהם בהצלחה. זה קריטי במיוחד עבור גורים בילוד, שלא יכול לראות ולא לשמוע במהלך השבוע שלאחר הלידה הראשונה, להשתמש olfaction על מנת לאתר את האמא שלהם כדי להאכיל 1. כתוצאה מכך, יכולים להיות מותנים גורי חולדה ילוד להעדיף ריחות עם מניפולציות ניסיוני פשוטות. מגוון רחב של גירויים היה בשימוש כגירוי הבלתי מותנה (UCS) כדי לגרום לתגובות מותנות לריחות רומן (גירוי מותנה, CS) בילודים, לרבות סביבת קינון 2,3, יונק חלב 4-6, מלטף או גירוי חוש המישוש 7- 12, קמצוץ זנב 13, רוק אימהי 13, הלם רגל קל 14-18, וגירוי מוח תוך גולגולתי 19. המחקר הנוכחי מעסיק הפרדיגמה העדפת ריח המוקדם מבוססת היטב שבו ריח, במקרה מנטה זה, אניs בשילוב עם גירוי חוש המישוש על מנת לייצר העדפה למנטת 24 שעות מאוחר יותר 10,11,20. זכרונות ריחות אלה נשענים על מעגלי חוש הריח שלמים, הכוללים בעיקר את נורות חוש הריח (OB) 21-23 וקליפת המוח הקדמי אגסי (APC) 24,25.

חקירות ניסיוניות של למידת העדפת ריח המוקדמת העמיקו והרחיבו את ההבנה של היסודות המולקולריים ופיסיולוגיים של זיכרון יונקים שלנו. יש מודל של יונקים זה מספר יתרונות בלימוד מנגנוני זיכרון. ראשית, המקורות העצביים של אות UCS זוהו. גירויים שונים כאמור לעיל לעורר שחרור לוקוס נוראפינפרין coeruleus 26, אשר בתורו מפעיל adrenoceptors מרובה בOB וAPC, לגרום לתופעות תאיות ופיזיולוגיות התומכות בלמידה 22,27,28. שנית, מנגנונים תומכי זיכרון יתקיימו במבנים עצביים מינרית מוגדרת היטב.פשטות של מעגלי חוש הריח בחולדות בילוד מספקת לחוקרים את המסגרת האידיאלית שעם לחשוף את התהליכים המורכבים הקשורים לפלסטיות הסינפטית. נוירונים חושיים ריח (OSN) בפרויקט אפיתל ההרחה על צניפי תאים מצוייצים / בOB וצניפי תאים אלה / מצוייצים בפרויקט תור ipsilaterally לקליפת אגסי (PC) באמצעות לרוחב דרכי חוש הריח (הרבה), בין מבנים אחרים 29. שתי סינפסות OSN בOB 30,31 והרבה סינפסות 24,25 בAPC זוהו כמוקדים קריטיים לשינויים סינפטיים שתומכים בלמידה ובזיכרון. שלישית, בגיל צעיר בחולדות, יכולות בקלות להיות lateralized תשומות חוש הריח. לכל אחד יש APC גישה למידע ריח דו צדדי באמצעות השליך קדמי פעם אחת בחומר הלבן הזה נוצר במלואו ביום 12 שלאחר לידה (PD12) 32. לפני 12 PD, קלט ריח יכול להיות מבודד לipisilateral OB וAPC דרך חסימת Naris יחידה 24,25,31,33,34 </ Sup>. חסימת Naris יחידה מאפשרת את היווצרות זיכרון הריח מNaris הפתוח, ומונעת את אותו זיכרון מNaris occluded לפני פ"ד 12 33. זיכרון ריח מבודד לחצי כדור ipsilateral כולל שני OB וAPC. לכן, כל גור חולדה יכול להיות שליטה משלו ללימוד ושבסיס פיזיולוגיה.

במחקר הנוכחי, פרוטוקול למידת העדפת הריח המוקדם lateralized הוא הציג. שיטה זו משמשת ככלי רב עוצמה ללימוד מנגנונים עצביים שבבסיס למידת ריח על ידי מתן שליטת התוך בעלי חיים 24,25,31, וכך להקטין הן את מספר בעלי החיים הנדרשים ווריאציה הכללית. חסימת Naris היא הפיכה שבתוספת השומן או האף יכולה להיות מיושמת ולהסיר עם לחץ או לניזק לבעלי החיים מינימאליים. כאן, לראשונה, נהלים מפורטים של אימוני העדפת ריח מוקדם ובדיקות מתוארים, עם דגש על פרוטוקול lateralized באמצעות חסימת Naris יחידה עם nosתקע דואר. לאחר מכן תוצאות מוצגות כדי להדגים את היעילות של חסימת Naris בודדת בבידוד קלט ריח והפקת זיכרון ריח lateralized. לבסוף, הפוטנציאל של שימוש במודל למידת lateralized זה ללמוד שינויים פיסיולוגיים במערכת חוש הריח שגם ליצור ביטוי למידה וזיכרון תמיכה הם דנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

גורי החולדה ספראג Dawley (Charles River) משני המינים נמצאים בשימוש. המלטות נבחרות ל12 על PD1 (לידה להיות PD0). הסכרים נשמרים בשעתי אור 12 / מחזור כהה גישה כרצונך מודעת מזון ומים עם. הפרוצדורות שאושרו על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית של האוניברסיטה ממוריאל טיפול.

בניית Plug 1 Nose

הערה:. הליך זה הותאם ושונה מאל קאמינגס et (1997) 35.

  1. צינורות aquire 20-פוליאתילן ו3-0 חוט תפר משי.
  2. חותכי חתיכה קטנה של 20-פוליאתילן צינורות כ 0.8 מ"מ.
  3. תפר משי חוט דרך צינורות מוכנים כך שיש חוט משני צדי הקטע של צינור.
  4. בקצה אחד של החוט מחוץ לתקע, לקשור קשר בחוט.
  5. משוך את הקטע של צינורות מעל הקשר בחוט. הקשר צריך להגיש בתוך צינורות.
  6. חתוך את שני הקצוות של החוט כזה ש~ 2 מ"מ של חוט בולט מקצה אחד של הצינור (ראה איור 1 א).

.2 Naris ספיגה לפני אימון

  1. הסר גור מהסכר ומניחים בצלחת מאובטחת מכוסות במצעים רגילים.
  2. השתמש ביישום קצה כותנה להספיג ג'לי הרדמה מקומי, 2% Xylocaine, על Naris להיות occluded.
  3. לאפשר את הגור לנוח בצלחת ל~ 3 דקות.
  4. החזק את הגור בעדינות אך באופן מאובטח ביד הלא הדומיננטית.
  5. השימוש ביד הדומיננטית, להרים תקע האף ולהספיג אותו ג'לי ההרדמה המקומי סביב הקצה שממנו החוט לא בולט. זה יפעל כשתי הרדמה לכל כאבי קטין הקשורים להכנסת תקע ויפעל כחומר סיכה בתוך Naris. הערה: ההשפעה של Xylocaine מתחילה בתוך כמה דקות ונמשכת 20-30 דקות. גורים בסובלנות טובה מופע הכללי להכנסת תקע לאחר יישום ג'לי xylocaine (מ 'inimum נאבק וניקוד).
  6. הכנס בעדינות את תקע האף על ידי תוקף מחזיק את הגור ומסתובב באיטיות בתקע בדחיפות מאוד עדינות עד שהתקע מוכנס באופן מלא ורק את החוט 2 מ"מ בולט מNaris (ראה איור 1). לא צריך להיות שום דימום משני Naris במהלך תהליך זה. גורים עם דימום במהלך החדרת תקע האף אינם נכללים וחזרו לסכרים
  7. לאפשר לבעל החיים לנוח במנה זו למשך 5 דקות על מנת להרגיל לתקע.
  8. הסר את הגור מצלחת ההתרגלות ולהתחיל את הפרדיגמה אוויר 24.

איור 1
איור 1 בנייה של התוספת האף. ) שרטוטים המציגים את השלבים של מה שהופך את תקע האף. חוט נמשך דרך צינורות פוליאתילן; קשר הוא עשה וpulהוביל לאמצע הצינור כדי לחסום אותו; שני קצוות נחתכים עם שאריות 2 מ"מ בקצה אחד מצינורות. B) שפתוחה ותצוגה לרוחב של עכברוש עם תקע האף בNaris אחד.

.3 ריחני מצעים הכנה

  1. לבישת כפפות חדשות ובמנדף על מנת למנוע זיהום ריח, למקם 500 מ"ל של מצעי שבבי עץ לתוך שקית ניילון.
  2. השתמש במזרק להכין 0.3 מ"ל תמצית מנטה, ולרסס את זה על המצעים בשקית הניילון.
  3. לקשור את השקית הסגורה, לנער את השקית במרץ, ולאפשר לכלי המיטה לנוח בשקית למשך 5 דקות.
  4. מניחים את המצעים הריחניים בקופסא ברורה, רדודה, אקריליק אימון (20 x 20 x 5 סנטימטר 3, איור 2 א) שנחשפה במנדף ל5 דקות לפני השימוש. ברגע שהמצעים מוכנים, להשליך כפפות אלה, ואינם מאפשר לכפפות אלה כדי לבוא במגע עם בעלי החיים.
  5. מניחים את המצעים ללא בישום בתיבת פלסטיק שקופה זהה, וחדרבטוח שזה לא בא במגע עם המצעים הריחניים או כפפות בשימוש.

.4 ריח אוויר פרדיגמה (ראה תמונה באיור 2 א)

גורים עוברים גם מפגש אוויר אחד, על PD 6, או פגישות מרובות משפט (אימון אחד ביום, פ"ד 3-6).

  1. הנח את הגור המורגל במצעים ריחניים. לריח שליטה בלבד (O / S -) גורים, להשאיר גורים אלה על המצעים עבור 10 דקות, לאחר מכן דילגתי לשלב 4.5. לשבץ + ריח ניסיוני גורים (O / S +), ממשיכים את השלבים הבאים בסעיף זה.
  2. שבץ הגור ל30 שניות באמצעות מכחול קטן. השתמש בתנועות מעגליות מהירות בעיקר סביב האזור האחורי של הגור.
  3. לאפשר את הגור לנוח 30 שניות.
  4. חזור על שלבים 4.2 & 4.3 עבור הסכום כולל של 10 דקות (כלומר 10 זיווגים של ליטוף + ריח).
  5. הסר גור מתיבת האוויר, להסיר את תקע האף ולהחזיר את הגור לסכר.
<class = "jove_title" p> 5. העדפות ריח Lateralized בדיקה (ראה תמונה באיור 2)

בדיקה מתרחשת בנקודות זמן שונות (לדוגמא, שעה 24 או 48) הבאות האימון האחרון. הבדיקה מתבצעת בתא חלד בדיקות פלדה (30 x 20 x 18 סנטימטר 3), אשר ממוקם בחלק העליון של שתי תיבות אימונים (תיבת הכשרה מתוארת ב3.4), מופרדות על ידי אזור ניטראלי 2 סנטימטר. תיבת הכשרה אחת מכילה מצעים בניחוח מנטה ואילו התיבה אחרת מכילה מצעים נקיים, ללא בישום. הרצפה של חדר הבדיקות היא רשת מתכת, אשר לאחר מכן מכוסה בסדין להסרה של רשת פלסטיק (איור 2).

  1. הכן מנטה אחד ומצעים ללא בישום אחד כאמור בסעיף 3, ולמקם כל תיבה שמתחת לשני צדי מתרס של חדר הבדיקות, מלבד 2 סנטימטר. הנח את רשת הפלסטיק על רצפת מתכת הרשת של חדר הבדיקות.
  2. הסר את הגור מהסכר והנח טיפת משרד של גריז סיליקון חסר ריח על Narisשהאפיל במהלך אימון. Re-להחיל את הגריז לאורך כל הליך הבדיקה הראשון בהתאם לצורך. הערה: חסימת Naris אקראית במהלך אימון ובדיקה עשויה להיחשב כדי למנוע הטיה.
  3. הנח גור באזור הניטרלי של חדר הבדיקות.
  4. לאפשר את הגור לחקור את התא 1 דקות, הקלטה כמה זמן את הגור בילה יותר משני הצדדים של החדר (כלומר מעל מנטה או מצעים ניטרליים בניחוח).
  5. לאפשר את הגור לנוח דקות 1 בתא החזקת פלסטיק מכוסה.
  6. חזור על שלבים 5.2 & 5.3 עבור הסכום כולל של 10 דקות (כלומר 5 ניסויי מבחן מופרדים על ידי 5 ניסויי שאר) מיתוג הנטייה הראשונית של הגור בתא על מנת לשלוט על העדפות כיוון.
  7. מייד לאחר בדיקה, לנגב את השומן מNaris.
  8. הכנס noseplug פוליאתילן לNaris ההפך כאמור בסעיף 2 ולאפשר לבעל החיים לנוח במשך 10 דקות.
  9. בחן את הגור שוב כמו ב 5.3 -5.6, להסיר את התקע, ולהחזיר את הגור לסכר. להסיר ולנקות את רשת הפלסטיק של חדר בדיקות עם 95% אתנול ויאפשר לנוזל מתאדה. הנח את הרשת בחזרה לפני בדיקת הגור הבא.
    הערה: יישום גריז סיליקון בחסימת Naris הראשונה במהלך הבדיקה מונעת את הסיכוי לדימום ולחץ הקשור בהחדרת תקע האף.

איור 2
הכשרת איור 2 ריח מוקדם העדפה ובדיקות. ) אימון ריח מוקדם העדפת שימוש בריח + מלטף את הפרדיגמה. B) בדיקת העדפת ריח שתי בחירה עם מצעי מנטה בצד אחד, לשלוט במצעים ללא בישום בצד השני. אזור ניטראלי 2 סנטימטר ממוקם באמצע.

.6 בדיקה אפקטיביות של יחיד Naris ספיגה

nt "> ניסוי זה מתבצע על מנת לקבוע אם חסימת Naris אחת מובילה להפעלת lateralized של מערכת חוש הריח.

  1. לבצע חסימות Naris חד צדדיות על PD 6 או 7 גורים כפי שתואר בסעיף 2.
  2. אחרי ~ 5 דקות התרגלות, למקם את הגור במכל פלסטיק מכוסה וחושף אותה ל30 μl שמן מנטה טהור ספוגים בפיסת הרקמה עבור 10 דקות.
  3. מייד לאחר חשיפת ריח המנטה, להזריק את הגור intraperitoneally (IP) עם כלורל (400 מ"ג / קילוגרם) כהרדמה כללית, או pentobarbitol, (150 מ"ג / קילוגרם).
  4. ברגע שהרדמה מלאה (לא מראה תגובה לזנב או קמצוץ רגל), transcardially ינקב את הגור עם פתרונות קרים כקרח של תמיסת מלח (0.9%) ל~ 1 דקות, ואחריו paraformaldehyde (4%, מומס בפתרון חיץ 0.1 M פוספט, PBS ).
  5. לאחר 10 דקות של זלוף paraformaldehyde, לאסוף את המוח ולמקם אותו בparaformaldehyde לילה ב 4 ° C, אז טרנסFER המוח לתמיסת סוכרוז (20% PBS) ל24 שעות נוספות.
  6. לחתוך פרוסות מוח העטרה ב30 עובי מיקרומטר עם cryostat. לאסוף פרוסות OB ומחשב ולעלות על גבי שקופיות ג'לטין מצופה, ואחריו מכתים אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי לנוגדן pCREB 21,25,30.

.7 בדיקת ההפיכות של יחיד Naris ספיגה

בדיקות ניסוי זה אם השפעת החסימה היא הפיכה ב24 שעות לאחר הסרת תקע האף.

  1. לבצע חסימות Naris חד צדדיות על PD 6 או 7 גורים כפי שתואר בסעיף 2.
  2. לאחר 15 דקות (שווה ערך ל משך הזמן של חסימת Naris במהלך אימון - 5 התרגלות + הכשרת דקות דקות 10), להסיר את תקע האף, ולהחזיר את הגור לסכר.
  3. 24 שעות מאוחר יותר, לחשוף את הגור לריח המנטה במכל פלסטיק מכוסה עבור 10 דקות כפי שתואר ב6.2.
  4. בצע אותם שלבים בכתיוני 6.3-6.6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן אנו סוקרים כמה מהתוצאות שהוקמו בעבר 24 כדי להדגים את היעילות של חסימת Naris בבידוד קלט ריח ולמידה לחצי כדור אחד, וההפיכות של שיטה זו.

חסימת Naris אחת במהלך אימון העדפת ריח מוקדם מובילה לזיכרון ריח lateralized 24. הזיכרון מוגבל לNaris חסך (איור 3). כאשר גורים נבדקים להעדפת ריח עם אותו Naris האפיל כבמהלך אימון, הם מראים העדפה לריח המותנה (למשל, מנטה). כאשר גורים נבדקים עם Naris ההפך האפיל, הם לא מראים העדפה לריח המותנה. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שזכרון העדפת ריח הוא רק נוצר ובא לידי ביטוי בNaris חסך שעבר הריח + מלטף את האוויר אסוציאטיבי.

איור 3 .3 חסימת Naris יחידה איור גורמת למידה ריח lateralized. פרוטוקול ההתנהגות מוצג בפנל העליון. ריח + מלטף (O / S +) או ריח בלבד (O / S -) חיות עם Naris היחיד האפיל במהלך אימון, עבר בדיקת העדפת הריח ראשונה עם אותו Naris occluded אז עם Naris ההפך האפיל. הפנל התחתון מציג את אחוז הזמן שבילה על מצעים בניחוח מנטה בקרב קבוצות שונות במבחן ריח שתי בחירה. * P <0.05. ברים שגיאה, ממוצע ± SEM. לשכפל מפונטיין et al. J. מדעי המוח (2013) באישור.

תוצאות lateralized אימון ריח בהפעלת lateralized של מערכת חוש הריח בזמן חשיפת ריח (איור 4) 24. חסימת Naris יחידה מונעת הפעלה של OB והמחשב של duri חצי כדור ipsilateralng חשיפת ריח. זו באה לידי ביטוי על ידי ניטור זירחון CREB בOB, והמחשב. כפי שניתן לראות באיור 4, באמצעות אימונוהיסטוכימיה, CREB פוספורילציה (pCREB) הוא באופן משמעותי פחות בחצי הכדור החסומים בעקבות חשיפת ריח מנטה, בהשוואה לחצי הכדור חסכו הנגדי. מכתים Nissl (איור 4 א) מדגים גופי תא דומים בשכבת תאי צניפי של OB, ובשכבת תאי הפירמידה של המחשב של שני חצאים הכדור. עם זאת, pCREB הוא באופן משמעותי פחות בשני שכבות התאים בipsilateral חצי הכדור לNaris החסום (איור 4).

איור 4
איור 4 תוצאות חסימת Naris יחידה בהפעלת lateralized של מערכת חוש הריח בזמן חשיפת ריח. ) מכתים Nissl של הנורה חוש הריח(OB) וקליפת מוח קדמי אגסי (APC). B) ביטויי PCREB באונות החסומות וחסכו בעקבות חשיפת מנטה בגור occluded Naris היחיד. חצים מצביעים על שכבת תאי צניפי בשכבת תאי OB והפירמידה בAPC. סולם ברים, 500 מיקרומטר. לשכפל מפונטיין et al. J. Neuroscience (2013) באישור.

ההשפעה של חסימת Naris משפט אחד (15-20 דקות) היא זמנית והפיכה, ולא לגרום לנזק נראה לעין לטווח ארוך עצבי שעלולות להוביל לתפיסה שינו ריח והפעלה עצבית מופחתת לריחות במהלך בדיקת 24. כאינדקס של הכתמת pCREB בOB והמחשב (איור 5), ביטויי pCREB בתאי צניפי של OB, ותאים פירמידליים במחשב לריח חשיפה ניתן להשוואה בין ההמיספרות החסומות וחסכו, 24 שעות לאחר הסרת תקע האף - אותה נקודת הזמן שלהריח בדיקת העדפהמתבצע לאחר אימון העדפת ריח מוקדם.

איור 5
איור 5 הערכה של תגובתיות עצבית הבאים חסימת Naris הפיכה. מכתים PCREB של OB וAPC, 24 שעות לאחר הסרת תקע האף בגור אחד. חצים מצביעים על שכבת תאי צניפי בשכבת תאי OB והפירמידה בAPC. MCL, שכבת תאי צניפי. PCL, שכבת תאים פירמידליים. סולם ברים, 500 מיקרומטר להגדלה נמוכה ולהגדלה גבוהה יותר 100 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל למידת ריח וזיכרון lateralized בגורי חולדה בתוך חלון זמן קריטי הוקם לראשונה על ידי הול ועמיתים. בסדרה של מחקרים 33,34,36, הם הראו כי זיכרון העדפת ריח יכול להיות lateralized על ידי זוגות ריח + חלב לNaris אחד בPD 6 בגורי חולדה. זיכרון העדפה היה חזק כאשר אותו Naris היה פתוח במהלך אימון ובדיקה, אבל לא נצפה כאשר Naris החסום היה חסום ונבדק. עם זאת, בפ"ד 12, כאשר קשרי commissural קדמי מקליפת המוח הקדמית חוש הריח הפכו 32 פונקציונליים, Naris מאומן לבדו יכול לתמוך בביטוי של העדפת הריח שנרכשה בפ"ד .6 נגע של השליך הקדמי שוחזר זיכרון lateralized כך שזה כבר לא היה נגיש מNaris מאומן 33. מודל למידת lateralized זה שוחזר בהצלחה עם ריח + מלטף 24,25,31 הפרדיגמה. + ריח מלטף את אימונים עם OCC Naris הבודדlusion על PD 6 מוביל לזיכרון lateralized על PD 7 ביום 31 ב. חסימות Naris אחת חוזרות ונשנות בפ"ד 3-6 מובילה לזיכרון lateralized יותר שנמשך לפחות 48 שעות 24.

תוצאות פרוטוקול למידת ריח lateralized ב" מוח מפוצל "בבעלי חיים בודדים. מודל זה יש יתרונות גדולים ללימוד התנהגות והשינויים ביו הפיזיולוגי עיגון. לדוגמא, השוואת תפוקות התנהגות תוך שימוש במודל נושא בתוך-מספיק מפחית וריאציות בעיצובים בין בעלי החיים. גורים בגיל צעיר זה להשתנות במידה ניכרת בפעילות ובהיענות שלהם. שליטת Intra-חיה מסירה את השוני הפנימי של פרט בביצועים ואת ההיענות, כמו גם הבדלים מהותיים בביולוגיה מההערכה של שינויים מולקולריים ופיסיולוגיים. בנוסף, מודל התינוק הזה החזק של למידת lateralized מעניק לנו הזדמנות להתייחס ביצועי זיכרון אישיים לפיזיולוגית פרט, ועל מנת להעריך היסודות דואר של זכרונות של משכי זמן שונים 24,25,31. השימוש במודל למידה lateralized זה בשילוב עם ניסויי vivo לשעבר משווים את הפיסיולוגיה של שתי ההמיספרות באותה חיות, זה כבר הוכיח לאחרונה כי למידת ריח מוקדמת גורמת לפלסטיות הסינפטית כגון תגובות קולטן AMPA גדלו בסינפסות בשני OB 31 ב, ו APC 24,25. שידור סינפטי משופר הבא למידת ריח המוקדמת מתורגם לתפוקה משופרת ברשת חוש הריח ייצוגי 24.

מחקרים עתידיים צריכים לבחון את היסודות המולקולריים של זיכרון ריח באמצעות מודל למידת lateralized זה. זה כולל מחקרים התאמה מסתכלים על חלבונים וגנים מופעלים הלמידה הבאה, ומחקרים סיבתי מסתכלים על ההשפעות של עלייה של פונקציה ואובדן של פונקציה של חלבונים והגנים של עניין מיוחד. אפשרות אחרת, מרגשת וחשובה היא להיות לא מסוגליםo מתייחס לשינויים פיסיולוגיים ומולקולריים לכוחו של הזיכרון התנהגותיות. לכל גור, זה אפשרי ראשון נובע מידת זיכרון העדפת nares הפתוח והחסום. הניסויים הבאים vivo לשעבר בקליפת המוח המאומן ולא מאומן המתאים יספק שינויים פיסיולוגיים גומלים. זה אפשרי, עם זאת, כי ריח מחדש החשיפה במהלך העדפת הבדיקה עצמה לשנות את הכוח הסינפטי, או שאזורים האחרים במוח לתרום באופן משמעותי לביטוי זיכרון. במחקרים הנוכחיים שלנו, פיזיולוגיה והתנהגות מתבצעות על קבוצות נפרדות. זה מסיר חששות לגבי בדיקות התנהגותיות המשפיעים על הפרמטרים מאוד של עניין.

אזהרה אחת באמצעות תקע האף היא נזק לרקמות עצביות פוטנציאליות המשויך להחדרת תקע וההסרה. מסיבה זו, טיפול צריך נלקח בהחדרת תקע האף וגורים עם הדימום במהלך החדרה צריך להיות שלילי, כדי למנוע כל EF טווח ארוך פוטנציאלfects הקשורים לדימום כגון דלקת. חסימה ממושכת (שעות, ימים עד חודשים) של Naris או אבלציה הקבועה של אפיתל הריח מוביל לקיפוח ארוך טווח חוש הריח, נזק עצבי, ופעילויות עצביות מופחתות בOB ומחשב 37-41, למרות שחלק מתופעות אלה בשל ממושכות חסימת Naris היא הפיכה 39,40 באופן מלא. שלמות רקמות הבאות חסימת Naris חריפה (~ 15 דקות) אומתה על ידי צביעת אימונוהיסטוכימיה של pCREB, סמן עצבי פעילות תלויה, אשר הוכח להיות מופחת במחשב של עכברים בוגרים הצעירים הבא חסימת Naris 5 ימים 39. רמות pCREB בOB ומחשב ipsilateral של Naris האפיל היו באופן משמעותי פחות בחשיפת ריח מנטה, המאשרים את lateralization המוצלח של תפוקת חוש הריח בגורי חולדה במהלך חסימת Naris. עם זאת, 24 שעות לאחר הסרת תקע האף, בעת בדיקת העדפת ריח, רמות pCREB ניתנים להשוואה אניn שני חצאים הכדור, דבר המצביע על ההשפעה של חסימה חריפה הוא הפיך 24 באופן מלא. לכן, חוסר ההעדפה למנטה נבדקה עם Naris האפיל בעבר בשל חוסר הזיכרון, אך לא בשל שינוי או חוסר תפיסת ריח הקשורים לניזק לרקמות במהלך בדיקה. בנוסף, קלטות אלקטרו השליטה O / S - (עם Naris אחד האפיל במהלך חשיפת ריח בלי ללטף) הראו בעלי חיים לא נמצאה הבדלים בfEPSPs או מספר התאים פירמידליים מופעלים ראו עם הדמיה סידן - גם מאשר אין שינוי תפקודי בקליפת אגסי בשל חסימות אלה לטווח קצר הפיכים Naris 24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polythylene 20 tubing Intramedic 427406 Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread Syneture Sofsilk Non-absorbent
Silicone grease Warner Instrument 64-0378 Odorless
2% Xylocaine gel AstraZeneca Prod. No 061 Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush Dynasty 206R Similar size/other brands work too
Peppermint extract Sigma-Aldrich W284807 Other brands should be okay too
Training box Custom-made N/A Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber Custom-made N/A Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody Cell Signaling 9198 Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate Sigma-Aldrich C8383 N/A
Paraformaldehype Sigma-Aldrich P6148 N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S9378 N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregory, E. H., Pfaff, D. W. Development of olfactory-guided behavior in infant rats. Physiol Behav. 6, 573-576 (1971).
  2. Alberts, J. R., May, B. Nonnutritive, thermotactile induction of filial huddling in rat pups. Dev Psychobiol. 17, 161-181 (1984).
  3. Galef, B. G., Kaner, H. C. Establishment and maintenance of preference for natural and artificial olfactory stimuli in juvenile rats. J Comp Physiol Psychol. 94, 588-595 (1980).
  4. Johanson, I. B., Hall, W. G. Appetitive learning in 1-day-old rat pups. Science. 205, 419-421 (1979).
  5. Johanson, I. B., Hall, W. G. Appetitive conditioning in neonatal rats: conditioned orientation to a novel odor. Dev Psychobiol. 15, 379-397 (1982).
  6. Johanson, I. B., Teicher, M. H. Classical conditioning of an odor preference in 3-day-old rats. Behav Neural Biol. 29, 132-136 (1980).
  7. McLean, J. H., Darby-King, A., Sullivan, R. M., King, S. R. Serotonergic influence on olfactory learning in the neonate rat. Behav Neural Biol. 60, 152-162 (1993).
  8. Moore, C. L., Power, K. L. Variation in maternal care and individual differences in play, exploration, and grooming of juvenile Norway rat offspring. Dev Psychobiol. 25, 165-182 (1992).
  9. Pedersen, P. E., Williams, C. L., Blass, E. M. Activation and odor conditioning of suckling behavior in 3-day-old albino rats. J Exp Psychol Anim Behav Process. 8, 329-341 (1982).
  10. Sullivan, R. M., Hall, W. G. Reinforcers in infancy: classical conditioning using stroking or intra-oral infusions of milk as UCS. Dev Psychobiol. 21, 215-223 (1988).
  11. Sullivan, R. M., Leon, M. Early olfactory learning induces an enhanced olfactory bulb response in young rats. Brain Res. 392, 278-282 (1986).
  12. Weldon, D. A., Travis, M. L., Kennedy, D. A. Posttraining D1 receptor blockade impairs odor conditioning in neonatal rats. Behav Neurosci. 105, 450-458 (1991).
  13. Sullivan, R. M., Hofer, M. A., Brake, S. C. Olfactory-guided orientation in neonatal rats is enhanced by a conditioned change in behavioral state. Dev Psychobiol. 19, 615-623 (1986).
  14. Camp, L. L., Rudy, J. W. Changes in the categorization of appetitive and aversive events during postnatal development of the rat. Dev Psychobiol. 21, 25-42 (1988).
  15. Moriceau, S., Wilson, D. A., Levine, S., Sullivan, R. M. Dual circuitry for odor-shock conditioning during infancy: corticosterone switches between fear and attraction via amygdala. J Neurosci. 26, 6737-6748 (2006).
  16. Roth, T. L., Sullivan, R. M. Endogenous opioids and their role in odor preference acquisition and consolidation following odor-shock conditioning in infant rats. Dev Psychobiol. 39, 188-198 (2001).
  17. Roth, T. L., Sullivan, R. M. Consolidation and expression of a shock-induced odor preference in rat pups is facilitated by opioids. Physiol Behav. 78, 135-142 (2003).
  18. Sullivan, R. M. Developing a sense of safety: the neurobiology of neonatal attachment. Ann N Y Acad Sci. 1008, 122-131 (2003).
  19. Wilson, D. A., Sullivan, R. M. Olfactory associative conditioning in infant rats with brain stimulation as reward. I. Neurobehavioral consequences. Brain Res Dev Brain Res. 53, 215-221 (1990).
  20. Sullivan, R. M., Wilson, D. A., Leon, M. Associative Processes in Early Olfactory Preference Acquisition: Neural and Behavioral Consequences. Psychobiology. , 29-33 (1989).
  21. McLean, J. H., Harley, C. W., Darby-King, A., Yuan, Q. pCREB in the neonate rat olfactory bulb is selectively and transiently increased by odor preference-conditioned training. Learn Mem. 6, 608-618 (1999).
  22. Sullivan, R. M., Stackenwalt, G., Nasr, F., Lemon, C., Wilson, D. A. Association of an odor with activation of olfactory bulb noradrenergic beta-receptors or locus coeruleus stimulation is sufficient to produce learned approach responses to that odor in neonatal rats. Behav Neurosci. 114, 957-962 (2000).
  23. Yuan, Q., Harley, C. W., McLean, J. H. Mitral cell beta1 and 5-HT2A receptor colocalization and cAMP coregulation: a new model of norepinephrine-induced learning in the olfactory bulb. Learn Mem. 10, 5-15 (2003).
  24. Fontaine, C. J., Harley, C. W., Yuan, Q. Lateralized odor preference training in rat pups reveals an enhanced network response in anterior piriform cortex to olfactory input that parallels extended memory. J Neurosci. 33, 15126-15131 (2013).
  25. Morrison, G. L., Fontaine, C. J., Harley, C. W., Yuan, Q. A role for the anterior piriform cortex in early odor preference learning: evidence for multiple olfactory learning structures in the rat pup. J Neurophysiol. 110, 141-152 (2013).
  26. Nakamura, S., Kimura, F., Sakaguchi, T. Postnatal development of electrical activity in the locus ceruleus. J Neurophysiol. 58, 510-524 (1987).
  27. Harley, C. W., Darby-King, A., McCann, J., McLean, J. H. Beta1-adrenoceptor or alpha1-adrenoceptor activation initiates early odor preference learning in rat pups: support for the mitral cell/cAMP model of odor preference learning. Learn Mem. 13, 8-13 (2006).
  28. Shakhawat, A. M., Harley, C. W., Yuan, Q. Olfactory bulb alpha2-adrenoceptor activation promotes rat pup odor-preference learning via a cAMP-independent mechanism. Learn Mem. 19, 499-502 (2012).
  29. Isaacson, J. S. Odor representations in mammalian cortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 20, 328-331 (2010).
  30. Lethbridge, R., Hou, Q., Harley, C. W., Yuan, Q. Olfactory bulb glomerular NMDA receptors mediate olfactory nerve potentiation and odor preference learning in the neonate rat. PLoS One. 7, e35024 (2012).
  31. Yuan, Q., Harley, C. W. What a nostril knows: olfactory nerve-evoked AMPA responses increase while NMDA responses decrease at 24-h post-training for lateralized odor preference memory in neonate rat. Learn Mem. 19, 50-53 (2012).
  32. Schwob, J. E., Price, J. L. The development of axonal connections in the central olfactory system of rats. J Comp Neurol. 223, 177-202 (1984).
  33. Kucharski, D., Hall, W. G. New routes to early memories. Science. 238, 786-788 (1987).
  34. Kucharski, D., Johanson, I. B., Hall, W. G. Unilateral olfactory conditioning in 6-day-old rat pups. Behav Neural Biol. 46, 472-490 (1986).
  35. Cummings, D. M., Henning, H. E., Brunjes, P. C. Olfactory bulb recovery after early sensory deprivation. J Neurosci. 17, 7433-7440 (1997).
  36. Kucharski, D., Hall, W. G. Developmental change in the access to olfactory memories. Behav Neurosci. 102, 340-348 (1988).
  37. Brunjes, P. C. Unilateral odor deprivation: time course of changes in laminar volume. Brain Res Bull. 14, 233-237 (1985).
  38. Kass, M. D., Pottackal, J., Turkel, D. J., McGann, J. P. Changes in the neural representation of odorants after olfactory deprivation in the adult mouse olfactory bulb. Chem Senses. 38, 77-89 (2013).
  39. Kim, H. H., Puche, A. C., Margolis, F. L. Odorant deprivation reversibly modulates transsynaptic changes in the NR2B-mediated CREB pathway in mouse piriform cortex. J Neurosci. 26, 9548-9559 (2006).
  40. Korol, D. L., Brunjes, P. C. Rapid changes in 2-deoxyglucose uptake and amino acid incorporation following unilateral odor deprivation: a laminar analysis. Brain Res Dev Brain Res. 52, 75-84 (1990).
  41. Leung, C. H., Wilson, D. A. Trans-neuronal regulation of cortical apoptosis in the adult rat olfactory system. Brain Res. 984, 182-188 (2003).

Tags

Neuroscience גיליון 90 למידת lateralized ריח חולדות זיכרון תקע האף הנורה חוש הריח קליפת אגסי CREB פוספורילציה
מודל הלמידה Lateralized ריח חולדות ילודים לביתור גיבוש עצבי מעגל בבסיס זיכרון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fontaine, C. J., Mukherjee, B.,… More

Fontaine, C. J., Mukherjee, B., Morrison, G. L., Yuan, Q. A Lateralized Odor Learning Model in Neonatal Rats for Dissecting Neural Circuitry Underpinning Memory Formation. J. Vis. Exp. (90), e51808, doi:10.3791/51808 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter