Summary
Detta protokoll beskriver användningen av mikroskala kisel utliggare som böjliga odlingsytor för mätning av kontraktiliteten hos muskelceller in vitro. Cellular kontraktion orsakar fribärande böjning, som kan mätas, registreras och omvandlas till avläsning av kraft, som ger en icke-invasiv och skalbart system för att mäta kontraktila funktion in vitro.
Abstract
Utvecklingen av mer förutsägbara och biologiskt relevanta in vitro-analyser baseras på att en positiv utveckling av mångsidiga cellodlingssystem som underlättar funktionell bedömning av de sådda cellerna. Därför erbjuder mikro fribärande teknik en plattform som man kan mäta kontraktila funktionaliteten hos en rad olika celltyper, bland annat skelett, hjärt och glatta muskelceller, genom bedömning av kontraktion inducerad substrat böjning. Tillämpning av multiplexerade fribärande matriser ger möjlighet att utveckla måttlig till hög kapacitet protokoll för bedömning läkemedlets effektivitet och toxicitet, sjukdomsfenotyp och progression, samt neuromuskulära och andra cell-cell interaktioner. Denna handskrift ger detaljerna för att tillverka tillförlitliga fribärande arrayer för detta ändamål, och de metoder som krävs för att framgångsrikt odla celler på dessa ytor. Ytterligare beskrivning ges om de åtgärder som behövs för att utföra funktionella anallys av typer kontraktila celler bibehålls på sådana matriser med hjälp av en ny laser och fotodetektor systemet. De representativa uppgifter belyser precision och reproducerbar karaktär analysen av kontraktila funktion möjlig med detta system, liksom de många studier som sådan teknik kan användas. Framgångsrik utbrett införande av detta system kan ge utredarna med medel för att utföra snabba, lågprisflyg funktionella studier in vitro, vilket leder till mer korrekta prognoser av vävnadsprestanda, sjukdomsutveckling och reaktion på ny terapeutisk behandling.
Protocol
1. Cantilever Chip Fabrication
Illustrerade detaljerna i de beskrivna tillverkningsstegen tillhandahålls i figur 1.
- Placera kisel på isolator (SOI) wafers i en ugn och grädda i 125 ° C i 20 minuter för att torka dem.
- Sätt in ett 1,5 pm tjockt skikt av kiseloxid på handtaget lagret av uttorkad SOI rånet med hjälp av en Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) verktyg.
- Placera brickan på spinnbeläggare chucken med anordningen skiktet uppåt. Säkerstäl är centrerad, dispensera 2 ml P20-primer på mitten av skivan, och centrifugering vid 3000 rpm under 60 sek vid en acceleration på 1000 varv per minut / sekund. P20 primer främjar vidhäftning av fotoresist till enheten skiktet.
- Medan skivan är fortfarande på spinnbeläggare chuck, dosera 2 ml S1818 fotoresist på mitten av skivan, och snurra vid 3000 rpm i 60 sek vid en acceleration på 1000 rpm / sek till obtain ett 1,5 pm tjockt skikt av fotoresist.
- Placera brickan på en varm platta och utför en mjuk grädda vid 115 ° C under 1 min.
- Utför en hård kontakt UV-exponering med hjälp av en fotolitografi kontakt mask Aligner för att överföra mönstret från fribärande masken fotoresisten på enheten skiktet. Beräkna exponeringstid utifrån exponeringsenergivärde på 125 mJ / cm 2 för S1818 fotoresist.
- Develop fotoresisten genom nedsänkning av oblat i en 726 MIF fotoresist utvecklare för en minut under försiktig skakning wafern och tillbaka.
- Skölj skivan med avjoniserat (DI) vatten och torka den, helst med hjälp av en spinn sköljtork (SRD) verktyg.
- Ta bort fotoresist från kanten av skivan (upp till 5 mm från kanten) med en bomullspinne doppad i aceton.
- Ladda skivan i en djup Reactive Ion Etch (DRIE) verktyg, med fotoresist sidan uppåt, och kör ett recept för att etsa det mönstrade kiselskikt genom device skiktet. De begravda fungerar oxidskikt som ett etsningsstopp, så utföra en etsning med 50% till 100% fler cyklar än vad som förväntas vara nödvändiga för att säkerställa en fullständig etsning.
- Placera brickan på en het fotoresist badlösning för 20 min för att riva av fotoresist. Överför skivan till en snabb-dump-rinser (QDR) att skölja rånet med DI-vatten. Efter fotoresist remsan, laddar skivan i en SRD verktyg för att skölja och torka skivan. Inspektera wafern under ett mikroskop för att säkerställa den fribärande mönstret visas som förväntat.
- Sätt in en 1 mm tjockt lager av un-dopade kiseloxid på enheten skiktet av skivan med hjälp av en PECVD verktyg. Funktioner Denna oxidskikt som ett skyddande lager för utliggare under ytterligare bearbetningssteg.
- Placera brickan på spinnbeläggare chucken med handtaget skiktet vänd uppåt för att börja bearbetningen av baksidan av skivan. Säkerstäl är centrerad, dispensera 2 ml P20-primer på mitten av skivan, och centrifugering vid 3000 varv per minutför 60 sekunder vid en acceleration på 1000 rpm / sek.
- Medan skivan är fortfarande på spinnbeläggare chuck, dosera 2 ml SPR220-4.5 fotoresist på mitten av skivan, och snurra vid 2000 rpm i 45 sek vid en acceleration på 1000 rpm / s för att få en 6,5 um tjockt lager av fotoresist.
- Placera brickan på en närhet värmeplatta för att göra en mjuk grädda vid 115 ° C under 2 min.
- Med hjälp av en fotolitografi kontakt Aligner kan fram / back inriktning, rikta baksidan fönstret masken på framsidan utskjutande mönster och utför en hård kontakt UV-exponering i syfte att överföra mönstret från baksidan fönstret masken fotoresisten på handtaget skiktet. Använd en exponeringstid beräknas utifrån exponeringsenergivärde på 480 mJ / cm 2 för SPR220-4.5 fotoresist.
- Efter UV-exponering, låt skivorna förbli i ett mörkt område för 30 min innan nästa behandlingssteg.
- Develop fotoresisten genom nedsänkning av wafern ien 726 MIF fotoresist utvecklare för 2 min under försiktig skakning wafern och tillbaka.
- Skölj skivan med avjoniserat (DI) vatten och torka den, helst med hjälp av en spinn sköljtork (SRD) verktyg.
- Placera skivorna i en ugn vid 90 ° C under 12 tim.
- Etsa kiseloxidskikt på baksidan av skivan med användning av en RIE-system med fluorerade gaser och ett recept för etsning av oxiden. Den mönstrade oxid på baksidan av skivan verkar som en etsningsmask för ytterligare bearbetning. Inspektera wafers i mikroskop för att se till att kiseloxid i utsatta fönstret är helt etsat.
- Ta bort fotoresist på kanten av skivan (upp till 5 mm från kanten) med ett rent rum tops doppad i aceton.
- Ladda skivan i en DRIE verktyg med och köra ett recept för att etsa det mönstrade handtaget lagret till ett djup av 500 nm med det begravda oxidskiktet fungerar som en etsningsstopp. Dela den här etsning i flera körningar för att undvika alltför kraftig uppvärmning avoblat, som orsakar inkonsekvent etsning av kisel. Detta etsningssteg helt avlägsnar kisel nedanför utliggare.
- Utför en våt etsningssteg med hjälp av 25% utspädd HF etsningsmedel, för att plundra de begravda oxidskiktet under utliggare och skyddande oxidskikt ovanpå utliggare.
OBS: Detta steg släpper bottenyta kisel utliggare och även öppnar ett fönster under för att ge en tillgång till sondera fribärande med lasern. - Skölj skivan med hjälp av en serie DI vattenbad och försiktigt torka med kväve. Eftersom utliggare stöds endast vid sina baser, inte använder kraftfulla sprayer av DI vatten eller inert gas direkt på utliggare.
- Cleave de enskilda marker från skivan längs klyver linjer som producerats under handtaget skiktet etsningssteg.
2. Cellodling
- Förbered 13F täck enligt tidigare publicerade metoder 17.
OBS: Om 13F vikrslips inte är tillgängliga, kan användas någon hydrofob yta med en kontaktvinkel över 95 °. - Sterilisera fribärande chips och 13F täckglas i en 70% etanollösning och låt lufttorka i ett flöde huva.
- Placera enskilda fribärande chips ovanpå 13F täck i en standard 12 brunnar.
- Täck utliggare med biopolymeren eller ytmodifiering optimerad för den celltyp som används i enlighet med de standardcellodlingsprotokoll.
- Återsuspendera cellerna i deras specifika tillväxtmedium till den önskade koncentrationen.
OBS: Detta protokoll kommer att resultera i ett stort antal celler som faller genom konsolfönstret och inte ansluter sig till den önskade fribärande ytan. Cell preparat bör därför 3-4x mer koncentrerade än för standardtäckpreparat. Till exempel är sådd av råttskelettmuskelsatellitceller typiskt utförs med användning av en såddtäthet av 500-700 celler / kvadrat mm 15,16, Och används med fribärande substrat vid 2000 celler / kvadrat mm. Optimerings experiment bör utföras med nya cellkällor för att fastställa en lämplig såddtäthet. - Pipettera 200 | il av cellsuspensionen på fribärande spånyta, säkerställer bubblan av mediet omfattar fribärande fönstren helt. Om mediet vekar genom fönstret och inte bildar en statisk bubbla ovanpå utliggare ersätta 13F täckglas och reattempt pläteringen.
- Överför plattan innehållande flisen till en inkubator och tillåta cellerna att vidhäfta under minst en timme (företrädesvis 2-3 h).
- Efter denna plätering period, använd steril pincett för att överföra chipset till en ren väl, utan 13F täck, och fyll på kultur med 1 ml odlingsmedium.
- Återför plattan till inkubatorn.
- Behåll celler enligt deras standardprotokoll för in vitro-underhåll på täckglas. För skelettmuskelceller,ett byte av medel sammansättning för att inducera myotube bildning när celler blir sammanflytande kommer att bli nödvändigt.
3 Inställning av maskinvara och programvara för Cantilever Nedböjning Analys
- Placera en uppvärmd odlingsskål i det skede av en upprätt elektromikroskop.
- Lägg 3 ml av matningsmediet cellerna närvarande suspenderades i (+ 10 mM HEPES) till den uppvärmda mikroskop scenen.
- Montera rostfria elektroder på insidan av den uppvärmda odlingsskålen på ett avstånd på 15 mm och ansluta dem till en pulsgenerator, som kan producera fältstimuleringspulser med varierande intensitet, frekvens och vågform, så att systemet för att producera fältstimulering av celler vid behov.
- Bolt en helium-neonlaser, monterad på XY translationssteg, till undersidan av mikroskopbordet och justera den så att laserstrålen riktas genom basen av den uppvärmda odlingsskål vid en 30 ° vinkel relative till planet av konsolen.
- Bolt en kvadrant fotodetektormodul, monterad på XY translation stadier, på undersidan av mikroskop scenen och justera positionen så att de reflekterade laserstrålen landar i mitten av de fyra kvadranter. Figur 2 ger en översikt över hårdvaran inrättas behövs för att genomföra det beskrivna protokollet.
- Skriv ett program för att styra de linjära ställdon som skannar över utliggare. Skriv mjukvaruprogrammet med hänvisning till flödesschemat som tillhandahålls i figur 3. Det grafiska gränssnittet programmeras för användning med detta system tillhandahålls i figur 4.
4. Inspelningen Cantilever Avböjning Data
- Slå på fribärande analys hårdvara och tillhörande mjukvara.
- Sätt den uppvärmda scenen termistorn i mediet och vänta på att läsa 37 ° C.
- Sätt i fribärande chip in på scenen med cantilevers orienterade mot den högra sidan av scenen.
- Slå på mikroskop ljuskälla.
- Fokusera mikroskop för att få kanterna på utliggare i sikte och använda laser / fotodetektor styrprogram för att placera laserstråle på spetsen av konsolen 1 OBS: Om man antar att konsolerna är orienterade till höger om scenen, konsol 1 är den placerad längst upp till vänster i matrisen och siffror springa ner till 16 i det nedre vänstra. Cantilever 17 är i det övre högra position och går till 32 i det nedre högra (Figur 5A).
- Tryck på "play" på inspelningsprogram.
- Placera fotodetektorn så att signalen läser "0" i både x och y-ramar genom att justera stegmotorerna som styr fotodetektorn.
- Ställ fribärande 1 position i laser / fotodetektor styrprogram (Figur 4).
- Flytta lasern till spetsen av konsolen 16, upprepa steg 4.7., Och ställ cantilever 16 position i laser / fotodetektor styrprogram.
- Flytta lasern till spetsen av konsolen 32, upprepa steg 4.7., Och ställ fribärande 32 position i laser / fotodetektor styrprogram.
- Flytta lasern till spetsen av konsolen 17, upprepa steg 4.7., Och ställ fribärande 17 position i laser / fotodetektor styrprogram.
- Stäng av mikroskopljuskällan och den överliggande ljus i laboratoriet.
- Tryck på "record" på inspelningsprogram.
- Ställ in pulsgenerator hårdvaran till 40 ms, 5 V pulser med en frekvens på 1 Hz, och slå på maskinen.
OBS: Eventuellt anställa optimerade stimuleringsprotokoll för specifika cellkällor på denna punkt, de angivna inställningarna är riktlinjer baserade på insamlade data med humana och gnagare cellkällor 12,13,15,16. - Med hjälp av laser / fotodetektor styrprogram, ställ in hårdvara för att skanna över 32 fribärande array, stannar 5 sekunder vid varje påe.
- När skanningen av de 32 konsoler är klar, stäng av stimulatorn, sedan stoppa inspelningsprogrammet och ta fram datafilen.
- Undersök inspelade spår från varje konsol för tecken på kontraktila aktiviteten. Anteckna varje konsol med positiva reaktioner. En sammandragning definieras som en topp om böjningen är åtminstone 0,1 V ovanför baslinjen.
- Ta bort alla icke-responsiva utliggare från skannprotokoll på lasern / fotodetektor styrprogram.
- De aktiva utliggare kan sedan igenom igen utan stimulering för att få en avläsning av cellens spontan kontraktil aktivitet.
- Kör avsökningar med eller utan ett brett fält elektrisk stimulering, efter tillsats av en terapeutisk förening till mediet för att observera dess effekt på den funktionella utmatningen från de odlade cellerna.
- Genomföra bedömningar av trötthet genom att elektriskt stimulera cellerna under längre perioder och skanningsnivåer kontr actility att mäta hur lång tid det tar för toppkraft för att falla under ett visst tröskelvärde.
- I experiment där motoriska nervceller hålls i samodling med muskler, mät neuromuskulära förbindelsen bildning genom behandling av motoneuron-myotube fribärande samkulturer med neuronal stimulerande (t.ex. glutamat) eller synaptic hämmare (t.ex. D-tubokurarin) och söker efter ökningar och minskningar i spontan aktivitet respektive 16.
- Utför specifika undersökning dikteras av behoven hos de planerade experimenten.
5. Analys av Cantilever Nedböjning Data
- Använd modifierad Stoney ekvationer 15 (se nedan) för att omvandla rå fribärande böjningsdata (i volt) till en avläsning av spänning i cellskiktet eller myotube (i Pascal) och en direkt mätning av cellulära sammandragande kraft (i nano-Newton):
ad / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Ekvation 1
Ekvation 2 - Där δ = fribärande spets nedböjning och stress som produceras av myotube, σ c = spänning som produceras av myotube, antar en jämn tjock film hela bredden av konsolen, C-detektor = systemet specifika koefficienten avseende spänning till laser position på fotot -detector, θ = vinkeln för lasern och detektorn i förhållande till planet av den fribärande, E Si = elasticitetsmodulen för kisel, t Si = tjocklekarna hos den fribärande, t f = myotube tjocklek, v Si = gift s förhållande av kisel, L = fribärande längd, P = väglängd av laser från fribärande tips till detektorn, och w
- Förutsatt att myotube är en jämn film, är kraften i myotube lika med kraften i filmen, vilket leder till ekvation 3, genom att likställa beräkningen av kraften från stress och den antagna celltvärsnittsarea som användes för tillämpningen av Stoney s ekvation.
Ekvation 3 - Efter insamlingen funktionella uppgifter, fixa gren marker för immunocytokemisk analys eller använda celler för protein eller DNA-analys med hjälp av standardtekniker.
- Eventuellt tillbaka cellerna till inkubatorn i stället för att förbereda för molekylär analys för att ompröva funktionella prestanda vid en senare tidspunkt.
Ekvation 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik kultur av kontraktila celler på konsoler är en relativt enkel procedur, som använder standardcellodlingstekniker (Figur 5). Andelen utliggare stödjer upphandlande celler varierar beroende på celltyp som undersöks och särskild odlingsteknik som används. Använda primära embryonala celler som härrör från råtta bakbenen ades kontraktil aktivitet detekterades på 12% av utliggare som undersöktes (n = 4). Analys av kontraktila funktion med hjälp av laser och fotodetektor beskrivna systemet ger exakta realtidsdata avseende den funktionella mognad av de sådda cellerna. Användning av standardelektro programvara kan sedan användas för att analysera rådata, vilket underlättar beräkning av relevanta funktionella egenskaper, såsom toppkraft, tiden till maximal kraft och tid till hälften avkoppling, som illustreras i figur 7. Insamling Efterföljande uppgifter från kulturer behandlade med terapeutiska föreningar möjliggörjämförelse av funktionella egenskaper med och utan drogberoende, vilket möjliggör utvärdering av förening aktivitet och efterföljande förutsäga in vivo svar. Dessutom utökade stimuleringsprotokoll ger möjlighet att bedöma andelen trötthet i odlade celler och på så sätt bredda nivån av fysiologiska data kan erhållas från detta system (Figur 8).
Den fribärande kulturen kan modifieras för att inkludera motoriska nervceller i odlingssystemet med skelettmuskel myotuber 16, för att möjliggöra utvärdering av neuromuskulär synaps bildning in vitro (Figur 9). I sådana kulturer, är andelen spontana sammandragande aktivitet jämfört med andelen sammandragning som svar på behandling med en neuron-specifikt stimulerande, såsom glutamat. Alla observerade glutamat inducerade ökningar av kontraktion priser antyder aktivering av odlade nervceller, vilket leder till acetylkolinfrisättning och efterföljande myoröret aktivering. Behandling med synaptiska hämmare, såsom acetylkolin receptorblockerare D-tubokurarin, vilket leder till upphörande av glutamat-inducerad aktivitet ger ytterligare bevis för närvaron av funktionella neuromuskulära synapser i dessa kulturer 16.
Figur 1 Schematisk detailing fribärande tillverkningsprocessflöde. De nummer som anges i flödesschemat korrelerar till protokoll steg i metodavsnittet titeln "Cantilever chip tillverkning." klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Maskinvaradetaljer i laser / fotodetektor som används för att bedöma cellulära kontraktion på konsoler. (A) Fotografera av den modifierade elektromikroskop används för fribärande bedömning. Lasern (i) och fotodetektor (ii) är monterade under scenen på XY translationsteg. En transparent odlingsskål är monterad på steget (iii), som tillåter laser passage till cantilever array genom undersidan av scenen. (B) Schematisk "top-down" perspektiv av mikroskopbordet. XY translation stadier tillåta förflyttning av lasern och fotodetektorn i både X-och Y-plan (röda pilar), vilket underlättar förflyttning av lasern för att avfråga varje fribärande i en array. Cantilever chips (iii) ska placeras in i scenen med utliggare vända mot höger om scenen för att systemet ska fungera korrekt. (C) Slutet fotograferar upp av lasern (i) ochfotodetektor (ii) monterad under mikroskop scenen. Lasern är placerat vid en 30 ° vinkel i förhållande till planet för den fribärande chip (θ). (D) Slutet fotograferar av odlingsskålen. Bred-området elektrisk stimulering appliceras med hjälp av ett par av silverelektroder placerade 15 mm från varandra (iv). Ett värmeelement (v) som är fäst till undersidan av skålen används för att upprätthålla kulturen vid 37 ° C under analysen. Temperaturreglering är dynamisk, och regleras med hjälp av en termistor placerad i mediet (visas ej). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Flödesschema för logiken bakom programvara för kontroll. scanning av två programvaru laser och fotodetektor loopar kontroll rörelse: en huvudslinga för användarinmatning och en slinga som styr skanningsrörelse. Setup utförs i huvudslingan, följt av aktivering av den andra slingan för medellång till insamling hög genomströmning av data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 Grafiskt användargränssnitt av programvara som används för att styra laser och fotodetektorpositioner under fribärande bedömning. (A) för att manuellt styra laser och fotodetektor positioner i både X-och Y-plan. (B) Kontroller för manuell inställning av positionerna för de fyra hörn utliggare (1, 16, 17 och 32), vilket möjliggör programvaran för attextrapolera positionerna för de återstående utliggare i arrayen. (C) Kontroller så att användarna kan välja vilka konsoler som ska ingå i varje skanning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Bilder av en specialbyggd fribärande chip för användning i detta system, och representativa bilder av celler som upprätthålls på liknande ytor. (A) Fotografi av en enda, specialbyggd fribärande chip. Varje chip innehåller 32 utliggare arrangerade i två rader med 16 Cantilever 1 är placerad i nedre vänstra hörnet av bilden och fribärande 32 i det övre högra hörnet. Cantilever chips är 15 x 15 mm 2. (B) Fas-kontrastbild av primär råttskelettmuskelceller odlas på fribärandear. Varje konsol är 750 nm lång, 100 pm bred och 4 pm tjockt. (C) Immunocytokemisk fläck av en primär rått myotube behållas på en konsol. Celler färgades med användning av en antikroppssond för myosin tung kedja. Notera den tvärstrimmiga utseendet på odlade fibrer, vilket indikerar mognad av kontraktila maskiner. Cantilever kanter är artificiellt lyfts fram i den här bilden för att ge en indikation på skalan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 Schematisk illustrerar de begrepp som används i Stoney ekvationer för härledning kraft som produceras av myotuber på konsoler. Δ = fribärande spets nedböjning och stress som produceras av myotube, Cdetektor = systemspecifika koefficienten avseende spänning till laser position på fotodetektor, θ = vinkeln för lasern och detektorn i förhållande till planet av den fribärande, E Si = elasticitetsmodulen för kisel, t Si = tjocklekarna hos konsolen, t f = myotube tjocklek, v Si = gift kvot kisel, L = fribärande längd och P = våglängd av laser från fribärande tips till detektorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Representativa rådata och analys av kontraktila formulär med hjälp av konsolsystemet beskrivet. (A) Exempel på rådata spår från det breda fält elektrisk stimulering av primära rått myotuber på konsoler. Top spår = laser nedböjning (i volt) i x-axeln, vilket tyder på längden påfrestningar på konsolen. Middle spår = laser nedböjning (i volt) i y-axeln, vilket indikerar vridningsspänning över fribärande. Bottenspår = Uppgift om tids ställning elektriska pulser som används för att framkalla myotube kontraktion i detta system. (B) med vanlig elektro programvara är det möjligt att mäta toppkraft (PF), för att toppeffekt (TTP) och tid till hälften avkoppling (halv RT) från insamlade rådata. (C) Sorterat kontraktion data (n = 11) från primär råttskelettmuskel myotuber. Tillämpning av en modifierad Stoney ekvation kan man beräkna fribärande stress från rådataavläsningar i Volt. Från dessa data kan även genereras direkt beräkning av våld (i Newton). Publicerade data omtryckt wed tillstånd 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Representativa data som visar analys av skelettmuskeltrötthet i fribärande kulturer. Rådata (i volt) till en mätning av myotube kraft (i nano-Newton) och åter ritas. Data visar storleken på myotube sammandragningar på utliggare som svar på 1 Hz brett fält elektriska pulser efter 0 min (svart spår) och 120 min (grå spår) av kontinuerlig stimulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Representativa spår från analysen av en skelettmuskel-motoneuron samodling hållas på utliggare, som visar de funktionella effekterna av motoneuron stimulering med och utan tillsats av en neuromuskulär blockerare. Rå data (i volt) omvandlades till en mätning av myotube kraft (i nano-Newton) och åter ritas. (A) Mätning av spontana sammandragningar av de odlade myotuber utan neuronal stimulering. (B) Mätning av myotube kontraktion efter neuronal stimulering via tillsättning av 200 ^ M glutamat. (C) Mätning av myotube sammandragning efter glutamat och 12,5 | iM D-tubokurarin behandling. Publicerade data återges med tillstånd 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Följande tabeller visar de specifika reagens som används för att odla celler i validerings beskrivna experimenten, samt den utrustning som krävs för att utföra fribärande bedömning. Observera att kultur reagens som används inte är nödvändiga och detta system bör enkelt integreras med kultur protokollen för varje labb upprätthålla kontraktila celler in vitro. De uppräknade reagens tillhandahålls bör utredare vill upprepa de specifika experimentella resultat som beskrivs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska steg i att analysera mikroskala utliggare för tecken på cellulär kontraktion är placeringen av fribärande chip i mikroskop scenen, och den efterföljande inriktning av laser och fotodetektor med spetsen av hörn utliggare i arrayen. Om detta inte görs korrekt, då programmet inte kommer att kunna extrapolera positionerna för de återstående utliggare i arrayen, kan leda till ansamling av falskt negativa under datainsamlingen. Operatörerna bör vara noga med att se till att den fribärande chip ligger i jämnhöjd med botten av kulturen skålen innan kalibrering laser positioner. Om chipet sitter snett i skålen, kommer den att ändra banan för den avböjda laserstrålen och förbrylla datainsamling.
En funktionell air-tabellen måste användas för att neutralisera bakgrundsvibrationer under datainsamlingen. Den lilla tjocklek (ungefär 4 | im) av de konsoler som används i denna studie provides hög känslighet för kontraktil aktivitet, men har den bieffekt av ökad känslighet för vibrationer. Operatörerna bör vara noga med att flytta runt hårdvaran så lite som möjligt när data registreras, för att minska bakgrundsavläsningar. Slutligen när du placerar fribärande chip i steget, se till att dessa chip inte kommer i kontakt med de stimulerande silverelektroder i kulturen också. Tillämpning av bred-fältstimulering med elektroden vidrör chipet kommer att ändra strömbanan och inverkar negativt på systemets förmåga att effektivt stimulera de odlade cellerna.
För att få mer exakta avläsningar av kraften ut i skelettmuskel myotuber, är det starkt rekommenderat att utföra immunfärgning av de odlade cellerna gång funktionell analys är klar. De ekvationer som anges kräva inmatning av ett myotube s tvärsnittsarea (CSA) för att beräkna kraften. Medan ett antaget värde kan användas utifrån previous data, mätning av ett myotube exakta CSA använder konfokala avbildningstekniker kommer att ge en mer exakt uppskattning av den kraft som utövas av den upphandlande myotube. Relatera rå kontraktion uppgifter till de fysiska egenskaperna hos cellen i fråga är värdefulla i normaliserande resultat över flera utliggare och mellan experimentella förhållanden 15, och därmed avgörande för att generera korrekta prognoser av hela vävnads svar på läkemedelsbehandling eller sjukdom. Stoney ekvationer antar de undersökta myotuber spänner över hela längden av konsolen så ansträngningar bör göras att endast data som erhållits från celler som uppfyller detta antagande. Om detta inte är möjligt, kan finita element analys användas för att ge en korrekt mätning av kraft från mindre myotuber som tidigare 15 publicerade. Denna analysmetod är betydligt mer arbetskrävande och därför dåligt anpassade till högre genomströmning applikationer, men kan vara nödvändigt om optimeradcellkulturer som uppfyller Stoney antaganden kan inte erhållas.
Som redan nämnts, kan odlingsparametrar överföras från standardtäckpreparat. Det är dock klokt att överväga att utnyttja serumfria medier kompositioner och icke-biologiska substrat för användning av detta system i drogscreeningsprogram. På grund av den odefinierade naturen av djursera, kan effekten av nya läkemedel förväxlas genom inneslutning av sådana tillsatser i odlingsmediet. Serumfria medier formuleringar finns för både gnagare och mänskliga skelettmuskelkulturer 18-21 och ge en mer kontrollerad, väldefinierad miljö för att utföra förening bedömning. Likaså användningen av biologiska beläggningar (kollagen, laminin, etc.) på utliggare introducerar variabilitet till cell preparat som undviks genom tillämpning av icke-biologiska substrat. Avsättningen av silansjälv monterade monolager på odlingsytor har visat extensively att stödja vidhäftning och utveckling av multipla celltyper 16,18,20,22-31, och utgör de medel för att generera fullt definierade ytor i ett pålitligt och repeterbart sätt.
På grund av området av kontraktila celler närvarande i däggdjurssystem, är tillämpningen av denna modell för in vitro-analyser relativt bred. Även optimerad användning av skelettmuskelceller är systemet potentiellt tillämpligt på glatta muskelceller och hjärtmuskelceller också, som ger möjlighet att utföra snabb bedömning av dos svar på nya läkemedel i dessa celler i realtid. Aktuella fribärande marker består av en matris av 32 utliggare (figur 5A), men kan enkelt ändras för att inkludera många fler. Analys av sådana arrayer producerar ett betydande antal datapunkter från en enda kultur, vilket avsevärt ökar den statistiska kraften av eventuella observerade skillnader. Som framgår i figur 8, celler odladei detta system undergå utmattning över tiden, som svar på kontinuerlig bred-fältstimulering, vilket möjliggör utvärdering av läkemedelseffekter på de hållbarhetsnivåer celler in vitro. Tillsats av innerverar motoriska neuroner i denna kultur modell tillåter också utvärdering av synaps bildning genom mätning av muskel sammandragning som svar på neuronala stimulantia (Figur 9). Även mätning av baslinjen funktionella parametrar i en multiplex analys (Figur 7) har uppenbara fördelar jämfört med standard biomolekylär bedömning av in vitro kulturer, ökar förmågan att bedöma neuromuskulär funktion och uthållighet kapacitet sådda celler kraftigt tillämplighet av denna modell för drogscreening och sjukdomsmodelleringsprogram. Den beskrivna tekniken ger utredarna ett medel för att utföra snabba, billiga funktionell bedömning av både friska och sjuka muskelceller in vitro. Mångsidigheten hos odlingssystemet, och hög grad av funktionell detalj som kan erhållas från analys av rådata, borde producera mer korrekta prognoser för in vivo svar vävnad till nya patologiska och kemiska utmaningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av National Institute of Health bidragsnummer R01NS050452 och R01EB009429. Tillverkning av fribärande marker utfördes externt av samarbetspartners vid Nanoteknik Facility ligger vid Cornell University. All utrustning som används i den fribärande tillverkningsprocessen var belägen i denna anläggning. Särskilt tack till Mandy Esch och Jean-Matthieu Prot för deras hjälp med fribärande mikrotillverkning. Video animering av fribärande funktionalitet genererades av Charles Hughes, Alex Zelenin och Eric Imperiale från Synthetic Reality Lab vid UCF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
- Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
- Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
- Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
- Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
- Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
- Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
- Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
- Edman, K. A.
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
- Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
- Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
- Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
- Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
- Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
- Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
- Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
- Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
- Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
- Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
- Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
- Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
- Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
- Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
- Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
- Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).
