Abstract
स्तनधारियों में और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में शुक्राणुजनन के दौरान पुरुष रोगाणु कोशिकाओं आवश्यक विकासात्मक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला में विकसित करना. यह एक स्टेम सेल आबादी, mitotic प्रवर्धन, और अर्धसूत्रीविभाजन से भेदभाव शामिल हैं. इसके अलावा, के बाद meiotic रोगाणु कोशिकाओं को एक नाटकीय रूपात्मक देगी प्रक्रिया के साथ ही रोगाणु लाइन क्रोमेटिन-हिस्टोन करने वाली protamine स्विच की एक वैश्विक epigenetic पुनर्विन्यासन गुजरना.
उत्परिवर्तजनन या अन्य आनुवंशिक उपकरण का उपयोग कर के बाद meiotic शुक्राणुजनन में एक प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन अक्सर आवश्यक भ्रूण, पूर्व meiotic, या जांच के तहत प्रोटीन की meiotic कार्यों से बाधित है. इस तरह के एक प्रोटीन की एक उत्परिवर्ती के बाद meiotic फेनोटाइप पहले के एक विकास खंड के माध्यम से छिप जा सकता है, या phenotype की व्याख्या जटिल हो सकता है. मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर एक इस समस्या को बाईपास प्रदान करता है: बरकरार वृषण औरजल्दी pupae से विच्छेदित जर्म कोशिकाओं का भी अल्सर संस्कृति माध्यम में पूर्व vivo विकसित करने में सक्षम हैं. ऐसी संस्कृतियों बनाने के लिए वृषण में और रोगाणु लाइन अल्सर के रोगाणु जीवित कोशिकाओं के सूक्ष्म इमेजिंग की अनुमति देता है. महत्वपूर्ण बात है, खेती की वृषण और रोगाणु कोशिकाओं को भी इस तरह के बाद meiotic चरणों सहित, शुक्राणुजनन दौरान एंजाइमी कार्यों के हेरफेर की अनुमति, औषधीय inhibitors के लिए सुलभ हो गया है.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल काटना और पोटा संबंधी वृषण और रोगाणु लाइन अल्सर खेती करने के लिए कैसे करें. पोटा संबंधी वृषण और संस्कृति की स्थिति के विकास पर सूचना संस्कृति में रहते वृषण और रोगाणु लाइन अल्सर की खुर्दबीन इमेजिंग डेटा के साथ प्रदान की जाती हैं. हम भी हिस्टोन acetyltransferase अवरोध anacardic एसिड का उपयोग हिस्टोन करने वाली protamine स्विच को लक्षित एक परख द्वारा उदाहरण के बाद meiotic शुक्राणुजनन, अध्ययन करने के लिए एक औषधीय परख का वर्णन. सिद्धांत रूप में, इस साधना ओ कई को संबोधित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैपूर्व और बाद meiotic शुक्राणुजनन में वहाँ अनुसंधान सवाल.
Introduction
कई प्रजातियों के पुरुष रोगाणु कोशिकाओं के विकास के एक क्रमिक प्रक्रिया है. यह आकृति विज्ञान और epigenetically अत्यधिक विशेष शुक्राणु के गठन में खत्म कि महत्वपूर्ण घटनाओं की एक श्रृंखला की विशेषता है. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में, वृषण विभाजन की नोक पर रोगाणु लाइन स्टेम कोशिकाओं asymmetrically 1,2 (एक सिंहावलोकन के लिए देखें चित्र 1) एक नई स्टेम सेल और spermatogonium, यानी, भेदभाव के लिए प्रतिबद्ध है कि बेटी सेल को जन्म देने के लिए . spermatogonium अर्धसूत्रीविभाजन की शुरुआत के साथ, प्रभावशाली वृद्धि और ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि का एक चरण spermatocyte चरण कहा जाता है, mitotic डिवीजनों के चार दौर आए और. एक spermatogonium से होने वाले कोशिकाओं को एक दूसरे से जुड़ा हुआ है और दो दैहिक कोशिकाओं एक संरचना एक पुटी के रूप में निर्दिष्ट से लिपटे एक सिंक्रनाइज़ बंडल के रूप में विकसित रहते हैं. अर्धसूत्रीविभाजन के पूरा होने के बाद, पुरुष रोगाणु कोशिकाओं की आकारिकी पूरी तरह से हैपुनर्गठित (रेखाचित्र के चित्र 1 में दिखाया गया है). प्रारंभ में, दौर spermatids hydrodynamic सिर संरचना के लिए फार्म बढ़ाना, और कशाभिका विकसित करता है. 5 - अंत में, शुक्राणु कोशिकाओं वैयक्तिकरण 3 नामक एक जटिल, apoptosis से संबंधित तंत्र के द्वारा एक दूसरे से अलग हो रहे हैं.
9 - ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर और स्तनधारी प्रजातियों सहित कई प्रजातियों, में, अगुणित पुरुष रोगाणु लाइन chromatin की एक उल्लेखनीय epigenetic पुनर्व्यवस्था के साथ कर रहे रोगाणु कोशिकाओं के morphological परिवर्तन, (एचपी स्विच) 6 हिस्टोन करने वाली protamine स्विच कहा जाता है. संभवत: लगभग सभी विहित हिस्टोन और कई हिस्टोन संस्करण अणु डीएनए से छीन रहे हैं और परिपक्व शुक्राणु के क्रोमेटिन के लिए विशिष्ट अत्यधिक कॉम्पैक्ट nucleoprotamine संरचना में जिसके परिणामस्वरूप छोटे बुनियादी प्रोटीन, protamines, द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं. हिमाचल प्रदेश के स्विच की सामान्य विशेषताएँ हैं टीपहले तो संक्रमणकालीन प्रोटीन से, और अंत में protamines द्वारा हिस्टोन वेरिएंट द्वारा विहित हिस्टोन की वह प्रतिस्थापन. 12 - यह सब हिस्टोन हटाने 7,10 करने से ठीक पहले इस तरह के हिस्टोन H4 के एसिटिलीकरण के स्तर में वृद्धि के रूप में epigenetic निशान में कई बदलाव, के साथ है.
नहीं तो सब अधिकांश, उपर्युक्त प्रक्रियाओं की परिपक्व, पूरी तरह से उपजाऊ शुक्राणु के विकास के लिए आवश्यक हैं. यह स्तनधारी शुक्राणुजनन शेयरों के रूप में, अकशेरुकी प्रणाली 1,8,9 के साथ समानता का एक काफी मात्रा में ड्रोसोफिला में बल्कि मानव में न केवल सच है. पुरुष रोगाणु सेल विकास का अध्ययन बहुत ड्रोसोफिला मॉडल प्रणाली में मदद की है. मक्खियों आनुवंशिक रूप से अत्यधिक सुलभ हैं. म्यूटेंट की पीढ़ी के साथ ही संलयन जीन या आरएनए हस्तक्षेप निर्माणों व्यक्त मक्खी उपभेदों की स्थापना थोड़ा प्रयास करता है. हालांकि, बाद के meiotic शुक्राणुजनन, म्यूटेंट के उपयोग के अध्ययन में एकडी सरल आनुवंशिक उपकरण एक सीमा तक पहुंच सकता है. ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन में, प्रतिलेखन meiotic डिवीजनों में प्रवेश के साथ लगभग पूरी तरह से समाप्त हो जाता है. 16 - इस प्रकार, बाद meiotic शुक्राणुजनन मुख्य रूप से एक विस्तारित meiotic प्रोफेज़ 13 में संश्लेषित translationally दमित और संग्रहीत mRNAs पर आधारित है. इसलिए, आरएनए हस्तक्षेप या गैर सशर्त म्यूटेंट के उपयोग जैसे उपकरणों विशेष रूप से भी पूर्व meiotic या meiotic रोगाणु सेल विकास में आवश्यक कार्यों को पूरा कि जीन उत्पादों के बाद की meiotic भूमिकाओं के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं.
20 - ऐसे मामलों में शोषण किया जा सकता है कि ड्रोसोफिला का एक फायदा संस्कृति के माध्यम 4,12,17 में पूर्व vivo विकसित करने विच्छेदित बरकरार वृषण और रोगाणु कोशिकाओं के भी अल्सर की क्षमता है. वृषण या रोगाणु लाइन अल्सर का विच्छेदन और खेती जीवित कोशिकाओं में जर्म सेल विकास की न केवल सूक्ष्म अवलोकन की अनुमति देता है, लेकिन एकlso साथ औषधीय assays, का उपयोग जैसे, ऐसे हिस्टोन acetyltransferases (टोपी), हिस्टोन deacetylases (HDACs), टोपोईसोमेरासिज़, या एंटीबॉडी के रूप में एंजाइम परिसरों के अवरोधकों. इस प्रकार, यह बाद की meiotic शुक्राणुजनन दौरान एंजाइमी कार्यों में हेरफेर करने के लिए और की परवाह किए बिना, भ्रूण पूर्व meiotic, या meiotic कार्यों 4,12 के विकास के परिणामों पर नजर रखने के लिए संभव है.
औषधीय assays में, हम पहले से meiotic प्रोफेज़ दौरान एक bromodomain प्रोटीन की एसिटिलीकरण निर्भर स्थानीयकरण के साथ ही टोपी और HDACs 12,21 को लक्षित विशिष्ट अवरोधकों का उपयोग कर के बाद meiotic शुक्राणुजनन में epigenetic हिमाचल प्रदेश स्विच के लिए हिस्टोन एसिटिलीकरण स्तर की प्रासंगिकता का विश्लेषण किया. इन assays में हिमाचल प्रदेश स्विच लक्ष्य निर्धारण संलयन जीन histone2AvD-आरएफपी और अंतर्जात पैटर्न में protamineB-EGFP 12,22 व्यक्त कि एक मक्खी तनाव का उपयोग करके संभव बनाया, और अवलोकन किया गया था किपोटा संबंधी वृषण में पहली spermatids 24 और 48 घंटा APF 12 के बीच हिमाचल प्रदेश स्विच के माध्यम से गुजरती हैं.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला pupae, संस्कृति की स्थिति, और बरकरार पोटा संबंधी वृषण साथ एक औषधीय परख से वृषण और अल्सर के विच्छेदन का वर्णन है. इस प्रयोजन के लिए, puparium गठन (APF) के बाद लगभग 24 घंटे पर पोटा संबंधी वृषण विच्छेदित कर रहे हैं (आंकड़े 1 और देखते 2). इस समय, वृषण अन्य ऊतकों को कनेक्शन नहीं बनाया है और अवरोध यौगिकों 23,24 से बेहतर पैठ की अनुमति देता है जो केवल एक पतली बाहरी म्यान, से घिरे हैं. वृषण आसानी संस्कृति में लिया जा सकता है कि bean- या नाशपाती के आकार का अंग हैं. ये वृषण सुसंस्कृत, विच्छेदित, और विशिष्ट inhibitors के साथ व्यवहार कर रहे हैं. बाद में, अवरोधकों का प्रभाव immunofluorescence विश्लेषण करती है और संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग निगरानी कर रहे हैं, और परमाणु morphol की तुलना द्वाराअनुपचारित रोगाणु कोशिकाओं की है कि इलाज रोगाणु कोशिकाओं की ogy. इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत की स्थिति भी संस्कृति में वृषण और रोगाणु लाइन अल्सर के विकास के लाइव इमेजिंग अनुमति देते हैं.
Protocol
आचार बयान:
इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं विशेष रूप से ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के साथ काम करते हैं और जर्मनी में पशु कल्याण कानूनों के अधीन नहीं हैं शामिल.
मीडिया, उपकरण, और मक्खियों की 1. तैयारी
- पोटेशियम बिकारबोनिट 17 बिना संशोधित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पाउडर एम 3 वृद्धि मध्यम तैयार करें. चेतावनी: आंख और त्वचा के लिए परेशान. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ मध्यम पूरक, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन. अच्छे परिणाम के लिए गर्मी निष्क्रिय और कीट संस्कृति का परीक्षण भ्रूण गोजातीय सीरम का प्रयोग करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में एक 0.2 माइक्रोन बोतल टॉप फिल्टर यूनिट और दुकान के माध्यम से (माध्यम के रूप में इसके बाद के लिए कहा गया है) पूरा मध्यम फ़िल्टर. उपयोग से पहले, फिल्टर (0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर टिप) मध्यम फिर अवक्षेप को दूर करने के लिए.
- औषधीय assays के लिए अवरोध करनेवाला स्टॉक समाधान तैयार करें. Dissolaliquots में उपयुक्त विलायक और दुकान में रसायनों की है. (: आंख और त्वचा के लिए परेशान सावधानी) dimethylsulfoxide में उदाहरण के लिए, 28.69 मिमी anacardic एसिड का एक शेयर समाधान तैयार है.
- विच्छेदित पोटा संबंधी वृषण और एक अल्सर के विच्छेदन के विघटन के लिए उपकरण तैयार करें. दो तेज और कड़ी सुई, बजाय संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें. संदंश की एक जोड़ी के दो हथियार के बीच विकसित कि केशिका बल बहुत मुश्किल मध्यम से थोड़ी मात्रा में ही अल्सर के विच्छेदन बनाता है. उदाहरण के लिए, एक टीका पाश धारक में डाला एक स्टेनलेस स्टील कीट पिन की नोक का उपयोग करें.
- वयस्क मक्खियों की एक पर्याप्त संख्या (सीए 40-60 मक्खियों) के साथ उचित वृद्ध pupae, बीज सीए 10 बड़े संस्कृति शीशियों (4 सेमी व्यास के साथ ट्यूब) प्राप्त करने के लिए. हिमाचल प्रदेश के स्विच का विश्लेषण करने के लिए, उनके अंतर्जात पैटर्न 12,16,22 में H2AvD-आरएफपी और ProtamineB-EGFP व्यक्त मक्खियों का उपयोग करें. 25 में मानक परिस्थितियों में शीशियों सेते; ऊपर 4-5 दिनों के तीसरे instar लार्वा क्रॉल जब तक सीए के लिए डिग्री सेल्सियस और शीशियों 25 की दीवारों पर प्यूपीकरण शुरू.
विच्छेदन के लिए 24 घंटे की उम्र pupae प्राप्त करने के लिए 2 अंकन या सफेद एकत्रित पूर्व pupae
- , हिमाचल प्रदेश स्विच पर कुछ रसायनों के प्रभाव का परीक्षण सीए 24 घंटा APF 12 पर पोटा संबंधी वृषण काटना. मंचन pupae प्राप्त करने के लिए, लार्वा pupating साथ तैयार मक्खी संस्कृति शीशियों ले (अनुभाग 1.4 देखें) और संभव के रूप में कई सफेद पूर्व pupae की पहचान. प्यूपीकरण में बहुत पहले कदम के दौरान पूर्व pupae स्थिर, गैर खिला, everted spiracles और सफेद रंग का puparium के साथ नहीं बल्कि छोटा लार्वा के रूप में दिखाई देते हैं. puparium पोटा संबंधी विकास 26 के अगले चरण को इंगित करता है जो 30 से 60 मिनट के भीतर तन भूरे रंग हो जाता है.
- शीशियों के बाहर पर एक स्थायी मार्कर के साथ पूर्व pupae के पदों के निशान. सीए 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर शीशियों सेते हैं.
- वैकल्पिक रूप से,पीबीएस बफर के साथ सिक्त एक छोटे ब्रश के साथ शीशियों की ओर से पूर्व pupae लेने. फिर एक ताजा 50 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब की ओर से पूर्व pupae हस्तांतरण और सीए 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
Puparium गठन के बाद सीए 24 घंटा में पोटा संबंधी वृषण की 3 विच्छेदन
- एक 10 सेमी प्लास्टिक सेल संस्कृति या पेट्री डिश पर मध्यम से कई बूँदें (सीए 80 μl प्रत्येक) बांटो. संदंश की एक व्यापक जोड़ी या माध्यम से सिक्त एक ब्रश का प्रयोग, (धारा 2 देखें) incubated शीशियों से 24 घंटा APF मंच पर pupae लेने. पकवान पर मध्यम से प्रत्येक बूंद के लिए एक प्यूपा स्थानांतरण.
- विच्छेदन के लिए, एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाशक से लैस एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. इस संस्कृति में समुचित विकास को रोकने सकता है के रूप में विच्छेदन के दौरान आरटी ऊपर वृषण गर्मी नहीं है.
- नहीं 5 संदंश के दो जोड़े के साथ pupae काटना. एक जोड़ी के साथ, अपनी सबसे पीछे में प्यूपा हड़पनेभाग (पीछे spiracles) और स्थिति में पकड़.
- संदंश के अन्य जोड़ी के साथ पूर्वकाल spiracles ले लो और अपने पूर्वकाल अंत में पोटा संबंधी operculum खुला. छाती की कम से कम हिस्सा संपर्क में है जब तक पोटा संबंधी मामले को छीलकर.
- इसकी सबसे पीछे अंत तक स्थिति में प्यूपा पकड़ जारी. प्यूपा की आंतरिक दबाव जारी, प्यूपा के प्रमुख क्षेत्र में संदंश की एक जोड़ी के दोनों हाथ डालें.
- संदंश खोलने और पूर्वकाल दिशा में संदंश ले जाकर खुला प्यूपा चीर. इस आंदोलन के साथ उत्पन्न उद्घाटन पहले ही प्रयास में संभव के रूप में बड़े रूप में है कि सुनिश्चित करें. दबाव इस वृषण छोटे से खोलने के माध्यम से सीधे धक्का दिया जा रहा है और सबसे अधिक बार बाधित किया जा रहा में परिणाम हो सकता है के रूप में जारी किया गया है से पहले अपने पीछे अंत में प्यूपा हानिकारक से बचने.
- प्यूपा खोला है एक बार, प्यूपा की जारी आंतरिक दबाव ला के माध्यम से वसा शरीर की कोशिकाओं और ऊतकों के agglomerates बाहर प्रेस कि निरीक्षणसिर क्षेत्र में rge उद्घाटन. पोटा संबंधी वृषण पहले से ही इस सामग्री के साथ प्यूपा से बाहर धक्का दे दिया गया है कि जाँच; यह कुछ मामलों में होता है. वृषण 24 घंटा APF पर किसी भी अन्य ऊतकों से जुड़े नहीं हैं और इसलिए प्यूपा 23 से आसानी से निष्कासित किया जा सकता है.
- वे प्यूपा में रहते हैं, तो यह वृषण नुकसान हो सकता है के रूप में संदंश के साथ प्यूपा फैलाएंगे बचें. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग खोलने के आकार में वृद्धि.
- तब इसकी सबसे पीछे अंत में प्यूपा पकड़. प्यूपा से वृषण जारी करने के लिए पूर्वकाल के लिए पीछे से प्यूपा की सामग्री बाहर अन्य संदंश की जोड़ी और धीरे लकीर को बंद करें.
- एक पूर्व में कटौती 200 μl विंदुक टिप में उन्हें खींच कर वृषण लीजिए. वृषण साथ तबादला वसा शरीर की कोशिकाओं की संख्या कम करने के लिए मध्यम से केवल एक बहुत छोटी राशि के हस्तांतरण की कोशिश करें. एक ताजा संस्कृति डिश में मध्यम में वृषण रखें. केवल कुछ वसा शरीर सेल तक वृषण माध्यम के साथ कई बार धोएंएस रहते हैं.
- लाइव इमेजिंग के लिए, मध्यम के साथ एक गिलास नीचे संस्कृति डिश वृषण हस्तांतरण और एक औंधा इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. औषधीय assays के लिए, चरण 5 के साथ जारी है.
पुरुष रोगाणु लाइन अल्सर और लाइव इमेजिंग के 4 विच्छेदन
- एक गिलास नीचे संस्कृति डिश के लिए एक या अधिक पोटा संबंधी वृषण स्थानांतरण.
- फाइबर ऑप्टिक रोशनी और दो स्टेनलेस स्टील सुइयों के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का प्रयोग पुरुष रोगाणु लाइन अल्सर के विच्छेदन के लिए (अनुभाग 1.3 देखें).
- एक सुई के साथ, ध्यान से अपने पूर्वकाल या पीछे अंत में एक वृषण नीचे पिन करने की कोशिश. स्थिति में यह पकड़ो. वृषण में अन्य सुई डालें और बग़ल में सुई ले जाकर वृषण म्यान बाधित. अल्सर के कई लोग इस आंदोलन से वृषण से जारी किया जाएगा.
- एक सुई के साथ स्थिति में वृषण पकड़ जारी. अन्य सुई के साथ वृषण से शेष अल्सर बाहर धीरे लकीर.
- सज्जन से अलग एकत्रित अल्सर या तोly अल्सर के क्लस्टर के माध्यम से या एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग कर के माध्यम से एक ताजा संस्कृति डिश अल्सर स्थानांतरित द्वारा बग़ल में एक सुई घूम रहा है.
- एकल अल्सर का लाइव इमेजिंग के लिए एक औंधा इमेजिंग खुर्दबीन के लिए संस्कृति पकवान ले जाएँ. एक सुई यदि आवश्यक हो तो साथ फिर से अल्सर फैलाने.
- चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अल्सर की अवस्था को पहचानें.
- वांछित मंच की एक पुटी पर ध्यान दें. अल्सर संस्कृति डिश के नीचे का पालन करना है और इसलिए ध्यान से बाहर फ्लोट करने के लिए करते हैं नहीं है, जैसा कि अक्सर लंबे समय तक इमेजिंग प्रयोगों के दौरान ध्यान केंद्रित करने और पुटी की स्थिति की पुष्टि करें.
नोट: स्थिरीकरण के लिए पाली एल Lysine साथ पकवान कोटिंग जल्दी रोगाणु लाइन अल्सर के विकास के लिए हानिकारक है. इसके बजाय, व्यक्तिगत अल्सर अलग किया जा सकता है. कुछ अभ्यास के साथ, यह बहुत धीरे सुई के साथ इसे आगे बढ़ाने के द्वारा एक विशेष पुटी बाहर एकल करने के लिए संभव है. यह अलग पंथ को एक अल्सर के हस्तांतरण की अनुमति देगामाइक्रोस्कोप से देखने के क्षेत्र में फिट बैठता है कि एक बाहर खींचा टिप के साथ एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ ure व्यंजन. पृथक अल्सर तो आसानी से भी लंबी अवधि के ऊष्मायन के बाद संस्कृति बर्तन में जगह बदली जा सकती है.
बरकरार पोटा संबंधी Testes साथ 5 भेषज परख
- 12 प्रतिकृति का एक प्रयोग के लिए माध्यम के 500 μl के साथ एक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट की हर अच्छी तरह से भरें. एक पूर्व में कटौती 200 μl विंदुक टिप का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण एक पोटा संबंधी वृषण,.
- एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अलग वृषण में protamines की उपस्थिति के लिए जाँच करें. वृषण हिमाचल प्रदेश स्विच अल्सर में से किसी में जगह नहीं लिया गया है कि जो इंगित करता है ProtamineB-EGFP संकेत, से मुक्त होना चाहिए. पहले से ही ProtamineB-EGFP पॉजिटिव अल्सर चलता है कि वृषण बदलें.
- पहले 12 कुओं, वांछित अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए पतला अवरोध यौगिक (anacardic एसिड) युक्त मध्यम के 500 μl जोड़नेअच्छी तरह से प्रति माध्यम से 1 मिलीलीटर में (150 माइक्रोन). अनुपचारित नियंत्रण के रूप में शेष कुओं का उपयोग करें; अवरोध यौगिकों के साथ के रूप में इस्तेमाल विलायक की एक ही राशि के साथ मध्यम के 500 μl जोड़ें. नोट: कई अलग अलग यौगिकों और विलायकों उपयोग किया जाता है, तो यह नियंत्रण के रूप में अकेले माध्यम का उपयोग करने के लिए और अधिक कुशल हो सकता है और अलग प्रयोगों में विलायक सांद्रता में वृद्धि के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए.
- अंधेरे में 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
- जैसा कि ऊपर वर्णित incubated वृषण में protamines की उपस्थिति के लिए फिर से जाँच करें. नियंत्रण वृषण अब हिमाचल प्रदेश स्विच के माध्यम से संक्रमण को इंगित करता है जो एक या एक से अधिक ProtamineB-EGFP पॉजिटिव अल्सर, दिखाना चाहिए.
- एक 200 μl टिप के साथ एक विंदुक का प्रयोग,, पाली एल Lysine लेपित स्लाइड के लिए वृषण हस्तांतरण कहीं 12,27,28 वर्णित के रूप में उपयुक्त फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ स्क्वैश तैयारी और दाग रही है.
Representative Results
ड्रोसोफिला पुरुषों में वृषण पहले से ही भ्रूण में गठन और लार्वा चरणों के दौरान शरीर गुहा में बनी रहती है. तीसरे instar लार्वा शो छोटे, गोल वृषण भविष्य वर्णक कोशिकाओं की एक परत से घिरा हुआ है और वसा शरीर के ऊतकों (2A चित्रा) में एम्बेडेड. वयस्क नर मक्खियों में वृषण जननांग डिस्क और एक वर्णक परत 24 से होने वाले मांसपेशियों की कोशिकाओं की एक परत द्वारा कवर कर रहे हैं, जो लंबे समय तक, coiled ट्यूब, कर रहे हैं. दिलचस्प है, लार्वा वृषण meiotic प्रोफेज़ से मेल खाती है जो प्राथमिक spermatocyte चरण, जब तक पूर्व meiotic और meiotic चरणों की ही रोगाणु लाइन कोशिकाओं को शामिल 23 (भी 1 आंकड़ा देखें). पुरुष रोगाणु कोशिकाओं के पहले साथियों puparium गठन के दौरान अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से गुजरती हैं. सीए 24 घंटा APF में, लम्बी flagella साथ के बाद meiotic चरणों पहले से ही विकसित किया है, और सभी नाभिक हिस्टोन H2AvD-आरएफपी होते हैं (आंकड़े 1 और 2 बी). Spermatids में से कोई भी टी आया हैवह कोई ProtamineB-EGFP संकेत के रूप में हिमाचल प्रदेश स्विच प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा -2) द्वारा पता लगाया जा सकता है. अक्सर, इस स्तर पर विच्छेदित वृषण तेल की कई बूँदें (चित्रा -2, Arrowhead) को एक वसा शरीर की कोशिकाओं की agglomerate या एक की याद ताजा चर आकार के एक ऑटो फ्लोरोसेंट संरचना होती है. वृषण के भीतर इस संरचना भी चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के साथ दिख रहा है. तिथि करने के लिए, हम साहित्य में अपनी प्रकृति के किसी भी विवरण नहीं मिला है. 36 घंटा APF में विच्छेदित वृषण लम्बी और कुछ मामलों में पहले से ही (चित्रा 2 डी) कर्ल करने के लिए शुरू दिखाई. वे पहले से ही जननांग imaginal डिस्क 23,24 से बाहर बढ़ती जननांग पथ के ऊतकों से जुड़ी है. इसके अलावा, वे अक्सर ProtamineB-EGFP संकेत (आंकड़े 1 और 2 डी, तीर) ने संकेत के रूप में, हिमाचल प्रदेश स्विच परे पहली spermatids होते हैं. 48 घंटा APF में, वृषण आगे लम्बी है और स्पष्ट रूप से पर कर्लिंग शुरूसमीपस्थ अंत. Protamine पॉजिटिव नाभिक के साथ कई रोगाणु लाइन अल्सर (तीर, चित्रा 2 ई) दिखाई देने लगते हैं.
24 घंटा APF में विच्छेदित वृषण 24 घंटे के लिए संस्कृति में रखा जाता है, वे बरकरार मक्खी के रूप में बढ़ाना नहीं है ('चित्रा 2 डी तुलना और चित्रा 6A साथ 2 ई). इस वजह से सामान्य रूप से इसके पीछे टिप 23,29 में वृषण से संपर्क विकासशील जननांग पथ से भेजा स्थितीय और विकास संकेतों की कमी के कारण संभवतः है. नवजात myotubes वृषण से 24 जननांग डिस्क से विस्थापित नहीं किया जा सकता, क्योंकि इसके अलावा, वृषण म्यान की पेशी परत विकास नहीं करता. वृषण म्यान-में इस स्थिति को पूरी तरह पतली वर्णक परत करता भीतर रोगाणु कोशिकाओं के विकास की बढ़ती संख्या लिफाफा संस्कृति में पर्याप्त रूप से विकसित करने के लिए नहीं लगता. हालांकि, जर्म कोशिकाओं, विभाजित हो जाना, और स्वतंत्र रूप से वृषण म्यान से अलग. इसलिए अधिक से अधिक 36 घंटे के बादसंस्कृति में अनुसंधान, जल्दी वृषण अक्सर खुले फट जाएगा, और आगे विकास नहीं मनाया जाता है. हालांकि, एक छोटे समय सीमा के भीतर, यह आंकड़े 3 ए -3 सी इसका सबूत के रूप में, संस्कृति में विकासशील पूरी वृषण के समय चूक पूर्व vivo लाइव छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए संभव है (यह भी 1 से पूरक वीडियो देखें). सीए 45 घंटा APF में विच्छेदित एक पोटा संबंधी वृषण, 6 घंटे के लिए मध्यम में incubated और हर 5 मिनट उतारी थी. इस समय सीमा के भीतर, spermatids के कई अल्सर हिमाचल प्रदेश स्विच मंच से उभरने और ('-3 सी, खुले तीर आंकड़े 3 ए) एक उज्ज्वल ProtamineB-EGFP संकेत दिखा.
जैसा कि ऊपर कहा, ड्रोसोफिला वृषण में पुरुष रोगाणु कोशिकाओं परस्पर कोशिकाओं की सिंक्रनाइज़ बंडलों के रूप में विकसित करने, नाम अल्सर 1. चित्रा -4 ए के आसपास 24 घंटा APF को पोटा संबंधी वृषण से विच्छेदित अल्सर का अवलोकन से पता चलता है. पूर्व meiotic चरणों, Meiotic चरणों, जल्दी के बाद meiotic चरणों, और भी (आंकड़े 1 और 4 बी -4 ई) पाया जा सकता है हिमाचल प्रदेश स्विच करने से पहले लम्बी नाभिक के साथ जल्दी डोंगी चरण में अल्सर. पृथक अल्सर बहुत कमजोर हैं और सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए. पुटी का लिफाफा कि फार्म दो दैहिक कोशिकाओं को आसानी से यंत्रवत् बाधित हो सकता है. रोगाणु लाइन स्टेम कोशिकाओं को जीवित और इन विवो 30 में दैहिक पुटी कोशिकाओं के आनुवंशिक पृथक के बाद विभाजित जारी रखने की क्षमता है. यह इन विट्रो में, 16 सेल चरण के रोगाणु कोशिकाओं और विकसित करने और 19 अंतर उनके दैहिक लिफाफा से अलग बताया गया है कि. दरअसल, हम शायद देर spermatocytes बहुत बार बार हालांकि, बाधित पुटी कोशिकाओं के साथ meiotic डिवीजनों पूरा कि हमारी संस्कृति प्रणाली में देखा. ज्यादातर अक्सर, इन बाधित अल्सर विकास रह गए हैं. प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बाद, कुछ मामलों में बरकरार अल्सर हो सकता देव72 घंटे की एक अधिकतम के लिए Elop पूर्व vivo संस्कृति में मध्यम. हालांकि, हम अल्सर की एक उचित संख्या ऊष्मायन के 48 घंटे तक का समय जीवित रहने कि मनाया. इस समय सीमा के भीतर, सुसंस्कृत अल्सर हिमाचल प्रदेश परे देर डोंगी चरण 12 से स्विच जब तक meiotic डिवीजनों के बाद जब तक है और साथ ही हिस्टोन आधारित क्रोमेटिन साथ दौर नाभिक मंच से प्राथमिक spermatocyte मंच से विकसित करने में सक्षम हैं. इस spermatocytes meiotic डिवीजनों (चित्रा 5 और 2 पूरक वीडियो) में प्रवेश, उदाहरण के लिए, के रूप में शुक्राणुजनन में महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का जीना इमेजिंग की अनुमति देता है. इस प्रयोग के लिए, आरएफपी टैग हिस्टोन संस्करण H2AvD गुणसूत्र मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था. प्राथमिक spermatocyte चरण विवो 31 में सीए 3 दिन के लिए फैली हुई है. इसलिए, meiotic डिवीजनों को दर्ज करने के क्रम में, हम दिख chromatin संघनन (चित्रा 5 ए, क्षेत्र 2) शुरू की थी कि spermatocytes साथ अल्सर चुना है. अर्धसूत्रीविभाजन spermatocytes में शुरू होता हैशेष spermatocytes में एक लहर में इस प्रकार है तो सिस्ट के एक तरफ और (क्षेत्र 1 के लिए क्षेत्र 2 से चित्रा 5A में भी 2 से पूरक वीडियो देखें). क्रोमेटिन का संघनन जल्द ही उज्ज्वल स्पॉट (चित्रा 5 ए, क्षेत्र 2) के रूप में दिखाई दे रहे हैं कि तेजी से बढ़ गुणसूत्रों की ओर जाता है. 30 मिनट के बाद इस क्षेत्र की पहली spermatocytes (चित्रा 5 ब, तीर) telophase में पहले से ही कर रहे हैं. छोटे क्षेत्र 1 के गुणसूत्रों मेटाफ़ेज़ प्लेट 20 मिनट बाद (चित्रा 5C) में व्यवस्था. वे पूरी telophase और लगभग 15 मिनट बाद (चित्रा 5D) cytokinesis गुजरना करने के लिए तैयार हैं. Anaphase, telophase, और cytokinesis इस रिकॉर्डिंग (पूरक वीडियो 2) में सीए 10 मिनट तक चली.
स्तनधारियों में, साथ ही ड्रोसोफिला में के रूप में, हिस्टोन H4 एसिटिलीकरण में एक स्पष्ट वृद्धि के बाद meiotic दौरान हिस्टोन हटाने और हिमाचल प्रदेश के स्विच की शुरुआत के निशानशुक्राणुजनन 6,11. यह इस epigenetic संशोधन एक आवश्यक घटक या हिमाचल प्रदेश की विकास कार्यक्रम की भी ट्रिगर 10,32 स्विच है कि प्रस्तावित किया गया है. इससे पहले, हम अवरोधकों के बाद meiotic चरणों 12 के दौरान हिस्टोन H4 के एसिटिलीकरण स्तर को प्रभावित करने के लिए टोपी और HDACs को लक्षित साथ संस्कृति में ड्रोसोफिला पोटा संबंधी वृषण इलाज किया. इन औषधीय assays में, हम हिस्टोन एसिटिलीकरण protamine आधारित क्रोमेटिन साथ चरणों को हिस्टोन आधारित क्रोमेटिन साथ चरणों से शुक्राणुजनन की प्रगति के लिए आवश्यक है कि पाया.
आंकड़े 6 और 7 पोटा संबंधी वृषण में टोपी को लक्षित करने anacardic एसिड का उपयोग कर एक औषधीय परख के प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं. 24 घंटा APF में वृषण H2AvD-आरएफपी और ProtamineB-EGFP व्यक्त एक मक्खी तनाव से विच्छेदित किया गया. ProtamineB-EGFP प्रोटीन इन जल्दी पोटा संबंधी वृषण (चित्रा 6A और बी) में अनुपस्थित था. 24 घंटे के बादसंस्कृति में अनुसंधान, नियंत्रण वृषण पहले अल्सर हिमाचल प्रदेश स्विच (चित्रा 6A ', खुला तीर) से परे विकसित किया था जो संकेत दिया कि ProtamineB-EGFP संकेत दिखाया. यह 150 माइक्रोन anacardic एसिड (चित्रा 6B ') के साथ इलाज वृषण के साथ ऐसा नहीं था. वृषण स्क्वैश तैयारी और immunofluorescence विश्लेषण अधिक विस्तृत जानकारी (चित्रा 7) प्रदान करते हैं. अनुपचारित नियंत्रण में, अपेक्षाकृत बड़े प्राथमिक spermatocytes के नाभिक प्रमुख गुणसूत्रों को ड्रोसोफिला (चित्रा 7A, स्तंभ 1) के (4C स्तर) अनुरूप जो बड़े पैमाने पर दाग डीएनए के तीन क्षेत्रों की उनकी विशेषता पैटर्न द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है. हिस्टोन H4 के एसिटिलीकरण इस स्तर (चित्रा 7B, स्तंभ 1) में स्पष्ट रूप से पता लगाने योग्य है. meiotic डिवीजनों के बाद पहले चरण Nebenkern मंच के रूप में जाना जाता है और नहीं बल्कि बड़ी, गोल नाभिक की विशेषता है (चित्रा 4C देखो, 7 चित्र में दिखाया नहीं). 7 चित्र में दिखाया अगले चरण कशाभ विकास और पहले से ही (चित्रा 7A, स्तंभ 2) पहले चरण की तुलना में बहुत छोटे होते हैं और हिस्टोन H4 एसिटिलीकरण के लगभग undetectable स्तर बहुत कम दिखा जो रोगाणु सेल नाभिक, का गोल आकार द्वारा की पहचान की है (चित्रा 7B, स्तंभ 2). गोल आकार तो (चित्रा 7A, कॉलम 3) elongates, और हिस्टोन H4 के एसिटिलीकरण स्पष्ट रूप से फिर से (चित्रा 7B, कॉलम 3) detectable है. spermatids तो हिमाचल प्रदेश स्विच जगह लेता है और हिस्टोन protamines द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं जिसमें डोंगी आकार मंच तक पहुँचने (आंकड़े 7A - 7 सी, कॉलम 4 और 5). डोंगी चरण के बाद, protaminated नाभिक तो आगे परिपक्व शुक्राणु (यहाँ दिखाया गया है) में एक बहुत पतली सुई आकार में बढ़ाना.
Anacardic एसिड के साथ इलाज वृषण के वृषण स्क्वैश तैयारी परिणाम (आंकड़े अलग 7 दिन <दिखाया/ Strong> - 7 एफ). anacardic एसिड के साथ इलाज रोगाणु कोशिकाओं में chromatin अधिक अनुपचारित नियंत्रण (चित्रा 7 दिन, इलाज और 7A, नियंत्रण तुलना) की तुलना में सघन दिखाई दिया. इम्यूनोफ्लोरेसेंस H4 के एसिटिलीकरण बहुत कम या anacardic एसिड (चित्रा 7E) के साथ इलाज रोगाणु कोशिकाओं के नाभिक में भी अनुपस्थित था कि पता चला विश्लेषण करती है. हिस्टोन एसिटिलीकरण कि कमी क्रोमेटिन क्षेत्रों अक्सर एक दमनकारी संरचना 33 दिखाने जबकि यह अत्यधिक acetylated हिस्टोन खुला क्रोमेटिन के क्षेत्रों के साथ जुड़े रहे हैं कि जाना जाता है. इसलिए, यह anacardic एसिड के साथ इलाज के इलाज रोगाणु सेल नाभिक क्रोमेटिन संरचना प्रभावित है कि आश्चर्य की बात नहीं है. महत्वपूर्ण बात है, देर डोंगी चरण का या परे नहीं protamine पॉजिटिव नाभिक इलाज वृषण (चित्रा 7F) में पहचान की गई. Spermiogenesis fro आगे बढ़ने के लिए इस प्रकार, हमारे डेटा विचार के साथ संगत कर रहे हैं टोपी गतिविधि के लिए आवश्यक है किएम protamine आधारित क्रोमेटिन चरणों को क्रोमेटिन हिस्टोन आधारित.
ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन की संख्या 1 अवलोकन. बाएं पैनल व्यक्तिगत शुक्राणु के लिए एक स्टेम सेल से रोगाणु सेल विकास में चरणों के अनुक्रम प्रदर्शित करता है. योजनाबद्ध चित्र रोगाणु कोशिकाओं की विशेषता परमाणु आकारिकी दिखा. एक spermatogonium एक पुटी में 16 परस्पर spermatocytes का उत्पादन करने में बिताते हैं. इस चरण के दौरान के बाद meiotic विकास के लिए आवश्यक टेप की सबसे अधिक है, का उत्पादन किया translationally दमित, और जमा हो जाती है. ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के थोक meiotic डिवीजनों में प्रवेश के साथ समाप्त होता है. क्रोमेटिन में हिस्टोन करने वाली protamine स्विच जल्दी और देर से डोंगी चरण के बीच होता है. एक हिस्टोन आधारित क्रोमेटिन साथ चरणों उच्च रहे हैंलाल रंग में प्रकाशित; एक protamine आधारित क्रोमेटिन साथ चरणों हरे रंग में डाला जाता है. राइट पैनल में सलाखों सीए 24 में रोगाणु सामान्य रूप से लार्वा में विकासशील वृषण में पाया जा सकता है कि कोशिकाओं, pupae के चरणों और puparium गठन के बाद 36 घंटे (APF), और वयस्क मक्खियों से संकेत मिलता है.
विकास के विभिन्न चरणों में 2 ड्रोसोफिला वृषण चित्रा. (ए) एक तीसरे instar लार्वा (L3) के एक थोड़ा कुचल पूरे माउंट वृषण के चरण विपरीत छवि. केवल पूर्व meiotic और meiotic चरणों पाया जा सकता है. Spermatogonia हब क्षेत्र (तारांकन) नीचे पूर्वकाल टिप करने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं. शेष वृषण spermatocytes (खुला तीर). (बी) सीए को थोड़ा कुचल वृषण के चरण विपरीत छवि से भर जाता है Puparium गठन (APF) के बाद 24 घंटे. Spermatocytes (खुला तीर) के अलावा, वृषण बढ़ रही flagella (डबल खुला नोक) के साथ चरणों elongating में गोल नाभिक और spermatids साथ Nebenkern चरण में spermatids (खुला तीर), शामिल हैं (सी - ई). व्यक्त पोटा संबंधी वृषण साबुत माउंट H2AvD-आरएफपी और ProtamineB-EGFP (चरण विपरीत और EGFP और आरएफपी प्रतिदीप्ति छवियों के ओवरले). (सी) सीए 24 घंटा APF में विच्छेदित पोटा संबंधी वृषण. Arrowhead सीए 36 घंटा APF में विच्छेदित ख्यात वसा शरीर की कोशिकाओं. डी) पोटा संबंधी वृषण की ऑटो प्रतिदीप्ति पहले ProtamineB-EGFP पॉजिटिव पुटी (तीर) को प्रदर्शित करता है निशान. सीए 48 घंटा APF पर (ई) पोटा संबंधी वृषण एक समूह के साथ ProtamineB-EGFP पॉजिटिव अल्सर (तीर). सभी आंकड़ा भागों में, तारक हब क्षेत्र से संकेत मिलता है. स्केल सलाखों: 100 माइक्रोन.ANK "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
पूर्व vivo बढ़ती पोटा संबंधी वृषण में हिस्टोन करने वाली protamine स्विच की 3 लाइव इमेजिंग चित्रा. (ए) puparium गठन (APF) के बाद सीए 45 घंटा में संस्कृति में रखा H2AvD-आरएफपी और ProtamineB-EGFP व्यक्त पोटा संबंधी वृषण के चरण विपरीत छवि. लाभदायक पुटिका एक भरे तीर द्वारा संकेत दिया है. एक paragonium (डबल नोक) वृषण से जुड़ी रहती है. (ए) (ए) में दिखाया वृषण की EGFP और आरएफपी प्रतिदीप्ति. खुला तीर एक ProtamineB-EGFP पॉजिटिव पुटी इंगित करता है. स्केल बार:. 100 माइक्रोन (बी) 2 घंटा संस्कृति में 30 मिनट, कई आगे अल्सर (खुला तीर) के बाद fr उभरनेओम एक अतिरिक्त सीए के बाद हिस्टोन करने वाली protamine संक्रमण. (सी) संस्कृति में 3 घंटा, यानी, संस्कृति में 5 घंटा 29 मिनट की कुल मजबूत ProtamineB-EGFP संकेत के साथ अल्सर के एक समूह (खुला तीर) वृषण के समीपस्थ अंत में दिखाई देता है. यह भी पूरक वीडियो 1 देखें. सभी आंकड़ा भागों में, तारक हब क्षेत्र से संकेत मिलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
विकास के विभिन्न चरणों में रोगाणु कोशिकाओं के 4 पृथक अल्सर चित्रा. (ए) अल्सर puparium गठन (APF) के बाद सीए 24 घंटे में एक वृषण से विच्छेदित. चरण विपरीत और H2AvD-आरएफपी प्रतिदीप्ति (लाल) छवियों की ओवरले. स्केल बार: 100 माइक्रोन.(बी - ई) विभिन्न चरणों की एक अल्सर के magnifications. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और H2AvD-आरएफपी प्रतिदीप्ति छवियों के ओवरले. स्केल बार:. 16 spermatocytes 20 माइक्रोन (बी) पुटी Nebenkern चरण में 64 गोल spermatids (सी) पुटी.. Nebenkern संरचना अगले नाभिक (खुला नोक) से जुड़े हुए माइटोकांड्रिया से विकसित और डीआईसी छवियों में दिखाई देता है. दौर H2AvD-आरएफपी सकारात्मक नाभिक और elongating flagella साथ spermatids (डी) पुटी (खुला नोक के साथ जुडा हुआ है कि एक elongating Nebenkern संरचना को इंगित करता है बढ़ रही axoneme). (ई) एक लम्बी परमाणु आकार दिखा जल्दी डोंगी चरण में spermatids की एक पुटी के शिखर टिप. बड़े पैमाने पर लम्बी flagella केवल आंशिक रूप से दिखाई दे रहे हैं. इस च का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंigure.
H2AvD-आरएफपी व्यक्त संस्कृति में एक पुटी के अर्धसूत्रीविभाजन मैं पूर्व vivo. प्रतिदीप्ति छवियों के दौर से गुजर एक एकल 16 spermatocyte पुटी की चित्रा 5 लाइव इमेजिंग. पुटी एक लहर की तरह ढंग से meiotic डिवीजनों के माध्यम से पारित में अर्धसूत्रीविभाजन मैं Spermatocytes की विशेषता चरणों. हैं चित्रित (ए) क्रोमोजोम संक्षेपण तीर द्वारा संकेत पुटी (दिशा के माध्यम से (2) पुटी के एक पक्ष में नाभिक में शुरू होता है और प्रगति ). दूसरे क्षेत्र में नाभिक (1) तीन प्रमुख गुणसूत्रों अंकन हिस्टोन घने क्षेत्रों में अभी भी पहचाना जा सकता है जहां chromatin संघनन, के पहले चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. क्षेत्र में Spermatocytes (2) दिखाई उज्ज्वल फ्लोरोसेंट धब्बे के रूप में पूरी तरह गाढ़ा क्रोमोसोम होते हैं. (बी) 30 के बाद0; गुणसूत्र संक्षेपण क्षेत्र (1) में जारी है जबकि मिनट, क्षेत्र में पहली spermatocytes (2), telophase (खुला तीर) में हैं (सी) क्षेत्र के अंतिम spermatocytes में (1), गुणसूत्रों (तीर) की व्यवस्था कर रहे हैं. एक और 15 मिनट के भीतर मेटाफ़ेज़ प्लेट 20 मिनट बाद. (डी) में, पिछले spermatocytes telophase पूरा कर लिया है करने के लिए दिखाई देते हैं और अब cytokinesis (खुला तीर) से गुजरना करने के लिए तैयार हैं. . भी पूरक वीडियो 2 स्केल बार देखें:. 50 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 6 Anacardic एसिड सुसंस्कृत पोटा संबंधी वृषण में हिस्टोन करने वाली protamine स्विच रोकता. पोटा संबंधी वृषण expressi ((DMSO, dimethylsulfoxide; 'ए, एक नियंत्रण) या 150 माइक्रोन anacardic एसिड के साथ पूरक मध्यम में एनजी H2AvD-आरएफपी और ProtamineB-EGFP और puparium गठन के बाद 24 घंटे में विच्छेदित (APF) अवरोध के बिना माध्यम में 24 घंटे के लिए incubated रहे थे बी, बी '). तारक ने संकेत दिया हब क्षेत्रों. (ए, बी) नहीं ProtamineB-EGFP पॉजिटिव अल्सर विच्छेदन के बाद देखा जा सकता है. (ए ') ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, कुछ अल्सर हिस्टोन करने वाली protamine स्विच और ProtamineB-EGFP पॉजिटिव लिया anacardic एसिड के साथ इलाज अल्सर (खुला तीर) मनाया जा सकता है. (बी ') Testes ProtamineB-EGFP पॉजिटिव अल्सर विकसित नहीं है. स्केल बार:. 100 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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7 चित्रा Anacardic एसिड हिस्टोन H4 एसिटिलीकरण और spermatids की chromatin संरचना को प्रभावित करता है पोटा संबंधी वृषण से spermatid नाभिक ProtamineB-EGFP व्यक्त (24 घंटा APF) अवरोध (एक - सी) के बिना 24 घंटे के लिए incubated स्क्वाश तैयारी. या 150 माइक्रोन anacardic एसिड के साथ (डी - एफ). डीएनए Hoechst डाई (ए और डी) के साथ दाग. H4 एसिटिलीकरण (बी और ई) immunofluorescently विश्लेषण किया. ProtamineB-EGFP संकेत (सी और एफ) के साथ नजर रखी protamines की उपस्थिति. Anacardic एसिड के साथ उपचार के बाद, क्रोमेटिन दृढ़ता (डी) जमा हुआ प्रतीत होता है और H4 एसिटिलीकरण संकेत पूरी तरह से सभी spermatid चरणों (ई) में कम है. इसके अलावा, anacardic एसिड का इलाजवृषण देर डोंगी चरण का या परे नहीं अल्सर और कोई ProtamineB-EGFP संकेत (एफ) दिखाते हैं. स्केल बार:. 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
पूरक 1 वीडियो 6 घंटा समय पाठ्यक्रम इमेजिंग के पूर्व vivo. वीडियो से बढ़ एक पोटा संबंधी वृषण में EGFP और हिस्टोन करने वाली protamine स्विच की आरएफपी प्रतिदीप्ति के माध्यम से लाइव इमेजिंग ProtamineB- के प्रसार में वृद्धि से हिस्टोन करने वाली protamine संक्रमण दिखाता है EGFP पॉजिटिव अल्सर. छवियाँ हर 5 मिनट हासिल किया गया. जानकारी के लिए, चित्रा 3 देखें. (डाउनलोड के तहत "suppl_video_1.MOV" देखें).
एक एकल 16 spermatocytes पुटी के दौर से गुजर अर्धसूत्रीविभाजन के पूरक वीडियो 2 लाइव इमेजिंग मैं पूर्व vivo. एक के समय चूक फ्लोरोसेंट इमेजिंग80 मिनट के पाठ्यक्रम पर H2AvD-आरएफपी व्यक्त संस्कृति में पुटी. यह वीडियो अर्धसूत्रीविभाजन मैं छवियाँ की विशेषता चरणों हर 1 मिनट हासिल किया गया दर्शाया गया है. जानकारी के लिए, चित्रा 5 देखें. (डाउनलोड के तहत "suppl_video_2.MOV" देखें).
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक दिया विकास के चरण में है और एक संस्कृति डिश में इन कोशिकाओं और ऊतकों के पूर्व vivo विकास पर ड्रोसोफिला वृषण और एकल रोगाणु लाइन अल्सर टुकड़े करने की क्षमता के आधार पर दोनों दो अलग अलग अनुप्रयोगों का वर्णन है. One आवेदन शुक्राणु विकास के दौरान महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं के औषधीय हेरफेर है. महत्वपूर्ण बात है, यह आसानी से मक्खी आनुवंशिकी के आधार पर कार्यात्मक विश्लेषण का उपयोग कर प्राप्त नहीं है कि बाद के meiotic शुक्राणुजनन के लिए उपयोग की अनुमति देता है. अन्य आवेदन में रहने वाले और रोगाणु कोशिकाओं और वृषण के विकास का सूक्ष्म अवलोकन है. विशेष रूप से संस्कृति में ड्रोसोफिला कोशिकाओं और अंगों की क्षमता से इस आवेदन के लाभ जीवित और आरटी पर और सामान्य वातावरण के तहत विकसित करने के लिए. इसलिए, (25 डिग्री सेल्सियस के मानक प्रजनन के तापमान को गर्म करने) एक गर्म मंच से लैस एक औंधा इमेजिंग माइक्रोस्कोप रहते इमेजिंग प्रयोगों में सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है. इसके अलावालाइव इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग प्रोटीन व्यक्त अधिक, कई ट्रांसजेनिक मक्खी उपभेदों मौजूद है या आसानी से स्थापित किया जा सकता है.
एक विशिष्ट विकास मंच की पोटा संबंधी वृषण या रोगाणु लाइन अल्सर प्राप्त करने के लिए, यह एक ड्रोसोफिला विकास के समय से परिचित है कि महत्वपूर्ण है. प्रत्येक चरण के लिए सही समय प्रयोगशालाओं, संस्कृति की स्थिति में भिन्नता है, और उपभेदों भरने के लिए और अनुभव से स्थापित किया जाना चाहिए सकता है. ऊपर उल्लिखित के रूप में, इस उदाहरण के लिए, हिमाचल प्रदेश स्विच लक्ष्य है कि, औषधीय assays के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस तरह के प्रयोगों के लिए, यह समय भी एक जनसंख्या के भीतर थोड़ा भिन्न हो सकते हैं, क्योंकि हमेशा वास्तविक अवरोध परीक्षण से पहले एक ProtamineB-EGFP संकेत के साथ spermatids के लिए जाँच करने के लिए सलाह दी जाती है.
संलग्न वसा शरीर के ऊतकों से मुक्त बरकरार अंगों के रूप में जल्दी पोटा संबंधी चरणों से वृषण काटना प्रयोगकर्ता सक्षम होना चाहिए ऊपर प्रोटोकॉल के बाद. ये वृषण और, उससे भी ज्यादा, जीई पृथकआरएम लाइन अल्सर बहुत ही कमजोर हैं. इसलिए, यह हैंडलिंग और संदंश, सुई, और pipettes का उपयोग वृषण और अल्सर के हस्तांतरण के लिए आवश्यक मैनुअल निपुणता और अनुभव को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है. खासकर meiotic और जल्दी के बाद meiotic रोगाणु सेल विकास को लक्षित पढ़ाई इस से लाभ होगा. यह वयस्क वृषण से लंबे flagella साथ देर spermatids के अल्सर टुकड़े करना अपेक्षाकृत आसान है, यह पहले चरण को प्राप्त करना कठिन है. इस प्रोटोकॉल के बाद जल्दी पोटा संबंधी वृषण से इन अल्सर विदारक बहुत ही कुशल है. एक सामान्य मक्खी तनाव में, pupae के केवल सीए 50% पुरुष हो जाएगा कि ध्यान में रखें. इसलिए, आवश्यक वृषण की संख्या के रूप में कई pupae के रूप में कम से कम दो बार काटना तैयार करते हैं. वैकल्पिक रूप से, यह वृषण बरकरार लार्वा 23,34 के पार्श्व वसा शरीर के ऊतकों में एम्बेडेड के रूप में पारदर्शी दौर अंगों पहचाना जा सकता है के रूप में, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग पुरुष L3 लार्वा की पहचान करने के लिए, और ताजा संस्कृति शीशियों में उन्हें इकट्ठा करने के लिए संभव है कि कर सकते हैंमचान और विच्छेदन के लिए पूर्व pupae लेने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. यह पुरुष पूर्व pupae 35 की पहचान करने के लिए भी संभव है.
भी पहले 18 बताया गया है, जैसा कि हम अलग रोगाणु लाइन अल्सर और संस्कृति में बरकरार पोटा संबंधी वृषण दोनों प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं कि देखा. यह प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता भी औषधीय assays में इस्तेमाल कुछ रासायनिक यौगिकों के लिए पकड़ सकता है. इसलिए, यह ऊष्मायन के दौरान अंधेरे में एक परख की संस्कृति बर्तन रखने के लिए सबसे अच्छा है. विकासशील वृषण और, साथ समय चूक इमेजिंग प्रयोगों की योजना बनाते समय इसी तरह, विशेष रूप से, अलग अल्सर, बहुत लंबी जोखिम बार और / या बहुत उच्च नमूना दर पूर्व vivo विकास को बाधित कर सकते हैं कि मन में रखो. उचित दर नमूना प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए.
संस्कृति बर्तन में बैक्टीरियल और / या फंगल संक्रमण और अधिक विकास के लिए एक गंभीर समस्या बन गया है. भी कई बैक्टीरिया से संक्रमित संस्कृति व्यंजन पूर्व vivo विकास के उद्देश्यों का समर्थन नहीं करतेवृषण और अल्सर की lopment. इसलिए, वर्णित संस्कृति के माध्यम पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (1.1 कदम देखें), लेकिन लंबी अवधि के ऊष्मायन के दौरान होता है, इन एंटीबायोटिक दवाओं अपमानित किया जा सकता है और उनकी गतिविधि कम हो सकता है. यह अस्तित्व के सीमित समय के लिए कारणों में से एक (अधिकतम. 72 घंटे) ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय मनाया सुसंस्कृत अल्सर का हो सकता है. फिर भी इस समय सीमा के बर्तन में संस्कृति के माध्यम से नियमित रूप से प्रतिस्थापन द्वारा नहीं बढ़ाया जा सकता है. हम अन्य कारकों जैसे जननांग पथ के अन्य ऊतकों से विकास संकेतों की कमी के रूप में, संस्कृति में अस्तित्व प्रभावित हो सकता है कि निष्कर्ष है. दूसरी ओर, बाद के meiotic विकास तेज ड्रोसोफिला में स्तनधारियों में से है. ड्रोसोफिला में, spermiogenesis लगभग 90 घंटे लगते हैं, और हिमाचल प्रदेश स्विच अर्धसूत्रीविभाजन 9,12 के बाद 50 और 60 घंटे के बीच होता है. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त लगभग 48 घंटे के सामान्य अस्तित्व के समय विशेष में निर्णायक विकासात्मक प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है,ऐसे meiotic डिवीजनों या हिमाचल प्रदेश स्विच के रूप में rmatogenesis,. बैक्टीरियल या फंगल संदूषण स्वच्छ उपकरण और मीडिया के प्रयोग से बचा जा सकता है, प्रस्तुत प्रोटोकॉल मक्खियों क्योंकि सख्ती से बाँझ काम की स्थिति का उपयोग करना और मानक परिस्थितियों में उठाया जब वृषण पहले से ही बैक्टीरिया होते उड़ नहीं करता है. फिर भी, इस संस्कृति तकनीक के कुछ अनुप्रयोगों विच्छेदित मक्खियों से लाभ हो सकता है या यहां तक कि (प्रोटोकॉल के लिए, 17,36,37 देखें) सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत उठाया.
भेषज assays inhibitors या विभिन्न एंजाइमों की activators के रूप में अभिनय रासायनिक यौगिकों के उपयोग पर निर्भर करते हैं. आमतौर पर इस तरह के प्रयोगों में इस्तेमाल यौगिकों अक्सर अपने लक्ष्य विशिष्टता में व्यापक रूप से भिन्न होते हैं. एक लाभ के रूप में, इस anacardic एसिड बाधा P300 / CBP, PCAF, और टोपी 38 के Myst परिवार के सदस्यों के साथ, उदाहरण के लिए, पूरे एंजाइम वर्गों को लक्षित करने की क्षमता प्रदान करता है. इस के नकारात्मक पक्ष बंद लक्ष्य या साइटोटॉक्सिक प्रभाव induc संभावित हो सकता हैऐसे यौगिकों से एड. इसलिए, पोटा संबंधी वृषण या अल्सर के साथ एक परख में इस्तेमाल प्रत्येक यौगिक अपने cytotoxicity और विभिन्न सांद्रता में विशिष्ट प्रभाव के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. इसके अलावा, संस्कृति की स्थिति, यौगिक एकाग्रता या गतिविधि, और सेल पारगम्यता में बदलाव में मामूली बदलाव प्रेरित प्रभाव की परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, यह एक प्रयोग में इलाज की सफलता पर नजर रखने के लिए आवश्यक है. हम 150 माइक्रोन पर anacardic एसिड का इस्तेमाल किया जब हिस्टोन H4 के एसिटिलीकरण लगातार कमी आई थी, जबकि उदाहरण के लिए, हम, बीच और कभी कभी कुछ वृषण भीतर chromatin संक्षेपण phenotype की ताकत में मामूली परिवर्तनशीलता मनाया.
संस्कृति में ड्रोसोफिला वृषण साथ भेषज assays शुक्राणुजनन 4,12,14,21 के पूर्व और बाद meiotic तंत्र का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह आनुवंशिक उपकरणों के साथ के बाद meiotic शुक्राणुजनन का उपयोग करने के लिए मुश्किल है के बाद से आवश्यक तत्व के साथ खिलाड़ियों को लक्षित करने के लिएएल पूर्व meiotic और meiotic काम करता है, इस पूर्व vivo दृष्टिकोण एक विकल्प का गठन किया. इसके अलावा, सिद्धांत रूप में, विधि समय के साथ इलाज रोगाणु कोशिकाओं के विकास का पालन करने के लिए प्रयोगों का पीछा नाड़ी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि, हम अभी तक इस संभावना का परीक्षण नहीं किया. जल्दी पोटा संबंधी वृषण बनाने के लिए औषधीय assays में एक फायदा है. सबसे पहले, (24 घंटा APF के आसपास) युवा पोटा संबंधी वृषण की पतली बाहरी म्यान रासायनिक यौगिकों के बेहतर पारगम्यता अनुमति दे सकता है. बाद के meiotic हिमाचल प्रदेश स्विच का अध्ययन दूसरा, जब पोटा संबंधी वृषण हिमाचल प्रदेश स्विच प्रभावित था या नहीं का प्रत्यक्ष readout सक्षम protamine-GFP- व्यक्त मक्खी लाइन से 24 घंटा APF में विच्छेदित.
तिथि करने के लिए, ड्रोसोफिला अंगों और वृषण और रोगाणु लाइन अल्सर सहित ऊतकों के पूर्व vivo खेती के लिए कई प्रोटोकॉल (जैसे, 4,14,17,20,39,40 देखें) विकसित किया गया है. खेती मध्यम और प्रयोग सामान्य अनुदेश1979 में स्थापित किए गए थे यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में 17. संस्कृति प्रणाली बाद में वयस्क वृषण 4 से अलग देर के बाद meiotic अल्सर में वैयक्तिकरण तंत्र के vivo इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया गया था. इससे पहले, हम इन शर्तों को भी चारों ओर 48 घंटा 12 के लिए उनके अल्सर में अस्तित्व और meiotic और जल्दी के बाद meiotic रोगाणु कोशिकाओं के भेदभाव का समर्थन करने वाले की सूचना है. अन्य संस्कृति प्रणाली 19 के विपरीत इन संस्कृतियों में मनाया विकास समय (विवरण के लिए, 12 देखें) तय नमूनों से निर्धारित समय से लगभग अनुरूप था. H2AvD-आरएफपी और protamine-GFP प्रतिदीप्ति संकेत संस्कृति में रोगाणु कोशिकाओं के परमाणु आकारिकी और chromatin संरचना कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम संस्कृति में विकास के चरणों की स्पष्ट पहचान के लिए, इस तरह के अल्सर के coiling के रूप में अन्य मापदंड, अधिक लाभप्रद है कि पाया. महत्वपूर्ण बात है, प्रस्तुत प्रोटोकॉल मक्खी ext के अलावा शामिल नहीं करताभ्रूण गोजातीय सीरम के अलावा अन्य ract या अन्य विकास कारकों. इसके अलावा, हम स्थितियों पूर्व vivo संस्कृति में meiotic डिवीजनों के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ संगत कर रहे हैं कि यहाँ दिखा. छवियाँ लंबी अवधि के विकास का समर्थन करता है कि एक आसान करने के लिए उपयोग के माध्यम में उचित संकल्प के साथ प्राप्त किया जा सकता है. इस Voltalef तेल 41,42 में अल्पकालिक (सीए 3 घंटा) टिप्पणियों को सक्षम करने के प्रोटोकॉल के विपरीत है.
खेती और पोटा संबंधी वृषण और एक पुरुष रोगाणु लाइन अल्सर के औषधीय उपचार के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन में शोध किया जा सकता है कि कई आनुवंशिक, epigenetic, जैविक सेल, या विकास संबंधी सवालों को आसानी से निभा रहे हैं. यह रोगाणु लाइन स्टेम सेल पर ध्यान केंद्रित विशेष रूप से अनुसंधान में शामिल हैं. यह सुसंस्कृत वयस्क के लाइव इमेजिंग द्वारा पीछा किया जा सकता है कि स्टेम सेल के विकास 20,43 वृषण दिखाया गया है. हालांकि, परिपक्व वृषण की क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला आंदोलन म्यानज छवि अधिग्रहण के साथ हस्तक्षेप. इसलिए, या तो इमेजिंग खंडित वृषण 43 या प्रदर्शन इमेजिंग प्रयोगों की संख्या खो डेटासेट 20 के लिए खाते में वृद्धि की जानी है का उपयोग किया जाता है. प्रारंभिक पोटा संबंधी वृषण (24 घंटा APF) अभी तक मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ संलग्न नहीं कर रहे हैं. यहां तक कि थोड़ा पुराने वृषण (36-45 घंटा APF) कुछ क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला आंदोलनों दिखाने (चित्रा 3 और पूरक वीडियो 1 तुलना) दिखाई देते हैं. इसलिए, अक्षत अंगों के रूप में युवा पोटा संबंधी वृषण की खेती एक विकल्प के रूप में सेवा कर सके.
इसके अलावा, एक बार, पोटा संबंधी वृषण टुकड़े करने की क्षमता में महारत हासिल है और अंत में पृथक रोगाणु लाइन अल्सर छोटे, सेल आबादी यद्यपि एक सजातीय के एक स्रोत के रूप में एक अल्सर का उपयोग आगे आवेदनों की अनुमति देगा. पहले से ही प्रदर्शन किया गया है के रूप में उदाहरण के लिए, यह, शुक्राणुजनन की परिभाषित चरणों के दौरान विशिष्ट जीन की ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का विश्लेषण करने के लिए RT-qPCR प्रदर्शन करने के लिए इस प्रकार संभव है
Disclosures
लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा हितों की है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
| Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
| Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
| Hoechst | Sigma | B1155 | |
| Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
| Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
| Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
| Stemi SV6 binocular | Zeiss |
References
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