Introduction
Besin ve Toksik maddelerin alımı ve dağıtımı kuvvetle bitki büyümesini etkilemektedir. Buna göre, yatan taşıma süreçlerinin incelenmesi, özellikle beslenme optimizasyonu ve çevresel streslere bağlamlarda, bitki biyolojisi araştırma ve tarımsal bilimler 1,2 önemli bir alanı teşkil (örneğin, tuz stresi, amonyum toksisitesi). Bitkilerde akılarının ölçülmesi için yöntemler arasında baş önemli 1950'lerde geliştirilmiş radyo-izotopik izleyiciler, kullanımı ve günümüzde yaygın olarak kullanılan olmaya devam etmektedir (3, örneğin, bakınız). Bu Mife (akı tahmini iyon mikroelektrot) ve SIET (tarama iyon seçici elektrot tekniği) ve kullanımı gibi dokularda kök orta ve / veya birikim, iyon seçici titreşimli mikroelektrot kullandığı için besin tüketme ölçümü gibi diğer yöntemler, İyon seçici floresanlı boyalar, ayrıca yaygın olarak uygulanır, ancak ağ grip tespit etmek için yetenekleri açısından sınırlıdırxes (örneğin, akışı ve dışarıya akış arasındaki fark). Radyoizotopların kullanılması, diğer taraftan, araştırmacı kinetik parametreleri çözmek için kullanılabilecek tek yönlü akıları izole etmek ve ölçmek için eşsiz bir yeteneği sağlar (örneğin, K, M ve V maks) ve kapasitesi hakkında bilgi sağlar, enerjisi, ulaşım sistemlerinin mekanizmaları ve düzenlenmesi,. Radyo-ile yapılan tek yönlü akış ölçümleri ters yönde akış kadar koşullar altında özellikle yararlı olan, hücre içi ve havuzlarının devir hızla 4'tür. Takip izotop, aynı elemanın diğer bir izotopun bir arka planı görülmektedir çünkü Ayrıca, Radyoaktif yöntemleri, (aşağıda, "Tartışma bakınız) ölçümlerinin bir çok diğer tekniklerin aksine, oldukça yüksek bir substrat konsantrasyonlarında iletilmesine olanak tanımaktadırlar.
Burada, tek yönlü ve n radyoizotopik ölçümü için ayrıntılı adım sağlayansağlam Bitkilerde ve mineral besin tozları ve toksik maddeler. Vurgu akı potasyum (K +) ölçülmesi, bir bitki makro besinin 5 ve amonyak / amonyum yapılacaktır (NH3 / NH4 +), ancak, örneğin, yüksek konsantrasyonlarda (en mevcut olduğu zaman toksik olan başka bir makro besin, 1- 10 mM) 2. Bu radyoizotoplar 42 K + (t 1/2 = 12,36 saat) ve 13 NH 3/13 NH4 + (t 1/2 = 9,98 dakika), sırası ile, bir model sistem arpa sağlam fidelerinde (Hordeum vulgare L. kullanacak .), iki temel protokollerin açıklaması: tracer efflux (CATE) tarafından doğrudan akını (DI) ve kompartman analizi. Biz bu makalede sadece her protokol gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar başından itibaren dikkat etmelisiniz. Her tekniğin uygun, hesaplamalar ve teorinin kısa açıklamalar sağlanan, ancak ayrıntılı edilir Fuarlarımız'S arka plan ve teori konuyla 4,6-9 birkaç önemli makalelerinde bulunabilir. Daha da önemlisi, bu protokoller diğer besin maddeleri / toksik maddelerin analizi akı genel olarak aktarılabileceği (örneğin, 24, Na +, 22, Na +, Rb + '86, 13 NO 3 -) ve diğer bitki türlerine, birkaç uyarılar da olsa (aşağıya bakınız) . Biz de radyoaktif maddeler ile çalışan tüm araştırmacıların kurumun iyonizan radyasyon güvenliği regülatörü ile düzenlenmiş bir lisans altında çalışması gerekir önemini vurguluyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bitki Kültürü ve Hazırlık
- (Ayrıntılar için, 10'a bakınız) iklim-kontrollü bir büyüme odasında 7 gün boyunca arpa fide hidroponokal büyütün.
NOT: Bu besin gereksinimleri yaş değişecek gibi, gelişim aşamaları çeşitli tesislerini inceleyerek dikkate almak önemlidir. - Bir gün deney öncesinde, tek bir çoğaltılmasına (DI için paket başına 3 bitkiler, Cate için paket başına 6 bitkiler) yapmak için birlikte birkaç fidan paket. Sürgünlerin taban kısmı etrafında Tygon hortumunun bir 2 cm'lik bir parça sararak ve bir "yaka" oluşturmak için bant ile boru sabitlenmesiyle Paketi fideleri.
NOT: Deste başına bitki sayısı deneysel koşullar 10,13,14 göre değişebilir. Bohçalama kök kütlesi ve / veya spesifik aktivite düşük, özellikle istatistik ve ölçüm doğruluğunu iyileştirmek için yapılır.
Deneysel Çözümleri / Malzemelerin 2. Hazırlık
içerik "> Not: Aşağıdaki tipik deney öncesinde 1 gün yapılır.- Ve bitki materyali ve spesifik aktivite [S o için numune şişelere ((bitki örneklerinin spin-kurutma için), santrifüj tüpleri (11 ayrıntılar için bkz) Pre-etiketleme, etiketleme ve desorpsiyon çözümleri;: DI için aşağıdaki toplamak aşağıya bakınız]). Havalandırır ve tüm çözümleri karıştırın.
- , (10 ayrıntılar için bkz) elüsyonların, bitki örnekleri için akış huniler, (bitki örneklerinin spin-kurutma için) santrifüj tüpleri ve numune şişeleri (Eh-karışık, gazlı etiketleme ve elüsyon çözümleri ve: Cate için aşağıdaki toplamak S o ve seyreltme faktörü belirlenmesi [D f; aşağıya bakınız]).
3. radyotracer hazırlayın
DİKKAT: Aşağıdaki güvenlik adımlar radyoaktivite ile çalışma öncesinde alınmalıdır.
- Emin olun Radioac gereksinimleritif malzemeler lisans anlaşılır ve takip edilmektedir. Uygun güvenlik donanımları (yani, gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, kurşun yelek / yaka) ve Dozimetreleri (örneğin, TLD halka ve rozet) giyin. Koruyucu Set up (yani, pleksiglas ve kurşun tuğla) ve bunun arkasında radyoaktif çalışmayı gerçekleştirmek. Geiger-Müller sayacı rutin kontaminasyon izlemek için mevcut olduğundan emin olun.
- 42 K + hazırlanması
- Dengesi üzerinde temiz, kuru bir behere koyun. Dengesini sıfır.
- Ambalajından (toz halinde 42 K 2 CO 3 20 mCi) izleyicinin şişesini çıkarın ve beher içine izleyici dökün. Kitle not alın.
- Beher içine H 2 SO4, 0.07 ml, ardından dH 2 O Pipet 19.93 mi,. Bu aşağıdaki kimyasal reaksiyonu izlerler:
42 K 2 CO 3 (S) + H 2 SO 4 (l) + H 2 O (l) 42 → 2> kadar SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l) - K 2 CO 3 kütlesini ve moleküler ağırlık verilen radyoaktif stok çözeltisinin konsantrasyonu, ve hacim (20 mi) hesaplayın.
NOT: 13 NH 3/13 NH4 + İzleyici suyun oksijen atomunun proton bombardımanı yoluyla bir siklotron üretilir çalışma halinde (tipik olarak 100-200 mCi faaliyet ile sonuçlanan, üretim detayları için, 12 bakınız). 14. NH 3/14 NH4 + 'nın miktarı, bu çözeltiler içinde son derece düşük olup, stok çözeltisi N içeriği ihmal edilebilir.
4. Doğrudan Akın (DI) Ölçüm
- 42 K + için, etiketleme çözeltisi içine K + arzu edilen nihai konsantrasyonuna ulaşmak için gereken radyoaktif stok çözeltisi miktarı pipetle.
- NH 3/13 13 için NH 4 +, pipet etiketleme çözümü içine küçük bir miktar (<0.5 ml). Etiketleme çözümü (havalandırması yoluyla) iyice karıştırmak için izin verin.
- Bir numune şişesi içine etiketleme çözeltisi, 1 ml alt-örnek pipet ve (toplam 4 örnekleri) ile üç kez tekrarlayın.
- Bir gamma sayacı kullanılarak, ("dakika başına sayımları", cpm olarak) şişelere radyoaktivite ölçülür. (Bu gibi kısa ömürlü izleyiciler için özellikle önemlidir) sayaç cpm okumaları izotop çürüme için düzeltilmiştir şekilde programlanmış olduğundan emin olun.
- Dört numune sayımları (CPM mi-1) ortalama ve (umol mi -1) çözeltisi içinde alt-tabaka konsantrasyonu ile bölmek suretiyle (CPM umol -1 olarak ifade edilen) sO hesaplayın.
- (Bakınız test koşulları altında bitkiler önceden dengeye gelmesi, 5 dakika boyunca ön-etiketlenmesi (radyoaktif olmayan) çözelti içinde kökleri daldırınÖrneğin, ön etiket zamanlı olarak varyasyonlar için 10,13,14).
- 5 dakika için etiketleme (radyoaktif) çözümü kökleri daldırın.
NOT: Etiketleme kez deney 3,4,7-10 göre değişiklik gösterebilir. - Yüzey-yapışan radyoaktivite uzaklaştırılması için, 5 saniye boyunca yayılım çözeltisine kökleri aktarın. Hücre dışı izleyici daha açık köklerine 5 dakika boyunca desorpsiyon çözeltisinden oluşan ikinci bir kap içine aktarın kökleri.
- Ayrı sürgünler, bazal sürgünler ve kökler incelemek ve.
- Düşük hızda 30 saniye boyunca santrifüj tüplerine kökleri ve spin örnekleri yerleştirin, klinik dereceli santrifüj (~ 5.000 xg) yüzeyini ve interstisyel su çıkarmak için.
- Kökleri (taze ağırlık, FW) tartılır.
- Bitki örneklerinde radyoaktivite sayımı (ateş, bazal sürgün ve kök; adım 4.2.1).
- Akı hesaplayın. Aşağıdaki formül kullanılarak bitki içerisine akışını hesaplamak
Φ = Q * / S o ağırlık L
burada Φ akısı(Ľmol g -1 saat -1), Q * dokusunda biriken zerresinin miktarı (genellikle kök, sürgün, kopyaya, ve, kombine bazal sürgün), S o etiketleme çözümü (CPM ľmol spesifik aktivite - 1) w kök taze ağırlığı (g) 'dir ve t L etiketleme süresi (saat)' dir.
NOT: Daha sofistike hesaplama Cate elde parametrelere dayalı, etiketleme ve desorpsiyon sırasında köklerinden eşzamanlı izleyici akışı için hesap yapılabilir (, ayrıntılar için, 4 görmek aşağıya bakın).
Tracer efflux (CATE) Ölçümü ile 5. komparmantal Analizi
- Etiketleme çözümü ve ölçü S o (- Yukarıdaki, 4.2 adımları 4.1) hazırlayın.
- Seyreltme faktörü (D f) ölçün.
Not: Genellikle, gama sayacında detektöre örnek nisbetle pozisyonu miktarını etkileyebilirradyasyon ölçülür. Ayrıntılar için tartışma bakın.- SO ölçüldükten sonra, her bir örnek için H 2 O 19 ml ilave (örneğin, bu son hacim = yıkama sıvısı hacmi = 20 ml) eklenmiştir. Her 20 ml numune radyoaktiviteyi sayın (adım 4.2.1).
- 20 ml'lik numunelerin ortalama cpm olarak 1 mL'lik numunelerin ortalama cpm bölünmesiyle D F hesaplayın.
- 1 saat etiketleme çözümü kökleri daldırın.
- Tüm kök malzeme huni dahilinde sağlanması, huni akıttığı etiketleme çözümü ve transfer bitkilerden bitkileri çıkarın. Plastik yaka üzerine bant küçük bir şerit uygulayarak akış hunisi tarafına yavaşça güvenli bitkiler.
- Yavaşça huni içine ilk eluatın dökün. Sayacını başlatmak (yukarı sayma).
- Musluğunu açın ve 15 sn sonra numune şişesine eluatın toplamak (not: yıkama süresi değişir; aşağıya bakınız). Musluğunu kapatın. Yavaşça hunisi içine bir sonraki eluatın dökün.
- Repeaİlk elde edilen nihai eluatına, aşağıdaki yıkama seri, geri kalan kısmı için bir adım 5.6 T: 15 saniye ile (dört kez), 20 saniye (üç kez), 30 saniye için (iki defa), 40 saniye (bir defa), 50 saniye (bir defa), 29.5 dakikalık bir elüsyon süresi toplam 1 dakika (25 kez),
NOT: Sızdırma serisi deneysel koşullar 7-10,13,14 göre değişiklik gösterebilir. - Yıkama protokolü tamamlandıktan sonra, bitkiler hasat (- yukarıda 4.8, 4.6 adım).
- (5.2, M f her elüatın için okuma çarpılması) gama sayacında yıkama sıvılarından ve bitki örneklerinde radyoaktivite sayısı.
- Yıkama süresinin bir fonksiyonu olarak Arsa izleme atışının (cpm gr (kök FW) -1 dk -1). Kararlı durum koşulları için, doğrusal gerileme ve akılarının hesaplamaları, döviz yarılanma ömürleri ve havuz boyutları (detaylar için, 6-9 bakınız) gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 yüksek yetiştirilen sağlam arpa fidelerinin köklerine NH 3 akını (13 N) DI tekniği kullanılarak bulundu izotermlerini gösterir (10 mM) NH 4 + ve ya (0.02 mM), düşük veya yüksek (5 mM ) K +. (, Çözelti pH 13 değişim ile ayarlanır [NH3] dahili) NH3 tozlar dış NH3 konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak grafiğe zaman izotermleri Michaelis-Menten kinetiğine gösterir. NH 3 tozları yüksek K + olarak daha düşük K + anlamlı derecede daha yüksekti. Michaelis-Menten kinetik parametrelerinin analizi V maks kuvvetli yüksek K + (205 genel azalır ise K E, K + seviyelerinin (sırasıyla düşük ve yüksek K +, 150 genel 90 μ M) arasında göreli olarak sabit kaldığını göstermiştir 80 ľmol g -1 saat -1). Sonuç olarak, veriler göstermektedir ki K + seviye düzenleyici bires azot taşıma (V max etkisi), fakat taşıyıcılarının bağlanma yerleri için K + ve NH 3 ile doğrudan rekabet (K M etkisi) tarafından. Bunun yerine, K + (ayrıntılar için, bakınız 13) NH bu aquaporin faaliyetinin modülasyonu vasıtasıyla gibi başka araçlar ile 3 akıları, düzenleyebilir.
DI bağlı beslenme değişikliklere de akışı nispeten hızlı değişikliklerin çekimi için yararlıdır, veya farmakolojik ajanların tatbiki ile ilgilidir. Örneğin, Şekil 2 özeti -K + (0.1 mM), orta ve yüksek (10 mm) yetiştirilen sağlam arpa fidelerinin kökleri olan K + -uptake sisteminin hızlı plastisite NH + 4 koşulları. Burada, biz dış çözüm NH 4 + cayma 5 dakika içinde K + akını bir ~ 350% artış gözlenmiştir. Bu "amonyum çekme etkisi" ("havada") + K duyarlı olduğu bulunmuştur +), baryum (Ba 2 +) ve sezyum (Cs +) için. Birkaç Arabidopsis genotipleri DI ve elektrofizyolojik ölçümleri kullanılarak, biz başardık kesin Arabidopsis K + kanalı, AtAKT1 ve yüksek afinite K + taşıyıcısı, AtHAK5 14 faaliyetlerde değişikliklere AWE'yi büyük çoğunluğu atfetmek.
Şekil 3, düşük araziler (0.1 mM), K + ve (1 mM), orta yetiştirilen önceden etiketlenmiş arpa fidelerin kökleri zamanla 42 K + kararlı hal akış, NO 3 -. Bu izler CATE yöntemi, çeşitli farmakolojik / besin maddelerinin uygulanması üzerine akışındaki hızlı ve önemli değişimler ortaya nasıl gösterir. K + akışını önemli, ani inhibisyon 10 mM Cs +,, K + kanal blokeri ya da keskin bir artış ya da bir uygulama üzerine gözlenmiştir(0.1 ila 10 mM) bir K + karşılığı. Bu sonuçlar, K + kanalları 15 dışa giderilmesi benzersiz yolluk özelliklerini tanımlayan moleküler çalışmalar ile uyumludur. Bunun aksine, 10 mM NH4 uygulama hızlı ve güçlü bir K + akışını uyarılan +. Bu etki, NH + 17 4 verilmesiyle ortaya bilinmektedir kök hücrelerin 16, plazma zarı boyunca elektrik potansiyel gradyan ile dışa doğru depolorizasyonun-doğrulan bir K + kanallarının aktivasyonu ile açıklanabilir. Bu nedenle, bu yöntem kullanılarak, burada K + kanalları arpa 10 köklerinin K + akışını aracılık ettiğini, in planta, göstermek mümkün olmuştur.
Son olarak, Tablo 1 42 K + effluks ([K +] har = 0.1 mM) arpa tohumu Kararlı devlet ölçümlerden çıkartılan CATE parametreleri gösterirya da 10 mM NH 4 +, ikinci bir toksik senaryo temsil eden - lings ya 1 mM NO 3 büyüdü. Yüksek NH 4 + durumu tüm K + akılarının bir bastırma ve sitozolik K + konsantrasyonunda önemli bir düşüş getiriyor ([K +] cyt) gözlemlediği gibi normal homeostatically (sağlıklı büyüme koşulları altında 18 ~ 100 mM tutulur, örneğin, Tablo 1, NO 3 altında - arz).
Şekil 1. 13 NH 3 akını izotermleri K + kaynağı azot naklini düzenleyen nasıl ortaya. NH 3 akını NH dış farklı konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak 4 + ve (kırmızı 0.02 mM) düşük ya da (mavi, 5 mM) yüksek ya K + yüksek (10 mM) NH 3 yetiştirilen arpa fidelerinin sağlam kökleri> 3 ([NH 3] dahili). Michaelis-Menten yüksek K + hüküm NH 3 -uptake nakil substrat afinite (yani, K M) üzerinde nispeten daha az etkisi vardır, ancak önemli ölçüde (yani, V max taşıma kapasitesini azalttığını ortaya izotermlerinin analizleri; Temsilcisi sonuçlarını görmek '). Henderson-Hasselbalch denklemine göre, NH 4 + oranları: Not, [NH 3] ext değişiklikler dolayısıyla NH 3 NaOH ile harici bir çözüm pH kaydırarak tarafından kurulan ve edildi. Hata çubukları SEM'i 4-7 çoğaltır göstermektedir. (Coşkun ve ark çoğaltılmıştır. Beyhude transmembran bisiklet Rapid amonyak gaz taşıma hesapları NH altında bitki kökleri 3 / NH 4 + toksisite. Bitki Fizyolojisi. 163, 1859-1867 (2013).)
Şekil 2. NH 4 + çekilme önemli ölçüde düşük (0.1 mM), K + ve yüksek yetiştirilen sağlam arpa fidelerinin kökleri, kararlı durumda. K + akını kanal-aracılı K + akını uyarır ve NH 4 + geri çekilmesi üzerine (10 mM) NH4 +. Uyarılan K + influks üzerindeki K + kanalı blokerleri (10 mM TEA ile + 5 mM Ba2 +, ve 10 mM Cs +) için etkisi barizdir. Tek yönlü ANOVA ile Dunnett çoklu karşılaştırma post-hoc; Yıldız * 0.01 <p <0.05, *** p <0.001 -NH 4 + ve tedavi çiftleri arasında (önemi farklı düzeylerde ifadetesti). Parantez içinde Yıldız kontrolü ve -NH 4 + çiftinin (Student t-testi) arasındaki anlamlılık düzeyini göstermektedir. Hata çubukları> 4 tekrardan SEM göstermektedir. (Arpa ve Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013) köklerinde Coşkun ve ark. Kapasite ve potasyum kanalları ve yüksek afinite TaĢıyıcıların plastisitesindeki çoaltilmitir.)
Şekil 3. K + akış kanal-aracılıklı düşük K + koşullar altında, kararlı-durum (1 mM), düşük (0.1 mM), K + ve orta yetiştirilen sağlam arpa fidelerinin köklerinde 42 K + akışını NO 3 -. Ve (t = 15.5 dak; ok bakınız) ani etkiler 10 mM CsCl, 5 mM K 2 SO4 ve 5 mM (NH4) akışındaki 2 SO4. Her bir arsa 3-13 tekrarlanmış (SEM <ortalamanın% 15) ortalamasını temsil etmektedir. (. Coşkun ve ark Düzenleme ve arpa kökleri potasyum salınımının mekanizması çoaltilmitir:. Planta'daki bir 42 K + analiz Yeni fitol 188, 1028-1038 (2010).).
| [K +] dahili | N kaynağı | Akını | Efflux | Net Akı | E: Ben Oranı | Havuz Boyutu | Half-life |
| (MM olarak) | (Ľmol g -1 saat -1) | (MM olarak) | (Dakika) | ||||
| 0.1 | 1 NO 3 - | 7.22 ± 0.23 | 1.86 ± 0.18 | 5.36 ± 0.18 | 0.25 ± 0.02 | 98.84 ± 14.08 | 28.18 ± 3.40 |
| 10 NH 4 + | 1.89 ± 0.13 | 0.57 ± 0.05 | 1.32 ± 0.10 | 0.30 ± 0.01 | 28.39 ± 3.40 | 32.50 ± 4.69 | |
Tablo 1. Kararlı durum K + akışı ve cÇeşitli N hükümleri uyarınca ompartmentation kalıcıdurum akı ve 0.1 mM K + yetiştirilen arpa fidelerinin kompartman analizi ve ya orta NO 3 -. (1 mM, Ca 2 + tuz gibi) veya yüksek NH 4 + (10 mM, SO 4 2-tuzu). Hatalar> 8 tekrardan ± SEM göstermektedir. 1028-1038 (2010, 188 planta'daki bir 42 K + analiz Yeni fitol) ve Coşkun ve ark Kapasitesi ve potasyum kanallarının ve plastisite yüksek.:.. (Coşkun ve ark Düzenleme ve arpa kökleri potasyum salınımının mekanizması yeniden basılmıştır. arpa ve Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013) köklerinde afinite taşıyıcıları.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki örneklerde gösterildiği gibi, yöntem, in planta Radyoaktif besin ve toksik maddelerin tek yönlü akıyı ölçen bir güçlü bir araçtır. 1 NH3 akışı, belki de bir 225 umol g-1 st -1, aşan ulaşabileceği göstermektedir En iyi niyetli transmembran akı Hiç bir bitki sisteminde 13 bildirilmiştir, ancak net tozları ölçüldü, bu akının büyüklüğü görünür olmaz. NH3 büyük bir akış etiketleme süresi 13 artar girişinin belirgin bir tahminlerin neden olabilir sonuçsuz bir bisiklet senaryosunda, akını aynı anda gerçekleşir olmasıdır. , 13 N hem girişini ve dışarı akış elektrofizyolojik analizi ile izleme tekniği takviye ederek, Şekil 1 'deki koşullar altında olduğunu göstermek mümkün öncelikle nötr gaz NH3 verilmiş olup bunun conjug bölgesinin+ (Ayrıntılar için, 13 bakınız) asit NH 4 yedik. Bu kökler hızlı NH 3 gaz akılarının planta gösteriye ilk ve gibi, yüksek bitkilerde 2,13 nh / NH 4 + toksisite 3 kalbinde yatıyor aktarım mekanizmasını çözülüyor yolunda önemli ön kanıtlar sağlar. Heterolog ekspresyon sistemleri içinde moleküler çalışma NH3 ilaçla kanıtlar ile birlikte, Şekil 1 bitkilerin 19 ve verilerin su kanallarının üzerinden akabilir göstermiştir, faal organizma üzerindeki 13 seviyesinde bu bulguları teyit başlamıştır.
Şekil 2 ve 3 de radyo-ile tek yönlü cereyanları ölçme programı mükemmel örnekler sunmak. 42 K + ile DI kullanarak, + kanalları kararlı durumda K sorumlu olmadığını iyonu göstermek başardık Arabidopsis 14 aksine, düşük K + ve yüksek NH4 + yetiştirilen arpa fidelerinin köklerinde alımı. NH 4 + çekildi yalnızca biz K + kanallarının nişan (Şekil 2) için kanıt gördün. (Artan doku K + içeriği 14 ile gösterildiği gibi), K + net akısı NH4 + çekilmesi ile uyarılır, ancak tek-yönlü akışının ölçülmesi ancak biz mümkün bu fenomenin büyüklüğü ve süratli bir şekilde başlatılmasını göstermektedir idi. Ayrıca, mutantlar ve farmakolojik ajanlar ile DI ölçümleri yaparak, biz dahil olduğu taşıyıcı proteinler tespit başardık. Benzer şekilde, izleyici akışını izlerken (Şekil 3) beslenme ve farmakolojik ajanlar uygulayarak, biz karakterize ve arpa kök hücrelerden 10 K + effluks'un mekanizmaları tanımlamak başardık. Örneğin, di Böylece, teknikve CATE kritik bir makro besinin için taşıma özelliklerinin anlaşılmasına vesile olabilir.
Protokolde belirtildiği gibi, genellikle gama sayacında detektöre örnek nisbetle pozisyonu ölçülen radyasyon miktarını etkileyebilir. 1 ml'lik bir örnek, H2O ile 19 ml "tepesinde" olması halinde,, 20 ml bir numunede (CPM) sayım ölçülen aynı miktarda olmasına rağmen, 1 ml numune içinde önemli ölçüde daha düşük olabilir, radyoişaretleyicinin. Bu nedenle, bir D F radyoaktivite bu bariz 'seyreltme' düzeltmek için uygulanabilir. Bu sorun genellikle açıkça algılama enstrümantasyon üreticileri tarafından ifade değildir ve bireysel araştırmacı tarafından gerekli çalışmalar yapılmalıdır. Benzer şekilde, (sayaç içinde yakındaki örneklerden yani) ortam radyasyonuna karşı dedektör içindeki koruyucu etkinliği üreticileri tarafından abartılı olabilir, ve bu tür konular çalışmış olmalıdırBireysel ölçüm sistemleri için dışarı.
Izleyici tekniğin önemli bir avantajı kararlı durum koşulları altında, cereyanlar, hücre içi havuz boyutları ve döviz kurları ölçmek için bir araç sağlar onun non-invaziv, olduğunu. Örneğin, Cate ile, non-invaziv, K + (Tablo 1) sitozolik konsantrasyonlarını ölçmek olabilir. Bu durum, hücrenin fiziksel ve muhtemelen kimyasal bozuklukları kazandıran iyon seçici mikro elektrod 18, hücrelerin ve saplanma, alternatif yöntemlere tercih edilebilir. Buna ek olarak, izleyici tekniği bütün organların ve sağlam bitkiler için eritici ve bölümlendirme kapsamlı bir görünümünü sağlar eşsizdir. Bu, sonuçta sahada performansı bir bütün bitki besin dinamikleri, toksisitesini anlamak isteyen varsa önemlidir ve. Son olarak, Radyoaktif yöntem çok hassas ölçümler oldukça yüksek bir substrat konsantrasyonları altında yapılmasını sağlar. Tradiarası tükenmesi deneyler ve mikroelektrot arka planında müdahale durumunu ortaya deneyim ve böylece, söz konusu alt-tabakanın dış konsantrasyonunun, büyüme sırasında koşulla ki, altına indirilir gerektirebilir. Bu (yukarıda gördüğümüz başta NH 3 / NH 4 + toksisite ya da "yüksek-K +" koşulları gibi) bir yüksek substrat konsantrasyonlarında "kararlı durum" koşullarını okuyan ilgilenen varsa sorunlu olabilir.
Tüm teknikler gibi, radyo-ile akıyı ölçen sınırlamalar olmadan değil, dikkat edilmelidir. Örneğin, radyo-mevcudiyeti, özellikle böyle bir siklotron gibi bir üretim tesisine yakın gerektiren 13 N gibi çok kısa ömürlü izotopları için, sorunlu olabilir. Bir başka önemli bir sınırlama zamanlarda, bu zarların üzerinden meydana gelmekte ve bu tozlar meydana gelen bir ekstrasellüler ayırt etmek zor olabilir olduğunulularly. Böyle ayrımlar titiz faz 7,10,20 test için arayın. K + effluks'un durumunda, sadece dikkatli incelemelerden sonra köklerinden 42 K + bırakma yüksek hücre zarlarından değildi meydana ki kararlı durumunu doğrulamak için biz başardık [K +] ext (> 1 mM) 10, ama ekstraselü- gelen alanlarda (cf, Şekil 3). Bu tür konular farmakolojik ajanların geniş bir yelpazede etkisini inceleyerek çözülebilir, ya da tuzlu koşullar altında bildirilen çok yüksek Na + tozları onlar hücre zarlarından devam edildi enerjik olanaksız olurdu örneğin göstermiştir termodinamik analizler, yoluyla 21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. Lüttge, U., >Pitman, M. .G. 2 Part A, Springer. Berlin. (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots - A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Maathuis, F. .J. .M. ., Volume 953, Springer. 161-170 (2013).
- Meeks, J. C. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. Knowles, R. ,, Blackburn, T. .H. , Academic Press. 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
